Imaging integrine spanning en cellulaire kracht bij Submicron resolutie met de Sensor van een integratieve spanning

Deze DNA-gebaseerde integratieve spanningssensor, of ITS, het omzetten van kracht signaal naar fluorescentie lokaal maakt de directe beeldvorming van cellulaire kracht met fluorescentie microscopie. ITS heeft een hoge ruimtelijke resolutie en een hoge gevoeligheid. De activeringsdrempel is niet mogelijk, waardoor selectief beeld van integrin spanning op verschillende niveaus mogelijk is.

Na ontvangst van de aangepaste single-stranded DNA, of ssDNA, van belang, om RGD peptide te conjuceren aan de thiolated ssDNA quencher, voeg eerst 100 microliter van 0,5-molaire EDTA in 400 microliter water toe aan ongeveer 450 microliter van vers voorbereide TCEP-oplossing. Voeg vervolgens 10 microliter van de TCEP-EDTA-oplossing toe aan 20 microliter van een-millimolar thiol DNA-quencher in PBS voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 40 microliter vers bereide 23-millimolar sulfo-SMCC toe aan 100 microliter vers bereide 11-millimolar RGD amine-oplossing voor een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur.

Om RGD amine SMCC te vervoegen met de thiolated ssDNA quencher, mengt u het volledige volume van de thiolated ssDNA quencher-oplossing met het volledige volume van de RGD amine SMCC-oplossing voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Breng de oplossing aan het einde van de incubatie over naar de opslag van vier graden Celsius 's nachts. Meng de volgende ochtend natriumchloride van drie kiezen met de thiol-geconjugeerde DNA-oplossing en min 20 graden Celsius, gekoeld, 100%-ethanol bij een verhouding van één tot 10 tot 25 en plaats de reactie ongeveer 30 minuten op min 20 graden Celsius.

Wanneer het DNA is neergeslagen, het DNA verzamelen door centrifugatie, en resuspend de pellet in PBS voor de meting van de DNA-concentratie op een spectrometer. Voor integratieve spanningssensor, of ITS, synthese, meng de bovenste en onderste streng DNA-oplossingen op een 1,1-op-een-kies verhouding, en incubeer de reactie 's nachts op vier graden Celsius voor het plaatsen van aliquots van het mengsel op min 20 graden Celsius voor langdurige opslag. Voor its immobilisatie, coat een 29-millimeter-diameter, glazen bodem Petri schotel met 200 microliter van 0,1-milligram-per-milliliter biotinylated runder serum albumine, of BSA-biotine, voor 30 minuten op vier graden Celsius.

Wanneer de BSA-biotine fysiek heeft geadsoreerd op het glasoppervlak, was de schotel drie keer met 200 microliter verse PBS per wasbeurt, gevolgd door incubatie met 200 microliter van 50 microgram per milliliter avidin-eiwit gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de schotel drie keer met PBS zoals aangetoond, en voeg 200 microliter van 0,1-micromolar ITS voor nog eens 30 minuten incubatie bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie was je de schotel drie keer met PBS, waardoor de laatste wasbeurt in de schotel tot de celbeplating.

Om een vis keratocyte cultuur te initiëren, gebruik maken van een flat-tipped pincet om een stuk van de schaal te plukken van een vis, en druk voorzichtig de schaal op de put van een ongewijzigde glazen bodem Petri schotel, met de binnenkant van de schaal contact met het glas. Wacht ongeveer 30 seconden tot de visschaal zich aan het glazen oppervlak van de schotel hecht voordat u de weegschaal bedekt met een millimeter van het medium van de complete Iscove. Vervolgens, inculbateren van de schaal in een donkere en vochtige doos voor zes tot 48 uur bij kamertemperatuur.

Om de keratocyten op het ITS-oppervlak te plaatsen, vervangt u het medium van de keratocytenkweekschotel door 1X-cellosaflossingsoplossing voor een incubatie van drie minuten bij kamertemperatuur. Vervang aan het einde van de incubatie de loskoppelingsoplossing door vers compleet medium en distantieer de cellen met zachte pipetting. Pas vervolgens de cellen aan de juiste concentratie voor beplating en zaai ze 30 minuten op de met ITS gecoate schotel bij kamertemperatuur voordat de beeldvorming wordt weergegeven.

Voor quasi-real-time integrin spanningsbeeldvorming in levende cellen, breng de cellen naar het stadium van een fluorescentiemicroscoop en selecteer de 40 of 100 keer doelstelling. Stel in de beeldsoftware de belichtingstijd in op één seconde en het frameinterval van 20 seconden om een video van de ITS-beelden te verkrijgen. Gebruik vervolgens een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse om een eerder frame van de ITS-video af te trekken van een huidig frame om het ITS-signaal te berekenen dat nieuw is geproduceerd in het nieuwste frameinterval.

Het nieuw geproduceerde ITS-signaal vertegenwoordigt de integrin spanning gegenereerd in het nieuwste frame interval, waardoor de cellulaire kracht in quasi-real-time manier. Hier toont integrin tension mapping de inductie van integrin spanning op twee krachtsporen tijdens keratocyte migratie. De resolutie van de force map kan dan worden gekalibreerd tot 0,4 micrometer.

De hoge integrinspanning concentreert zich bij de achtermarge in motile vissen keratocyten. In niet-mokercellen wordt een specifiek integrin tension patroon gevormd dat heel anders is dan dat waargenomen in de snel migrerende keratocyte. Focale verklevingen en de integrin spanning van vis keratocyten kunnen worden co-beeld om de relatie tussen integrin spanning en celstructuur in cellen van belang te evalueren.

Met ITS wordt celhechtingskracht zichtbaar met een resolutie en een gevoeligheid die vergelijkbaar is met celstructurele beeldvorming. Deze techniek effent de weg voor de studie van een kracht-structuur samenspel in cellen.