Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen

Dit protocol toont het nut van de stamcel-afgeleide darmorganoïde systeem voor het modelleren van epitheliale invasie door enterische pathogenen, en wijziging van dit proces met behulp van cytokinen. Micro-injectie maakt het mogelijk de ziekteverwekker van belang rechtstreeks in de lumenholte van de organoïde te leveren, waardoor het infectieproces in vivo beter wordt gerepliceerd. Deze methode kan worden toegepast op de studie van verschillende enterische pathogenen of alternatieve cytokines van belang.

Ik stel voor het voltooien van een proef run van de procedure met fenol rood alleen om de micro-injectie techniek onder de knie voorafgaand aan het gebruik van ziekteverwekkers. Op dag twee, begin de differentiatie door het veranderen van de media tot 10 milliliter van stamcelcultuur medium, aangevuld met groeifactoren. Op dag zes, verander de media naar 10 milliliter rpmi-B27 media, aangevuld met zes micromolar CHIR99021, plus drie micromolar retinoïnezuur om te beginnen met het patroon van de achterste endoderm aan de achterdaag.

Op dag 10 insluiten in de keldermembraanmatrix. Verwijder eerst de media van de achterpootplaat en was de plaat één keer met calcium magnesiumvrije DPPS. Voeg vijf milliliter collagenase oplossing aan de plaat en incubeer op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Activeer vervolgens de collagenase door vijf milliliter van de organoïde basisgroeimedia aan de plaat toe te voegen. De achtersnulcellen moeten op dit punt drijven. Verzamel de achterschorting in een conische buis van 15 milliliter.

Dan centrifugeren op 240 keer-G voor een minuut. Na centrifugatie, pipet uit de supernatant, voeg 10 milliliter van de organoïde basis groeimedia, breken de achterduit in kleinere stukken door zachtjes pipetten, en centrifuge weer op 95-keer-G voor een minuut. Was de cellen in de organoïde basis groeimedia twee keer.

Resuspend de cellen in 300 tot 500 microliter van de basis groeimedium, en voeg ongeveer 100 microliter van deze oplossing tot 1,5 milliliter van de kelder membraan matrix. Zet een 24-well plaat op een plaat kachel op 37 graden Celsius. en spot 60 microliters van het hindgut celmatrixmengsel in één put van de 24-putplaat.

Laat het kort instellen en controleer de dichtheid onder een microscoop. Na het spotten van de rest van de matrix in de 24-put plaat, incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 800 microliters van de basisgroeimedia toe met groeifactoren aan elke put van de 24-putplaat.

Om organoïden door te geven, verwijder je eerst de media eruit en vervang je deze door 500 microliter per put van de celheffenoplossing. Incubeer op vier graden Celsius gedurende 40 tot 50 minuten, waarna de organoïden in de oplossing moeten zweven. Voorzichtig pipette de organoïden en de cel tillen oplossing in 15-milliliter conische buizen, proberen niet te breken van de organoïden.

Nadat de organoïden drie tot vijf minuten hebben kunnen worden opgenomen, verwijdert u de supernatant en de enkele cellen. Resuspend de organoïden in vijf milliliter van de basis groeimedium, en pipet ze zachtjes te wassen. Centrifuge op 95 keer-G gedurende twee minuten.

Vervolgens zet u de 24-put plaat op een plaatkachel op 37 graden Celsius in de kap en verwijder u de supernatant uit de organoïde pellet. Vervolgens, met behulp van een P1000 pipet, resuspend de organoïden in 300 tot 500 microliter van de basis groeimedia op te breken van de organoïden in kleinere brokken. Plaats ongeveer 100 microliter van de organoïden in 1,5 milliliter van de kelder membraanmatrix en pipet kort te mengen.

Spot 60 microliters van de keldermembraanmatrix in één put van de 24-putplaat. Na het verlaten van het te stollen voor 30 seconden, controleer de dichtheid onder de microscoop. Na het spotten van de rest van de matrix in een 24-put plaat, plaats de plaat in een incubator op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten, en dan overlay het met 800 microliters van de basis groei medium met groeifactoren volgens het manuscript.

Voor micro-injectie testen met recombinant menselijke IL-22 pre-stimulatie, voeg recombinant menselijke IL-22 aan de cultuur media aan een definitieve concentratie van 100 nanogram per milliliter 18 uur voorafgaand aan injecties. Laad de micro-injectie schotel met organoïden op de microscoop stadium, verwijder het deksel, en breng de organoïden in focus, klaar voor de injectie om te beginnen. Zet de injector en de arm-control stations aan.

Zorg ervoor dat de injector is ingesteld op een druk van 600 kilopascals en een injectietijd van 0,5 seconden. Als het nog niet wordt weggedrukt van de microscoop fase, draai de injectie arm om ervoor te zorgen dat het is, en verwijder de grip-kop. Laad de boorpunt met 10 microliter van het entmateriaal, waarbij de boorpunt voorzichtig aan het stompe uiteinde wordt vastgrijpend.

Plaats de boorpunt in de grip-kop en pas deze opnieuw aan de micro-injectiearm. Beweeg de arm voorzichtig in een positie waar de naald zich één tot twee centimeter boven de micro-injectieschaal bevindt. Gebruik de armcontrole om de naaldpunt in het midden van de schotel te plaatsen en het te verlagen totdat deze net over het oppervlak van de media is.

Programmeer het armcontrolestation om de naald na alle injecties terug te brengen naar dit punt. Richt de microscoop op de organoïden en selecteer het doel om te injecteren. Plaats de naald net boven en het recht van de te injecteren organoïde en beweeg de naald naar beneden en zijwaarts in het organoïde lumen.

Druk op de injectknop op de micro-injector om het met fenol bevlekte bacteriemengsel uit de naald te laten ontstaan. En injecteer elke organoïde drie keer. Wanneer alle benodigde organoïden worden geïnjecteerd, verwijder de micro-injectieplaat uit het podium, vervang het deksel en broed de plaat 90 minuten lang uit op 37 graden Celsius.

Na de incubatie, aspirate de groeimedia en vervang het door drie milliliter van cel hijsoplossing. Dan, incubeer op vier graden Celsius gedurende 45 minuten. Beweeg vervolgens voorzichtig de organoïden en de celliftingsoplossing naar een 15-milliliter conische buis met vijf milliliter DPBS.

Centrifuge op 370-keer-G gedurende drie minuten. Verwijder de supernatant, en voeg een milliliter van de basis groei media met 0,1 milligram per milliliter gentamicine. Vervolgens, met een P1000, pipet op en neer ongeveer 50 keer te breken van de organoïden.

Voeg vier milliliter meer media, en incubeer op 37 graden Celsius voor een uur om extracellulaire bacteriën te doden. Vervolgens centrifugeren de organoïden op 370-keer-G gedurende drie minuten. Aspirate de supernatant, waardoor zo weinig mogelijk.

Was de organoïden een keer met DPBS en centrifuge opnieuw. Voeg 500 microliters van de lysebuffer toe en pipet ongeveer 50 keer op en neer om de menselijke darmorganoïden handmatig te scheiden. Na vijf minuten bij kamertemperatuur te hebben uitgebroed, verdunt u de resulterende oplossing in DPBS in serie.

Pipette drie 20-micron druppels van de nette en verdunde oplossingen op voorverwarmde LB agar platen. Tot slot, broeden op 37 graden Celsius 's nachts en doorgaan met kolonie-tellen. De menselijke darmorganoïden werden micro-geïnjecteerd met de fenol rode bacteriële oplossing.

Behoud van deze rode kleur door de organoïden voorkomt dubbele injecties. Voorbehandeling van de menselijke darmorganoïden afgeleid van de COF-2 cellijn met recombinant menselijke IL-22 beperkt de invasie van S.typhimurium SL1344 in darmeppitheelcellen. Geïnfecteerde organoïden werden verwerkt voor immuno-kleuring, of transmissie elektronenmicroscopie, om de visualisatie van gastheer IEC bacteriële interacties te vergemakkelijken.

RNA kan worden geëxtraheerd uit de geïnjecteerde organoïden om te kijken naar transcriptomische reactie op infectie. Fluorescentie en elektronenmicroscopie kunnen ook worden gebruikt om interacties met gastpathogen in meer detail te observeren. Het belangrijkste om te onthouden is om ervoor te zorgen dat je genoeg oefening op de micro-injector hebt gehad om uw injecties snel en efficiënt te kunnen voltooien voor consistente resultaten.

Micro-injectie boor tips hebben een fijn, scherp punt, en zorg moet worden genomen bij het laden en lossen van hen uit de micro-injector. Deze techniek maakt het mogelijk om epitheelcelpathogen interacties worden bestudeerd in voorheen onbereikbare detail. Dit infectiemodel zal van bijzonder nut zijn voor degenen die mensspecifieke ziekteverwekkers bestuderen.