Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

We hebben eerder een apparaat ontworpen om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen. In het huidige werk hebben we de geometrie van het substratum opnieuw ontworpen en de setup aangepast voor hoge resolutie beeldvorming van deze stamcellen. Het belangrijkste voordeel van dit cel-stretching systeem is dat het een hoge resolutie subcellulaire beeldvorming biedt bij 100x van de stamcellen.

Het aantonen van de substratum fabricage zal Vicki zijn, een onderzoeksassistent van mijn lab. Begin met het ontwerpen van een single-well polydimethylsiloxane schimmel door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol. Meng vervolgens 20 delen van een polydimethylsiloxanebasis met één deel uithardingsmiddel in een wegwerpbeker.

Na het gemengd worden, plaatst u het polydimethylsiloxaanmengsel gedurende 30 minuten in een vacuüm de-gasser op 0,8 bar om de bellen uit het mengsel te verwijderen. Giet vervolgens de polydimethylsiloxanemix in de mal en de schotel. Verwijder eventuele extra bellen in dit stadium door het opnieuw te vergassen op 0,8 bar vacuüm gedurende 30 minuten.

Wanneer het ontgassen is voltooid, bak de monsters op 80 graden Celsius op een nivelleringstafel gedurende twee uur. Verwijder vervolgens voorzichtig de monsters uit de oven en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd de randen met een mes en pel voorzichtig de genezen polydimethylsiloxaan.

Op de 150 millimeter diameter polydimethylsiloxane, trek een twee centimeter bij twee centimeter raster met een marker. Binnen elk vierkant, teken een centimeter bij een centimeter vierkant, waardoor een marge van 0,5 centimeter aan alle kanten. Gebruik een mes om zorgvuldig te snijden langs de lijnen en het verkrijgen van vierkante compartimenten.

Maak vervolgens de monsters schoon door ze in 100% aceton gedurende vier uur, 100% ethanol gedurende nog eens vier uur en vervolgens vier uur in autoclaved water te ontcunken. Plaats de gereinigde monsters op paraffine folie backing papier in een 150 millimeter diameter plastic schotel en droog het monster in een 80 graden Celsius oven voor vier uur. Verzegel de gerechten met paraffinefolie en bewaar ze in een koude kamer tot verder gebruik.

Bereid voorloper cellen en schor ze in proliferatie medium. Zaad deze cellen met een dichtheid van 35.000 cellen per vierkante centimeter op PDL-gecoate plastic oppervlakken. Pas het volume van het proliferatiemedium aan op drie milliliter per tien centimeter in het kwadraat.

Een lager volume van de media kan leiden tot celklonteren, die voortvloeien uit oppervlaktespanning krachten, terwijl een hoger volume van de media in de gerechten kan leiden tot de media te morsen over. Oogst op de derde dag na het zaaien de cellen en tel ze met een hemocytometer. Dan zaad 35,000 cellen per polydimethylsiloxane plaat met 700 microliter proliferatie medium.

Voeg vervolgens een plasmische constructie toe aan het labelen van de histone H2B-complexen van de cel met groen fluorescerend eiwit door de instructies van de fabrikant te volgen. Monteer na 24 uur de polydimethylsiloxaanmonsters met cellen die op het uniaxiale stamapparaat moeten worden uitgerekt. Verander vervolgens het medium in alle monsters in differentiatiemedium.

Meet de ongetrainde celcompartiment lengte en draai het stadium micrometer schroef om de lengte van het celcompartiment te verhogen met de gewenste hoeveelheid stam. Laat de uitgerekte en ongesretched polydimethylsiloxanemonsters in de couveuse op 37 graden Celsius tot beeldvorming. Bereid de microscoop incubator voor live beeldvorming door het instellen van de incubator temperatuur op 37 graden Celsius.

Breng vervolgens een 100x olieonderdompelingsdoelstelling naar de centrale positie, omdat de objectieve turnit later niet toegankelijk zal zijn. Eenmaal in positie, schroef het doel en schroef het terug in elkaar met een objectieve ring, zodat het doel dichter bij de cellen kan worden gebracht. Voeg vervolgens een druppel olie toe aan het doel.

Met behulp van een op maat bedrukte houder, coat de houder met vacuüm vet aan de periferie van het raam en plaats een nummer nul dikte glazen coverslip op het bovenste oppervlak van de houder. Tape het plastic venster op de microscoop stadium. Schroef vervolgens een Z-vertaalfase op het microscooppodium en verplaats deze naar de hoogste Z-positie.

Verwijder 500 microliter van het medium van de uitgerekte polydimethylsiloxaneplaat die moet worden afgebeeld en voeg dit medium toe aan de glazen coverslip in het witte plastic venster. Gebruik vervolgens een steriele pincet om het vierkante compartiment voorzichtig los te maken van de polydimethylsiloxaneplaat. Houd het stamapparaat rechtop, zodat de cellen naar boven, boven het witte plastic venster gericht zijn en het stamapparaat voorzichtig omkeren, zodat een extra medium direct in het midden van de glazen coverslip met de cellen naar beneden naar beneden kan vallen.

Plaats het onderste deel van het stamapparaat op de Z-vertaalfase met behulp van dubbelzijdige tape om het op zijn plaats te houden. Tijdens het kijken door het oculair onder helder-veld, heel langzaam brengen de stam apparaat naar beneden en beweeg het doel omhoog om zich te concentreren op de cellen. Voer deze focusstap langzaam uit, afwisselend het verlagen van de Z-vertaalfase en het verhogen van het doel.

Als de Z-vertaalfase te veel verlaagt, kunnen de cellen comprimeren en dus afsterven. Als we het doel te hoog verhogen, kan het de glazen afdekking breken en het medium laten lekken. Scan de polydimethylsiloxaneplaat in X- en Y-richtingen om een cel te vinden die een fluorescerende kern heeft, met behulp van epiflorescentie bij 488 nanometer excitatie.

Zorg er ook voor dat de cel een geschikte morfologie heeft wanneer u naar het monster onder een helder veld kijkt. Neem breedveld- of open-pinholebeelden van de kern op met 488 nanometer golflengte-excitatie en van de cel met heldere veldexcitatie met intervallen van 30 seconden per frame gedurende een totale duur van ten minste 30 minuten. De opnieuw ontworpen geometrie van het substratum polydimethylsiloxane en de beeldvormingsopstelling in deze video minimaliseren de afstand tussen de cellen en het doel.

Dit maakt time-lapse beeldvorming van fluorescerend gelabelde celkernen mogelijk met behulp van een 100x olieonderdompelingsdoelstelling. Om de nucleaire schommelingen te meten, zet eerst het nucleaire gebied versus de tijd in kaart. Vervolgens detrend de gegevens met behulp van een derde orde polynomial.

En tot slot, plot restschommelingen en bereken de standaarddeviatie van de resterende schommelingen. De nucleaire schommelingen van de oligodendrocyte voorlopercellen, na chemische inductie van differentiatie met en zonder een 10%trekstendam, tonen aan dat met chemische inductie alleen al de amplitude van nucleaire schommelingen een significante afname vertoonde na 48 uur, maar niet na 24 uur. Aan de andere kant vertoonde de chemische inductie samen met een treksstam van 10% een significante daling na 24 uur, die constant bleef zonder verdere vermindering na 48 uur.

Het belangrijkste om te onthouden is dat de werkafstand van de gekozen doelstelling gelijk moet zijn aan of groter moet zijn dan de diepte van het celcompartiment plus de dikte van de coverslip. Het substratum kan opnieuw worden ontworpen om een raster op te nemen, wat de beeldvorming van dezelfde cel voor en na het aanbrengen van spanning zou vergemakkelijken, omdat een voor- en na-type gegevensset het geluid van experimentele fouten vermindert. Met behulp van deze imaging setup, veel subcellulaire verschijnselen binnen aanhangende levende cellen, zoals eiwitlokalisatie of dynamiek van cellulaire componenten, kan worden afgebeeld binnen enkele seconden na de toepassing van de mechanische stam.