Name: Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Ontdek hoe homodimerische PROTACs de E3 ubiquitine ligase Cereblon (CRBN) chemisch inactiveren via ubiquitinatie en degradatie. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van eiwitten die eerder als onvolgbaar golden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether programma KR-3886/2-1 en SFB-1074 tot J.K.; FOR2372 naar M.G.)

1. bereiding van PROTAC moleculen
Let op: Raadpleeg voor gebruik alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSD'S). Een aantal van de chemicaliën die in deze syntheses worden gebruikt, zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen.
<ol><li>Bereiding van tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 1)
	<ol>
<li>Voeg 1, 1 '-carbonyldiimidazol (1,95 g, 12 mmol) en een katalytisch bedrag van 4-(Dimethylamino) pyridine (5 mg) aan een mengsel van BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 mL) in 100 mL ronde bodem kolf met roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm tijdens het roeren gedurende 10 uur totdat er een heldere oplossing wordt gevormd.</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel onder verminderde druk met een roterende verdamper, voeg EtOAc (200 mL) toe en breng het over in een scheitrechter. Was de organische laag met H2O (50 ml) en pekel (50 ml) en droog hem over na2dus4.</li>
		<li>Filtreer de oplossing door een korte pad silicagel (5 cm diameter en 5 cm hoogte) en eluaat met een verder volume (200 mL) van EtOAc.</li>
		<li>Damp het oplosmiddel in en droog het verkregen kleurloze vaste stof in vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van tert-butyl N-(1-methyl-2, 6-dioxo-3-piperidyl) carbamaat (samenstelling 2)
	<ol>
<li>Combineer compound 1 (2,28 g, 10 mmol) met gemalen Kaliumcarbonaat (2,76 g, 20 mmol) en DMF (25 ml) in een rondbodemkolf van 100 ml. Voeg met behulp van een spuit iodomethane (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) toe en rust de kolf uit met een geperforeerde rubberen septum. Plaats het reactievat in een bad met ultrasone trillingen voor 2 uur.</li>
		<li>Verdun het reactiemengsel met EtOAc (100 mL) en breng het over in een separatoire trechter. Was de organische laag met 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml) en pekel (25 ml), en droog hem over na2dus4.</li>
		<li>Filter en damp het oplosmiddel in. Reinig het product per Kolomchromatografie over silicagel (kolom diameter 6 cm en 20 cm hoogte) met behulp van petroleumether/EtOAc (2:1).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van 2-(2, 6-dioxopiperidin-3-yl) 4-fluoroisoindoline-1, 3-dione (Compound 3)
	<ol>
<li>Combineer 3-fluorophthalic anhydride (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) en een oplossing van natriumacetaat (0,50 g, 6,0 mmol) in ijsazijn (20 ml) in een rondbodemkolf van 50 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm het mengsel bij 120 °C gedurende 6 uur.</li>
		<li>Giet na het afkoelen het paarse mengsel op H2o (100 ml) en roer gedurende 10 min. Verzamel de gevormde vaste stof door filtratie, was met h2o (3 × 5 ml) en petroleumether (3 × 5 ml) en droog in vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van 4-Fluoro-2-(1-methyl-2, 6-dioxopiperidin-3-yl) isoindoline-1, 3-dione (Compound 4)
	<ol>
<li>Combineer 3-fluorophthalic anhydride (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) en een oplossing van natriumacetaat (0,50 g, 6,0 mmol) in ijsazijn (20 ml) in een rondbodemkolf van 100 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm het mengsel bij 120 °C gedurende 6 uur.</li>
		<li>Giet na het afkoelen het paarse mengsel op H2o (100 ml) en roer gedurende 10 min. Verzamel de gevormde vaste stof door filtratie, was met h2o (3 × 5 ml) en petroleumether (3 × 5 ml) en droog in vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van tert-butyl N-[2-[2-[2-[[2-] (2, 6-dioxo-3-piperidyl)-1, 3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] ethoxy] ethoxy] ethyl] carbamaat (samenstelling 7)
	<ol>
<li>Laad een ronde bodem kolf van 50 mL met tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl] carbamaat (5, 0,41 g, 1,65 mmol), samenstelling 3 (0,41 g, 1,50 mmol), droge DMF (10 ml) en Dierwt (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Uitrusten met een roer stang en een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 10 uur.</li>
		<li>Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met H2O (50 ml) en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter, en concentraat in vacuo.</li>
		<li>Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 60 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:1 tot 1:2).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van homodimeer (compound 8)
	<ol>
<li>Combineer de α, ω-diamine linker 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dierwt (1,05 ml, 6,00 mmol) en een oplossing van 3 (0,83 g, 3,00 MMOL) in droge DMSO (20 ml) in een ronde bodem kolf van 50 ml met een roer stang en voorzien van een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 18 uur.</li>
		<li>Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met H2O (50 ml) en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter en concentraat in vacuuem.
</li>
		<li>Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 50 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:2) naar EtOAc.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van heterodimer (compound 9)
	<ol>
<li>Los samengestelde 7 (0,83 g, 1,65 mmol) op in droge l2cl2 (10 ml). Voeg trifluorazijnzuur (10 mL) toe en roer het gele mengsel bij 40 °C gedurende 2 uur in een gesloten ronde bodem kolf van 50 mL.</li>
		<li>Verwijder de vluchtige stoffen en coverdampen met CH2cl2 (4x 5 ml). Droog het residu in vacuuem gedurende 10 uur.</li>
		<li>Het materiaal in droge DMF (20 mL) opnieuw oplossen. Voeg samenstelling 4 (0,44 g, 1,50 mmol) en dipea (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) toe en rust de kolf uit met een terugvloeikoeler. Verwarm onder argon atmosfeer bij 90 °C gedurende 10 uur.</li>
		<li>Giet na het afkoelen op kamertemperatuur het donker groene mengsel op H2O (100 ml) en extract met etoac (3X 50 ml) in een scheitrechter. Was de gecombineerde organische lagen met verzadigde NaHCO3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2O (50 ml), en pekel (50 ml), droog over na2dus4, filter en concentraat in vacuo.</li>
		<li>Reinig het ruwe product per Kolomchromatografie over silicagel (3 cm kolom diameter en 50 cm hoogte) met behulp van een gradiënt van petroleumether/EtOAc (1:2) naar EtOAc.</li>
		<li>Elucidate en verifieer de molecuulstructuur (figuur 5a compound 8, 5b compound 9) door 1H NMR en 13C NMR spectra in DMSO-d6 op een nucleaire magnetische resonantie (NMR) Spectrometer. Controleer dat de zuiverheid van beide verbindingen hoger is dan 97% door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), het toepassen van een diode array detectie (DAD) bij 220 – 500 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. functionele validering van PROTAC moleculen
<ol><li>Western Blot-analyse van CRBN-afbraak door Protac's Opmerking: de effecten van samengestelde8en samengestelde9op CRBN eiwit niveau werden getest door Western Blot analyse. Bovendien kan de impact op IKZF1-en IKZF3-niveaus ook worden bevestigd (Figuur 6).<ol><li>
Monstervoorbereiding
		<ol>
<li>Los verbindingen 8 en 9, lenalidomide (len), pomalidomide (POM), MG132 en mln-4924 in DMSO bij een concentratie van 10 mm, aliquot en bewaar bij-80 °c tot verder gebruik.</li>
			<li>Zaad 1 x 106 MM1S cellen in een 6-put plaat met 2,5 ml media en behandel cellen met 100 nm of 1 μM samengestelde 8 of 9 voor 24 uur.</li>
			<li>Oogst cellen na de behandeling en centrifugeer bij 700 x g, 5 min, 4 °c. Was celpellet met koud 1x PBS om de resterende media te verwijderen, te centrifugeren bij 700 x g, 5 min, 4 °c en supernatant weg te gooien. Herhaal deze stap één keer.</li>
			<li>Lyse cellen in lysisbuffer (25 mM tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycerol, 1x protease & fosfatase inhibitor cocktail) gedurende 10 min op ijs, centrifugeer bij 320 x g gedurende 10 min, 4 °c. Oogst supernatant en bepaal de eiwitconcentratie door een bicinchoninïnezuureiwitassay (BCA-test) volgens het Protocol van de fabrikant.</li>
			<li>Denatuur eiwitten (15 – 30 μg/monster) met 1x LDS laad buffer (5% 2-mercaptoethanol) en kook 10 min, 75 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-PAGE
		<ol>
<li>Fix gel sandwich met een 10% scheiding gel [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8,45), 4 mL acrylamide 30%, 2,52 mL glycerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% ammonium PERSULFAAT (APS), en 9,75 ΜL TEMED] en een 4% stapelen gel [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% acrylamide, 3,168 mL H2O, 36 μL 11% APS en 6 ΜL TEMED] in een elektrode assemblage-eenheid. Verwijder kammen, spoel putten met kathode buffer (100 mM tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) en laad monsters.</li>
			<li>Vul de anode-buffer (100 mM tris/HCl, pH 8,9) in de tank. Load eiwit monster uit stap 2.1.1.4 en voer SDS-PAGE uit op 70 V, 20 min, gevolgd door 115 V, 150 min bij constante spanning.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immunoblotting en detectie van CRBN, IKZF1 en IKZF3
		<ol>
<li>Activeer PVDF-membraan (0,45 μm) in 100% methanol gedurende 1 min. evenwichts membraan en scheidende gel in 1x overdrachts buffer [10x overdrachts buffer (192 mM Glycine, 25 mM tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% methanol, 0,1% SDS, pH 8,3].</li>
			<li>Monteer de blotting cassette volgens het Protocol van de fabrikant. Transfer gel bij 180 mA voor 90 min.</li>
			<li>Was membraan 3x in 1x TBS-T (25 mM tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Blok membraan in 5% niet-vetgedroogde melk (NFDM), TBS-T voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was membraan 3x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Incuberen membraan met primair antilichaam voor CRBN (1:500 in 5% BSA, TBS-T) met zacht schudden bij 4 °C, 's nachts.</li>
			<li>Was membraan 3x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Inbroed membraan met anti muis (1:10.000 in 5% NFDM, TBS-T) of anti-konijn (1:5.000 in 5% NFDM, TBS-T) secundair antilichaam gekoppeld aan mierikswortelperoxidase HRP (1 uur bij kamertemperatuur.)</li>
			<li>Was membraan 2x in 1X TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap twee keer met 1x TBS.</li>
			<li>Inincuberen membraan voor 2 minuten met HRP substraat oplossing volgens de protocollen van de fabrikant en detecteren chemiluminescentie in een chemiluminescentie detectie-apparaat.</li>
			<li>Was membraan 1x in 1X TBS voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur. Voor het vrijkomen van antilichamen, strip membraan in commercieel verkrijgbare strip buffer voor 15 min. was membraan 3x in 1X TBS voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Reblokkeer membraan in 5% niet-vetgedroogde melk, TBS-T voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was membraan 3x in 1x TBS-T voor 5 – 10 min elk bij kamertemperatuur en reprobe met IKZF1, IKZF3 of tubuline volgens stap 2.1.3.4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Competitie experimenten met MG132, MLN4942 of pomalidomide Opmerking: om te bevestigen of crbn via het ubiquitin-proteasoom traject is afgebroken, hebben we competitie experimenten uitgevoerd met de proteasoomremmer MG132 en een neddylation activerende enzym (NAE) remmer MLN4942 (Figuur 7).<ol>
<li>Zaad 1 x 106 MM1S cellen per put in een 6-well plaat. Voorbehandelen van cellen met 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, of lenalidomide (100x), en incuberen 1 h bij 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Voeg 100 nM compound 8 toe voor 3 uur bij 37 °c, 5% Co2.</li>
		<li>Oogst cellen voor Western Blot volgens stap 2.1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Levensvatbaarheid van de cel in multipel myeloom cellijnen Opmerking: deze test wordt gebruikt om de impact op de levensvatbaarheid van de cel te testen en bovendien het effect van IMiDs op multipel myeloomcellen te antagoniseren door voor behandeling van de cellen met compound 8 (Figuur 8, figuur 9a, B).<ol>
<li>Zaad 5 x 104 MM1S cellen per put in een 96-goed bord in biologische triplicaten voor levensvatbaarheid assay. Voor Western Blot analyse, zaad 1 x 106 MM1S cellen per put in een 6-put plaat in biologische triplicates.</li>
		<li>Behandel cellen met DMSO of 100 nM, 1 μM of 10 μM samengestelde 8, samengestelde 9 of pomalidomide en inincuberen voor 24 h, 48 h of 96 h bij 37 °C, 5% Co2. Behandel voor reddingsexperimenten cellen met 100 nM-verbinding 8 voor 3 uur, vóór of na toevoeging van 1 μM pomalidomide en inincuberen voor 96 h.</li>
		<li>Meet 96-well plate luminescentie met een lichtgevende cel levensvatbaarheid Assay, volgens het Protocol van de fabrikant op een plaat lezer of oogst cellen uit de 6-well plaat voor Western Blot analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li>
<li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li>
<li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li>
<li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4%28CRBN%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li>
<li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li>
<li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide%2C+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphona%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li>
<li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li>
<li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4%2C+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del%285q%29+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protacs%3A+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li>
<li>Schneekloth, J. S. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+control+of+protein+levels%3A+selective+in+vivo+targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li>
<li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTACs%3A+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).</li>
<li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li>
<li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+protein+degradation+by+PROTACs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li>
<li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li>
<li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs%3A+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830(2017).</li>
<li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+TANK-Binding+Kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li>
<li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Medchemcomm%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li>
<li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+%28BET%29+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li>
<li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li>
<li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li>
<li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li>
<li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cereblon in health and disease.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li>
<li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen potentieel financieel belangenconflict.

Het ontwerp van dergelijke homo-Protac's zoals hier beschreven voor CRBN is gebaseerd op de specifieke affiniteit van pomalidomide aan CRBN, die met succes is gebruikt in talrijke heterobifunctionele Protac's en resulteerde in de ontwikkeling van PROTAC 8 als een zeer selectieve CRBN-Degrader. De specificiteit van ons molecuul is al bevestigd door Proteomic analysen24. Voor genetisch gemedieerde knock-out, uitsluiting en validatie van bijwerkingen is uitdagend en tijdrovend. Boven...

De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, allemaal goedgekeurd voor de behandeling van multipel myeloom, binden aan de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), een substraat adapter voor cullin4A-RING E3 ubiquitine ligase (CRL4crbn)1,2,3. Binding van imids verbetert de affiniteit van CRL4crbn voor de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3), leidend tot hun alomtegenwoordige en afbraak (Figuur 1)4,5, 6 , 7 , 8. Aangezien IKZF1 en IKZF3 essentieel zijn voor multipel myeloomcellen, resulteert hun inactivatie in groeiremming. SALL4 werd onlangs gevonden als een extra imid-geïnduceerde Neo-substraat van crbn die waarschijnlijk verantwoordelijk is voor de teratogeniciteit en de zogenaamde contergan catastrofe in de jaren 1950 veroorzaakt door thalidomide9,10. Caseïne kinase 1α (CK1α) is daarentegen een lenalidomide-specifiek substraat van CRBN dat betrokken is bij het therapeutische effect in myelodysplastisch syndroom met chromosoom 5q deleties11.
Het vermogen van kleine moleculen om een specifiek eiwit voor afbraak te targeten, is een spannende implicatie voor de moderne Geneesmiddelenontwikkeling. Hoewel het mechanisme van thalidomide en zijn analogen werd ontdekt na hun eerste gebruik bij de mens, werden zogenaamde PRoteolyse targeting Chimeras (protac's) ontworpen om specifiek te richten op een eiwit van belang (POI) (figuur 2)12,13,14,15,16,17,18. Protac's zijn heterobifunctionele moleculen die bestaan uit een specifieke ligand voor de POI verbonden via een linker aan een ligand van een E3 ubiquitine ligase zoals crbn of von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induceren de vorming van een voorbijgaande ternaire complex, dat de POI naar de E3 ubiquitine ligase leidt, resulterend in de alomtegenwoordige en proteasomale afbraak. De belangrijkste voordelen van Protac's ten opzichte van conventionele remmers is dat de binding aan een POI voldoende is in plaats van de remming ervan en daarom kunnen Protac's zich mogelijk richten op een veel breder spectrum van eiwitten, waaronder die welke als niet-Versleep baar werden beschouwd, zoals transcriptiefactoren15. Bovendien, chimerische moleculen handelen katalytisch en hebben daarom een hoge potentie. Na ubiquitine Transfer naar de POI, de ternaire complex dissocieert en is beschikbaar voor de vorming van nieuwe complexen. Zo zijn zeer lage PROTAC concentraties voldoende voor de afbraak van het doelwit eiwit23.
Hier beschrijven we de synthese van een geconjugeerde homo-PROTAC (compound 8) van pomalidomide-pomalidomide, die crbn aanwervent voor de afbraak van zichzelf24. De E3 ubiquitine ligase CRBN fungeert als zowel de recruiter en het doelwit op hetzelfde moment (Figuur 3). Om onze gegevens te valideren, hebben we ook een negatieve binding Control gesynthetiseerd (compound 9). Onze gegevens bevestigen dat de nieuw gesynthetiseerde homo-PROTAC specifiek is voor CRBN-degradatie en slechts minimale effecten heeft op andere eiwitten.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Carbonyldiimidazol</td><td>TCI chemicals</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>Verbinding 6</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-Fluorophthalic anhydride, 98 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine, 99 %</td><td>Acros</td><td>148270250</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Acrylamidstamml&ouml;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>Cell signaling</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CRBN-antilichaam geproduceerd in konijn</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG HRP-gekoppeld antilichaam</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI chemicals</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo luminescente celviabiliteitstest</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, anhydrous, 99.8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra Dry over Molecular Sieve</td></tr><tr><td>DMSO, anhydrous, 99.7 %</td><td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra Dry over Molecular Sieve</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis (HRP-geconjugeerd)</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease &amp; Fosfatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td><td>Cell signaling</td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&micro;m)</td><td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Jodomethaan, 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Zeer giftig</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot elektroforetische transfercel</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (cayman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal anti-&alpha;-Tubulin-antilichaam geproduceerd in muis (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Gedroogde melkpoeder zonder vet</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomide</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Verbinding 5</td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

chemische inactivatie van de e3 ubiquitin ligase cereblon door pomalidomide-based homo-protacs

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

De immunomodulerende geneesmiddelen (IMiDs) thalidomide en zijn analogen, lenalidomide en pomalidomide, alle door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van multipel myeloom, induceren alomtegenwoordig en afbraak van de lymfoïde transcriptiefactoren Ikaros (IKZF1) en Aiolos (IKZF3) via de cereblon (CRBN) E3 ubiquitine ligase voor proteasomale afbraak. IMiDs zijn recentelijk gebruikt voor het genereren van bifunctionele proteolyse gericht op chimeras (Protac's) om andere eiwitten op te richten voor alomtegenwoordige en proteasomale afbraak door de CRBN E3 ligase. We ontwierpen en synthetiseerden homobifunctionele Protac's op basis van pomalidomide en analyseerden hun vermogen om zelfgeleide alomtegenwoordige en afbraak van CRBN te induceren. Hier fungeert CRBN als beide, de E3 ubiquitine ligase en het doelwit op hetzelfde moment. De homo-PROTAC compound 8 DEGRADEERT crbn met een hoge potentie met slechts minimale resterende effecten op IKZF1 en IKZF3. CRBN inactivatie door compound 8 had geen effect op de levensvatbaarheid van de cel en de proliferatie van verschillende multipel myeloom cellijnen. Deze homo-PROTAC abrogates de effecten van IMiDs in multipel myeloomcellen. Daarom kunnen onze homodimere pomalidomide-gebaseerde verbindingen helpen om de endogene substraten en fysiologische functies van CRBN te identificeren en het moleculaire mechanisme van IMiDs te onderzoeken.

Hier beschrijven we het ontwerp, de synthese en de biologische evaluatie van een homodimere pomalidomide gebaseerde PROTAC voor de afbraak van CRBN. Onze protac communiceert gelijktijdig met twee crbn-moleculen en vormt ternaire-complexen die zelf-alomtegenwoordige en proteasomale afbraak van crbn induceren met slechts minimale resterende effecten op pomalidomide-geïnduceerde Neo-substraten IKZF1 of IKZF3.
Uit een reeks eerder g...

Dit werk beschrijft de synthese en karakterisering van een op pomalidomide gebaseerde, bifunctionele homo-PROTAC als een nieuwe benadering voor het induceren van alomtegenwoordige en afbraak van de E3 ubiquitine ligase cereblon (CRBN), het doelwit van thalidomide analogen.

Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Onze homodimeric PROTACs zijn de eerste chemische remmers van Cereblon en kunnen helpen om het moleculaire mechanisme van thalidomide analogen verder te verduidelijken, evenals om de fysiologische functie van Cereblon te onderzoeken. Deze nieuwe PROTAC-platformtechnologie kan zeer nuttig zijn voor het specifiek targeten van proteïnen die anders als ontraceerbaar worden beschouwd. CRBN remming alleen heeft geen anti-tumor activiteit.CRBN-degraders kunnen echter klinische implicaties hebben bij obesitas, infectieziekten en andere aandoeningen. De synthese is uitdagend en het is moeilijk om optimale linkers en gehechtheid te vinden om effectieve eiwitdegraders te genereren bij het ontwerpen van een PROTAC-verbinding. Om te beginnen, plaats 2,46 gram Boc-beschermde L-glutamine en 50 milliliter tetrahydrofuran in een 100 milliliter ronde bodem kolf, en roer op 800 rpm gedurende een minuut.Voeg vervolgens 1,95 gram 1, 1'carbonyldiimidazol en een katalytische hoeveelheid 4-pyridine toe. Blijf 10 uur roeren bij reflux om een duidelijke kleurloze oplossing van glutarimide compound te verkrijgen. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en verwijder het oplosmiddel met een roterende verdamper.Red het residu in 200 milliliter ethylacetaat en giet het in een separatory trechter. Was de organische laag met 50 milliliter elk van gedeïoniseerd water en pekel, en droog de organische laag over natriumsulfaat. Zwaartekracht filtert de oplossing door silicagel om de droogmiddel te verwijderen en spoel vervolgens de silicagel af met 200 milliliter ethylacetaat.Verwijder het oplosmiddel uit het filtraat onder vacuüm om Compound 1 als kleurloze vaste stof te verkrijgen. Droog het product 's nachts onder vacuüm voordat u het gebruikt. Los vervolgens 0,50 gram natriumacetaat op in 20 milliliter glaciale azijnzuur in een kolf met ronde bodem van 100 milliliter, uitgerust met een roerstaaf.Voeg 1,25 gram 3-fluoroftale anhydride en 1,14 gram glutarimide toe en roer zes uur lang bij reflux om een paarse oplossing van Compound 3 te verkrijgen. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur, en giet het in 100 milliliter gedeïoniseerd water en roer gedurende 10 minuten om compound 3 neer te storten. Verzamel de vaste stof door filtratie, was het met water en petroleum ether, en droog het onder vacuüm voor twee dagen.Plaats vervolgens 0,83 gram compound drie en 20 milliliter droge dimethylsulfoxide in een 50 milliliter Schlenk-kolf en roer gedurende twee minuten. Voeg 0,22 gram alfa omega diamine linker Compound 6 en 1,05 milliliter N, N-diisopropylethylamine toe en roer het mengsel onder argon gedurende 18 uur onder argon op 90 graden Celsius om Homodimer 8 in een donkergroen mengsel te verkrijgen. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur en giet het in 100 milliliter gedeïoniseerd water.Haal het product in drie porties ethylacetaat van 50 milliliter, combineer de organische lagen en was ze met 50 milliliter water en pekel. Droog de gewassen organische laag over natriumsulfaat, filter de drooggebak en verwijder het oplosmiddel onder vacuüm. Redissolve het residu in een minimale hoeveelheid chromatografie oplosmiddel en van toepassing op een silica gel kolom voor zuivering.Verzamel de fluorescerende productfracties, combineer ze en verwijder het oplosmiddel om Homodimer 8 als gele vaste stof te verkrijgen. Los om te beginnen 2,28 gram Glutarimide 1 op 25 milliliter dimethylformamide op in een kolf van 100 milliliter. Schorst 2,76 gram gemalen kaliumcarbonaat in deze oplossing.Trek vervolgens 0,62 milliliter iodomethaan in een spuit uitgerust met een naald van 20 meter. Voeg de iodomethaan drop-wise in de loop van 10 seconden. Stop de kolf met een rubberen septum, en voeg een vent naald.Soniceer het mengsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur om Glutarimide Compound 2 te verkrijgen. Verdun het mengsel met 50 milliliter ethylacetaat en giet het in een separatoire trechter. Spoel de kolf in de trechter met nog eens 50 milliliter ethylacetaat.Werk het product en zuiver het met silica gel kolomchromatografie om Glutarimide 2 te verkrijgen als een kleurloze vaste stof. Vergelijk de bewaartijden van Glutarimide Compounds 1 en 2 om te bevestigen dat N-methylatie succesvol was. Behandel om te beginnen met de validatie, behandel meerdere myeloomcellen met de verbindingen van belang.Isoleer de relevante eiwitten en bereid monsters voor op een westerse Blot-analyse van eiwitdegradatie. Bereid vervolgens een gelsandwich voor SDS-PAGE en vul de anodebuffertank met een pH 8.9 tris-HCl-oplossing. Laad de eiwitmonsters in de gel en voer het op 70 Volt gedurende 20 minuten, gevolgd door 115 volt gedurende 150 minuten.Bereid vervolgens 1x transferbuffer voor immunoblotting en verplaats de gel voorzichtig van de cassette naar de overdrachtsbuffer om te equiliberen. Je moet heel voorzichtig zijn wanneer u de gel uit de cassette verwijdert voor evenwicht, omdat deze zeer snel kan barsten en kreuken. Dompel een 0,45 micrometer polyvinylidene difluoride membraan in pure methanol voor ten minste 20 seconden om het te activeren, en vervolgens onder te dompelen in 1x overdracht buffer.Laat de gel en het membraan gedurende 10 minuten in evenwicht zijn. Monteer vervolgens de Western Blotting cassette en breng 180 milliamperes gedurende 90 minuten aan om de eiwitten op het membraan over te brengen. Visualiseer daarna de eiwitten door immunostaining.Om de effecten op de levensvatbaarheid van de cel te evalueren, eerste, zaad 50.000 multipel myeloom cellen per put van een 96 goed plaat in biologisch drievoud. Voeg aan elke bron 100 microliter media toe die DMSO bevatten, of een 0.1, een of 10 micromolar van Compound 8, Compound 9 of pomalidomide. Om cel levensvatbaarheid te redden experiment uit te voeren, in plaats daarvan behandelen de cellen met een 100 nanomolar oplossing van Compound 8 gedurende drie uur, hetzij voor of na het toevoegen van een een micromolar oplossing van pomalidomide.Incubeer de cellen voor 24, 48, of 96 uur bij 37 graden celsius in een 5%koolstofdioxideatmosfeer, en meet de levensvatbaarheid van de cel met een luminescente test. De structuur van homodimeric PROTAC 8 werd bevestigd met proton en koolstof NMR. Heterodimeric PROTAC 9 werd gesynthetiseerd als een negatieve controle, als N-methylatie binnen de glutarimide gedeelte resulteert in een verlies van Cereblon, of CRBN, bindende vermogen.De homo PROTAC 8 veroorzaakte bijna volledige proteosomale CRBN-afbraak met minimale effecten op de lymfoïde transcriptiefactoren IKZF1 en IKZF3. In tegenstelling, de hetero PROTAC 9 vertoonde gedrag vergelijkbaar met pomalidomides. Samengestelde 8 geïnduceerde CRBN-afbraak kan worden geblokkeerd door een directe remmer van het proteasoom, of indirect geblokkeerd door netylation-remming.Cellen die vooraf werden behandeld met Compound 8 verzetten zich aanzienlijk tegen de effecten van pomalidomide op IKZF1 en IKZF3. Compound 8 geïnduceerde CRBN afbraak had veel minder van een effect op multipel myeloom cel levensvatbaarheid na 96 uur dan de IKZF1 en IKZF3 afbraak van Compound 9 en pomalidomide deed. Meerdere myeloomcellen die vooraf werden behandeld met Compound 8 hadden een aanzienlijk grotere levensvatbaarheid wanneer ze werden blootgesteld aan pomalidomide dan onbehandelde cellen, wat suggereert dat Compound 8 kan worden gebruikt om immunomodulatorische IMiD-resistentie na te bootsen.We vonden dat Compound 8 volledige proteasomale afbraak van Cereblon induceert, geen bijwerkingen heeft op IKZF1 en IKZF3 cel levensvatbaarheid en proliferatie. De uitbreiding van de projecttechnologie naar andere doelen heeft het potentieel voor het inactiveren en volgen van eiwitten die verband houden met kanker en andere ziekten. Bij het aanpassen van deze techniek voor andere geneesmiddelen en eiwitten, moet men zorgvuldig onderzoeken van de moleculaire structuren van het geneesmiddel en het eiwit doel om de optimale linkers en bijlagen te kiezen.De IMiDs werken niet bij muizen vanwege een puntmutatie in Cereblon, maar er bestaat een transgene knock-in muismodel dat kan worden gebruikt voor verdere dierstudies. Aangezien pomalidomide een analoge thalidomide is, die zeer teratatogeen is, raden we zwangere vrouwen die met deze geneesmiddelen werken niet aan.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.

Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

Evaluatie van de potentie van milieu chemische stoffen en drugs, enzymatisch worden bioactivated op tussenproducten genereren covalente DNA adducten, is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. Methoden worden beschreven voor samengestelde activering aan formulier die DNA, evenals de technieken voor de detectie en kwantificering adducten.

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Dit protocol beschrijft de kwantitatieve luminescerende detectie van eiwitafbraakkinetiek in levende cellen die zijn ontworpen met CRISPR / Cas9 om antilichaamvrije endogene eiwitdetectietag tot expressie te brengen die is gefuseerd tot een doeleiwit. Gedetailleerde instructies voor het berekenen en verkrijgen van kwantitatieve afbraakparameters, snelheid, Dmax, DC50 en Dmax50 zijn inbegrepen.

High-Throughput cellulaire profilering van gerichte eiwitafbraakverbindingen met behulp van HiBiT CRISPR-cellijnen

Hier beschrijven we een bioassay met behulp van 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) om eerder gesynthetiseerde spirocyclische oximen te testen.

Gefunctionaliseerde spirocyclische heterocyclussynthese en cytotoxiciteitstest

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Dit artikel rapporteert de constructie van centromeer-geassocieerde proteïne-E (CENP-E) knock-outcellen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem en drie op fenotype gebaseerde screeningstrategieën. We hebben de CENP-E knock-out cellijn gebruikt om een nieuwe benadering vast te stellen om de specificiteit en toxiciteit van de CENP-E-remmers te valideren, wat nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en biologisch onderzoek.

Generatie van Centromeer-geassocieerde proteïne-E CENP-E-/- knock-outcellijnen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem

Hier beschrijven we protocollen voor de biofysische karakterisering van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS) waarbij de ubiquitine-ligases Von Hippel-Lindau E3-ligase (VHL) en Cereblon (CRBN) betrokken zijn.  Biofysische methoden die hierin worden geïllustreerd, zijn onder meer oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en isotherme titratiecalorimetrie (ITC).

De ontwikkeling en toepassing van biofysische assays voor het evalueren van ternaire complexvorming geïnduceerd door proteolyse gericht op chimeren (PROTACS)

We beschrijven experimentele details van de synthese van patronen en herconfigureerbare deeltjes van tweedimensionale (2D) precursors. Deze methodologie kan worden gebruikt om deeltjes te maken in een verscheidenheid van vormen zoals veelvlakken en grijpinrichtingen bij lengteschalen variërend van micro tot centimeter schaal.

Origami Inspired Zelf-assemblage van Patterned en Herconfigureerbare Deeltjes

Ontdek hoe homodimerische PROTACs de E3 ubiquitine ligase Cereblon (CRBN) chemisch inactiveren via ubiquitinatie en degradatie. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van eiwitten die eerder als onvolgbaar golden.

Chemische inactivatie van de E3 Ubiquitin ligase Cereblon door Pomalidomide-based homo-PROTACs

Meer video's verkennen