Gerichte studies met behulp van seriële blokkering en gerichte ionen straal scan elektronenmicroscopie

Elk life science project dat 3D ultrastructure onderzoek van een specifieke regio van belang in een complexe biologische steekproef vereist kan gebruik maken van deze techniek. De monsterbereidingsprocedure is hetzelfde voor twee beeldvormende modaliteiten, namelijk SBF/SEM en FIB-SEM. Het gebruik van de microgolf versnelt het monsterverwerkingsdeel aanzienlijk.

Hoewel hier getoond voor root tips, kan dit protocol worden gebruikt voor elk biologisch model systeem met minimale aanpassingen. Voordat u deze workflow gebruikt voor het correleren van SBF/SEM en FIB-SEM, moet men vertrouwd zijn met de individuele technologieën. De uitvoering van bepaalde stappen is gemakkelijk te demonstreren, maar moeilijk te beschrijven in geschreven tekst.

Het aantonen van de procedure zal Peter Borghgraef zijn die een technicus in ons lab is. Om te beginnen, snijd worteltoppen van de vaste Arabidopsis thaliana zaailingen op agar platen en zet twee tot drie tips in Eppendorf buizen met dezelfde fixatieve 's nachts op vier graden Celsius. In de ochtend, met een pipet, vervangen fixatief met 0,1 molaire fosfaat buffer bij pH 6.8 in de buizen met de buizen op een roterende tafel op 100 RPM en wassen gedurende 10 minuten.

Herhaal vervolgens de was met verse fosfaatbuffer vijf keer. In een rookkap, post-fix de wortel tips door het vervangen van fosfaat buffer met 2%osmium tetroxide en 0,2%ruthenium rood in 0,1 molaire fosfaatbuffer bij pH 6.8 met de buizen met deksels open in een magnetron en start het programma. Gooi vervolgens de oplossing in de buizen en was de worteltips twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende vijf minuten per stuk.

Voor de derde en vierde dubbele gedestilleerde waterwas, gebruik de magnetron om de was te helpen. Na de eerste 40 seconden dubbele gedestilleerde waterwas, neem de wortelpuntmonsters uit de magnetron en vervang het dubbel gedestilleerde water door vers dubbel gedestilleerd water. Zet de monsters terug in de magnetron en zet het programma voort.

Bereid vervolgens TCH-oplossing door 0,1 gram thiocarbohydrazide toe te voegen aan 10 milliliter dubbel gedestilleerd water in een buis van 15 milliliter. Plaats de buis in een oven en verwarm op 60 graden Celsius gedurende een uur op te lossen. Filter vervolgens de TCH-oplossing met een spuitfilter van 0,22 micrometer.

Vervang de oplossing in de monsterbuizen onmiddellijk door de gefilterde TCH-oplossing en ga verder met het protocol. Nu dompel de monsters in ethanol en leg ze in de magnetron te drogen in gesorteerde stappen van 50%70%90%en vervolgens twee keer van 100% ethanol behandeling. Na propyleenoxide uitdroging behandeling, voeg 50%Spurr's hars in de buizen om te beginnen met infiltratie van de wortel tips voor een minimum van twee uur.

Na de laatste incubatie in 100%Spurr's hars, plaats de wortel tips in het inbedden van mallen en vul de mallen met verse 100%Spurr's hars en polymeriseren in een oven op 65 graden Celsius voor 36 tot 48 uur. Gebruik eerst een scheermesje om het gepolymeriseerde monster ruwweg in een dun blok te trimmen. Met de zijkant hebben blootgesteld weefsel naar beneden gericht, bevestig het monster aan het midden van een metalen pin met geleidende epoxy hars om het weefsel het aanraken van de metalen pin.

Plaats het monster in een oven op 65 graden Celsius om de epoxy 's nachts te genezen. In de ochtend, laad de metalen pin in de drager en gebruik een scheermesje om eventuele overtollige epoxy uit het monster te verwijderen. Om het gezicht van het monster verder glad te maken, laadt u de drager met de metalen pin in de houder voor de ultramicrotome.

In de ultramicrotome, gebruik maken van een glas of diamant mes om het gezicht van de zijkanten van het blok vormen van een piramide glad. Zorg ervoor dat ten minste een deel van het weefsel is al blootgesteld op het blok gezicht. Plaats vervolgens het bijgesneden monsterblok in de sputtercoater en pas de instellingen aan op platina op twee tot vijf nanometer om het monster met een dunne laag te coaten.

Plaats de drager in de SBF-SEM microscoop. Breng het diamantmes dicht bij het monsteroppervlak en snijd het bovenste gedeelte van het monster af om de platinalaag te verwijderen en een deel van het weefsel bloot te leggen. Stel vervolgens de versnellingsspanning in op 1,5 tot 2 kilovolt.

Leg een beeld van het weefsel vast en stel een beeldvormingsrun op. Selecteer met Fiji-software bestands,import, beeldreeks en zoek de afbeeldingsstack om de afbeeldingen te laden. Nadat u de afbeelding hebt aangepast aan het manuscript, controleert u de uitlijning door door de gegevensset te bladeren.

Gebruik de opdracht Opslaan onder het bestandsmenu om de uitgelijnde gegevensset op te slaan als een 3D TIFF-bestand. Analyseer de gegevensset zorgvuldig om te zien of ROI is opgenomen en bevat de informatie die nodig is voor de biologische vraag. Op de laatste afbeelding van de stack, het huidige blokgezicht in de SBF-SEM-microscoop, selecteert u een nieuwe ROI voor FIB-SEM.

Na het opnieuw coaten met platina, laad het monster in de FIB-SEM en gebruik de secundaire elektronendetector op 15 kilovolt en een nanoamp om de ROI te lokaliseren die in de SBF-SEM op het blokgezicht is geïdentificeerd. Verplaats en kantel het podium om de ROI op het monster in het toevalspunt van de FIB- en SEM-balken te brengen, met behulp van de FIB-balk en het gasinjectiesysteem. Deponeren een een micrometer beschermende laag van platina op het oppervlak boven de ROI.

Vervolgens, met behulp van een lage freesstroom variërend 50 tot 100 picoamps, molen fijne lijnen in de platina depositie voor autofocus en 3D-tracking tijdens de imaging run. Dan met behulp van een hoge freesstroom van 30 nanoamps, molen een sleuf van 30 micrometer voor de ROI het creëren van de beeldvorming oppervlak voor de SEM balk. Na het gladstrijken van het beeldoppervlak start u de beeldweergaverun en controleert u de stabiliteit van het proces tijdens de eerste 50 tot 100 secties.

Zodra het systeem soepel draait, verlaat u de kamer en zorgt u ervoor dat er zo weinig mogelijk overlast in de kamer is. Beelden van de SBF-SEM geven een overzicht van het weefsel dat inzicht geeft in de ruimtelijke oriëntatie van cellen en intracellulaire verbindingen. De daaropvolgende FIB-SEM beeldvorming op een nieuwe regio voegt hoge resolutie detail van specifieke cellen en structuren.

SBF-SEM gegevens tonen verschillende weergave van de niet-isotropische voxels uit de isotropische voxel FIB-SEM gegevens. SBF-SEM presenteert een trapeffect op het oppervlak, terwijl de FIB-SEM-gegevens met de vijf nanometersecties ervoor zorgen dat de weergave veel gladder lijkt en afzonderlijke secties volledig in het oppervlak opgaan. Dit protocol beschrijft de beeldvorming van een uniek gebied in één monster en elke afwijking van de werkstroom kan schade aan het monster veroorzaken, waardoor het mogelijk is om het gebied van belang te verplaatsen.