Voorbereiding en toepassing van een nieuwe bacteriële biosensor voor de vermoedelijke detectie van schot residu

Dit protocol beschrijft de voorbereiding en analyse van een unieke biosensor die is ontworpen om de chemische componenten van kruitresten te detecteren. Het gebruik van biosensoren voor forensische toepassingen is uniek. Het vertegenwoordigt een low-cost, eenvoudig te gebruiken alternatief voor de zeer gespecialiseerde instrumentatie meestal gebruikt in forensische laboratoria.

De synthetische biologie methoden beschreven kan worden gebruikt voor elk systeem dat standaard synthetische biologie onderdelen gebruikt. De beschreven chemische analyse is van toepassing op elke biosensor die rood fluorescerend eiwit uitdrukt. Demonstreren van de procedure zal Andrea Soles en Elle Richardson, undergraduate studenten aan de Longwood University.

Om deze procedure te beginnen, voeg tien microliters van de eerder geïsoleerde J10060 plasmide DNA toe aan een microcentrifugebuis. Voeg acht microliter water, en een microliter van elk van de EcoRI en NHEL enzymen voorgemixt met een microliter van buffer. Voor de promotor DNA, voeg tien microliters van geannealed promotor DNA sequenties aan een verse microcentrifuge buis.

Voeg acht microliter water, en een microliter van elk van de EcoRI en NHEL enzymen voorgemixt met een microliter van buffer. Met behulp van een pipet ingesteld op tien microliters, voorzichtig pipette de monsters op en neer te mengen. Incubeer de monsters op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Verwarm en activeer de enzymen vervolgens gedurende vijf minuten bij 80 graden Celsius. Bewaar het verteerde DNA in een vriezer tot het klaar is om verder te gaan. Gebruik eerst het plasmide en promotor-DNA dat eerder werd verteerd om de reactie op te zetten in een microcetrifugebuis op ijs, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol.

Zorg ervoor dat de T4 DNA Ligase als laatste wordt toegevoegd. Pipet op en neer zachtjes om de reactie te mengen, en centrifuge kort. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende tien minuten.

Verwarm en activeer vervolgens gedurende tien minuten bij 65 graden Celsius. Voer de transformatie uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel eerst de reactiemengsels voor PCR in, zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol.

Voorzichtig pipette op en neer om de reacties te mengen. Schraap met een gele pipetpunt een kolonie van de getransformeerde E.coli. Breng een veeg van deze E.coli over op een nieuwe LB-ampicilline agarplaat die is afgesneden en steek vervolgens de pipettepunt in de PCR-buis.

Schud de pipettip om de E.Coli te mengen met de PCR mix. Herhaal dit proces nog drie keer voor extra kolonies. Laad vervolgens de PCR-buizen in een PCR-machine en begin met thermocycling zoals beschreven in tabel drie van het tekstprotocol.

Om te beginnen met het labelen van het juiste aantal steriele kweekbuizen zoals beschreven in tabel vier van het tekstprotocol. Voeg twee milliliter van de bereide kweekbouillon toe aan elke buis. Voeg de anilietvoorraadoplossing toe aan de buizen zoals beschreven in tabel vier.

Plaats vervolgens de snap caps op de kweekbuizen, zodat ze los zijn om de luchtstroom in de buis mogelijk te maken. Vortex elke cultuurbuis. Plaats de buizen hierna in een schuddende couveuse bij 37 graden Celsius en bij 220 rpm gedurende ten minste 24 uur.

Gebruik eerst een op ethanol gebaseerde veeg die is ontworpen voor het verwijderen van lood om alle oppervlakken van de handen af te vegen, inclusief tussen de vingers. Bewaar de doekjes in een op de juiste manier gelabeld afsluitbaar zakje tot de analyse. Gebruik een op alcohol gebaseerde veeg om alle grote oppervlakken af te vegen die moeten worden getest.

Gebruik een katoenen swap bevochtigd met ethanol om eventuele kleine oppervlakken af te vegen die moeten worden getest. Het dragen van schone handschoenen en met behulp van een schaar die zijn gereinigd met alcohol, snijd een sectie die ongeveer een vierkante centimeter uit het midden van de doekje. Plaats vervolgens het gesneden stuk doekje, of wattenstaafje, direct in een kweekbuis met twee milliliters van de sensorbacteriën en zorg ervoor dat het volledig in de bouillon wordt ondergedompeld.

Bereid de spectrometer voor om fluorescerende onderwerping te verzamelen op de juiste golflengte voor de RFP-variant, met een excitatiegolflengte van 500 nanometer. Gebruik vervolgens een vortexmixer om de buizen te schudden. Breng elke supernatant voorzichtig over op een cuvette met een laag volume en verzamel de emissie-intensiteit.

Met behulp van een vortex mixer, schud de buizen. Breng 200 microliter van de bouillon over naar een put in de putplaat. Noteren welke monsters ging in elke put van deze plaat.

Stel de flourometer in om de emissie-intensiteit te verzamelen op de juiste golflengte voor de RFP-variant. De fluorescentie spectra voor een representatieve RFP variant toont zowel de negatieve controle en de spectra op twee verschillende niveaus van aniliet toegevoegd. Het maximale fluorescerende signaal voor de RFP-variant die in dit werk wordt gebruikt, wordt waargenomen op 575 nanometer.

Representatieve gegevens worden verzameld voor dezelfde set oplossingen, zowel van de draagbare spectrometer als de fluorometer. Er is een algemene trend van de fluorescentie toeneemt naarmate de concentratie aniliet toeneemt. Het is vermeldenswaard dat bij hoge concentraties, meer dan ongeveer 800 delen per miljard voor de loodsensor, de respons daalt als gevolg van de toxiciteit van lood bij zo'n hoge concentratie.

Analyse van ethanol wattenstaafje monsters van de binnenkant van een gebruikte 40 kaliber cartridge behuizing levert het bewijs van de belangrijkste resultaten. De positieve resultaten van elk van de drie sensorbacteriën wijzen op een positieve test op kruitresten. De biosensoren die in dit protocol worden bereid, kunnen ook individueel worden gebruikt om verontreiniging in voedsel-, water- of milieumonsters op te sporen.

Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om biosensoren te ontwikkelen met behulp van standaard synthetische biologie technieken voor een verscheidenheid van verschillende chemische anilites. Persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen en analisten moeten de handen wassen en oppervlakken ontsmetten na het hanteren van E.coli. Afvalstoffen moeten automatisch worden gehakt en afval dat zwaar metaal bevat, moet dienovereenkomstig worden behandeld.