Name: Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer axonale groei analyseren in 3D collageen-hydrogels voor neuroontwikkelingsonderzoek met COS-1-cellen en embryonale ratweefsel. Deze methode biedt snelle, eenvoudige observatie van moleculaire effecten op neuronale migratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Tom Padt voor de redactionele advies en M. Segura-Feliu voor de technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door het CERCA-programma en door de Commissie voor universiteiten en onderzoek van het departement innovatie, universiteiten en ondernemingen van de Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Dit werk werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van onderzoek, innovatie en Universiteit (MEICO) door middel van BFU2015-67777-R en en RTI2018-099773-B-100, de Spaanse-netwerk (PRIONET Spanje AGL2017-90665-REDT), en het Instituut Carlos III, CIBERNED ( WRIKKEN-2018-2).

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder de richtlijnen en protocollen van de ethische commissie voor dierproeven (CEEA) van de Universiteit van Barcelona, en het protocol voor het gebruik van knaagdieren in deze studie werd herzien en goedgekeurd door de CEEA van de Universiteit van Barcelona (CEEA goedkeuring #276/16 en 141/15).
1. reiniging van de rat staart collageen
<ol><li>Verzamel volwassen Sprague-Delombaerde rat staarten (8-9 weken oud) na het offeren van het dier na ethische richtlijnen en spoel in 95% ethanol. Plaats 2-4 staarten op ijs (4 °C) en houd ze bedekt met ijs tijdens het proces.</li>
	<li>Voor het verkrijgen van de staart pezen, bevestig de staart op de meest caudale wervels van de staart met behulp van een hemostaat en comprimeren van de staart met een tweede hemostaat geplaatst rond 5-7 mm van de eerste. Breek de staart door het draaien van het scherp met beide hemostats. Om dit te doen, vouwen/ontvouwen de wervels meerdere malen totdat het breekt.</li>
	<li>Trek de wervels langzaam met de hemostaat om de pezen los te koppelen van hun mantel als het naar buiten komt. Op dit moment, gesneden pezen met een kleine schaar. Houd deze pees stukken in een steriele 100 mm Petri schaaltje op ijs.</li>
	<li>Herhaal de klemmen en glijden voor de rest van de staart tot de pezen zijn volledig geëxtraheerd.</li>
	<li>Herhaal stappen 1.2-1.4 voor alle verkregen staarten.</li>
	<li>Observeer de pezen onder een microscoop. Gooi de bloedvaten door te snijden met kleine scharen en holding met rechte fijne tang om de pees zuiverheid te verbeteren en spoel de pezen 3 keer met ultrapuur water.</li>
	<li>Verzamel 3-4 g natte pezen. Los de pezen op in 150 mL van 3% glaciale azijnzuur bij 4 °C in een 200-250 mL glas kegel kolf voor 24-36 h, onder zacht roeren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 20.000 x g voor 1 h. In parallel, de voorbereiding van de dialyse slang membraan door het snijden van een stuk van ongeveer 10-15 cm in lengte en kook het in ultrapuur water met 1 mM ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) voor 15 min. Daarna voorzichtig spoelen het dialyse membraan grondig met ultrapuur water.</li>
	<li>Na centrifugeren, verzamelen de bovendrijvende in de dialyse buis membraan door decantatie. De pellet bevat zure onoplosbare materiaal (niet-collagene eiwitten) en de bovendrijvende bevat oplosbare collageen eiwitten.</li>
	<li>Dialyze de bovendrijvende tegen 2 L steriel 0,1 x minimale essentiële medium Eagle (MEM), pH 4,0 in een 2-5 L glazen beker. Dialyze voor 3 dagen. Verandering 0,1 x MEM oplossing ten minste tweemaal per dag het controleren van de pH bij elke verandering voor gebruik. Als pH is geworden Basic, wijzigen met een paar druppels van 0,1 M azijnzuur tot pH is 4,0.</li>
	<li>Na dialyse, voeg antibiotica (1,5 mL van penicilline/streptomycine (pen-keelontsteking)) aan de dialyzed collageen oplossing. Maak 5 mL hoeveelheid van de collageen stockoplossing en bewaar deze bij 4 °C. Opmerking: Vanaf dit punt moeten alle behandelingsprocedures onder steriele omstandigheden in een laminaire stromings kap worden uitgevoerd.</li>
	<li>
Ga verder met de gelering test van de voor bereide collageen stockoplossing naar aanleiding van de volgende stappen.
	<ol>
<li>Aangezien de voorraad collageen is meestal te geconcentreerd, bereiden 3 werk verdunningen (75%, 50%, en 25% collageen oplossing) door verdunning van de voorraad in 0,1 x MEM, pH 4,0. Het uiteindelijke volume aanbevolen voor elke werkverdunning is 5 mL. In elke voorwaarde, Controleer de eiwitconcentratie gebruikend een eiwit colorimetrische assay.</li>
		<li>Plaats een aantal lege 1,5 mL kegel centrifuge buizen (een voor elke werkende verdunning), 10x MEM tubes, 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en verschillende werk verdunningen van collageen op ijs. Wacht tot deze worden gekoeld.</li>
		<li>Voeg 40-50 µ L van 10x MEM toe aan een koude (4 °C) centrifugebuis. Vervolgens Meng het zachtjes met 7-8 l van natriumbicarbonaat oplossing.</li>
		<li>Voeg 310-330 l van een van de verschillende collageen verdunningen toe aan deze buis en meng het voorzichtig met de pipet om de vorming van bubbels te vermijden. Houd het collageen-MEM-natriumbicarbonaat mengsel op ijs (4 °C) voor minstens 5 min.</li>
		<li>Pipetteer 10-25 l van het mengsel in een 35 mm Petri schaaltje.</li>
		<li>Plaats de Petri schaal in de CO2 incubator ingesteld op 37 °c tot de gelering van de hydrogel (± 15-20 min) wordt waargenomen.</li>
		<li>Herhaal de stappen 1.12.3-1.12.6 voor de resterende collageen verdunningen in verschillende Petri schalen.</li>
		<li>Selecteer de collageen werkverdunning die de beste resultaten oplevert. Opmerking: De beste gegeleerde hydrogel moet een uniform doorschijnend textuur, grijze kleur en mag niet worden bubbel of stringy. In onze ervaring, een verdunning van 3:1 (collageen: 0.1 x MEM) genereert de beste experimentele resultaten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van de cel (COS1) aggregaten genetisch gemodificeerd om een kandidaat-molecuul afscheiden in 3-D collageen hydrogels
<ol><li>Plaat 2 x 106 COS1 cellen in een 35 mm Petri schalen en incubeer met complete kweekmedium, samengesteld uit 100 ml D-mem met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum, 0,5% (WT/vol) glutamine en 1% (WT/vol) pen/keelontsteking in een cel cultuur incubator, om te bereiken 70-80% confluentie 's nachts. Bereid een Petri schaaltje voor elke transfectie procedure.</li>
	<li>
De volgende dag transfect COS1 cellen met de DNA-codering van de kandidaat-molecule (Netrin-1 of Sema3E) met behulp van liposoom-gebaseerde transfectie methode volgens de instructies van de fabrikant.
	<ol>
<li>Om dit te doen, meng 250 µ L van serum-vrij middel en DNA (1-2 μg per voorwaarde) aan een 1,5 mL centrifugebuis (de buis van DNA) en mengeling. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 5 min. bereid een tweede buis (Liposomale buis) door toevoeging van 240 µ L van het serum vrije medium en 10 µ L van de liposomale transfectie reagens. Incubeer bij RT voor 5 min.</li>
		<li>Na incubatie, voeg de inhoud van de DNA-buis aan de liposomale buis en meng zachtjes. Nu Incubeer bij RT 15 min. Vervang het medium op de gekweekte cellen met 1,5 mL van het serum vrije medium en voeg het DNA-liposomen mengsel toe aan de Petri schaal langzaam dropwise. Incubeer voor 3 uur in de CO2 Cell kweek incubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na 3 h van transfectie incubatie, vervang het medium met de volledige cultuurmedium en broeden 's nachts in de incubator.</li>
	<li>Volgende dag, spoel de cellen met 0,1 M Dulbecco fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS), behandel culturen met trypsine-EDTA (800 µ L per schotel voor 5-15 min in de CO2 incubator) en het verzamelen van vrijstaande cellen met 15 ml van de volledige kweekmedium.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 4 °C bij 130 x g voor 5 min. Na centrifugeren, verwijder de media en het behoud van de pellet met COS1 cellen op het ijs.</li>
	<li>Herhaal stappen 1.12.3-1.12.6 om de collageen werkend mengsel voor te bereiden.</li>
	<li>Voeg 100-150 l van het collageen mengsel toe aan de pellet van de transfected cellen en meng zachtjes door op en neer te pipetteren en verspreid 45-50 µ L van dit mengsel op een Petri schaaltje (35 mm diameter) te vormen een uniforme band van collageen-cellen van ongeveer 1-1,5 cm in lengte. Plaats de schotel in de incubator bij 37 °C (5% CO2) tot de gelering (± 15-20 min) wordt waargenomen.</li>
	<li>Bereid een tweede strook met controlecellen (mock transfectie) in een tweede kweekschaal en plaat het in de incubator (± 15-20 min) en wanneer gelering is voltooid toe te voegen 3-4 mL van de opgewarmde (37 ° c) COS1 volledige kweekmedium aan elk gerecht met de gegeleerde collageen-cellen stroken en bewaar ze in de CO2 Cell kweek incubator. Daarna, snijd de collageen-cellen strips te genereren kleine vierkante stukjes (400 tot 500 µm in lengte) met behulp van een fijne scalpel of een tissue Chopper.</li>
	<li>Breng alle secties van dezelfde transfectie voorwaarde om een Petri schaaltje met 3-3,5 mL van neuronale cultuurmedia (NCM) en controleer onder een dissectie Microscoop de kwaliteit van de stukken. Nogmaals, houd ze in de CO2 Cell kweek incubator. Opmerking: Neuronale cultuurmedium bestaat uit Neurobasal medium met 1-5% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd Horse serum, 2 mM glutamine, 0,5% (WT/vol) glucose, 1% (WT/vol) pen-keelontsteking oplossing en 0,044% (WT/vol) NaHCO3. Zorg ervoor dat de pH tussen 7.2-7.3 ligt.</li>
</ol>3. generatie van embryonale explant voor cultuur
<ol><li>Steriliseer de chirurgische hulpmiddelen (schaar, scalpel mes handvat, rechte en gebogen Tang) door autoclaaf volgende routine sterilisatie richtlijnen. Bereid tegelijkertijd 500 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank-glucose buffer en 4-5 Petri schalen (100 mm diameter) die 10 mL Peeters-G bevatten. Leg deze platen op ijs (4 °C).</li>
	<li>Offer de zwangere vrouwelijke rat (embryonale dag 16,5) buiten de steriele gebied, naar aanleiding van de goedgekeurde ethische procedures. Snijd het embryo hoorns met een schaar uit de buikholte en plaats deze in een grote Petri schaaltje met koude Peeters-G.</li>
	<li>Plaats de schotel in de laminaire stromings kap en haal de embryo's met rechte Tang. Plaats ze in een nieuw gerecht met koude Peeters-G. Vervolgens verwijdert u de huid van het embryo met behulp van kleine Tang en zorgvuldig ontleden de hersenen met behulp van de gebogen en rechte Tang. Plaats ze in een schotel met koude Peeters-G.</li>
	<li>Onder een ontleden Microscoop, snijd de hersenen in de helft langs de middellijn te scheiden zowel de halfronden met de scalpel of fijne schaar en verwijder de diencephalon, de meninges en bloedvaten uit de hersenen stukken met fijne Tang.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3.3-3.4 met de rest van de embryo's. Stel de dissectie voor meer dan 2 uur niet uit om de kwaliteit van het weefsel te behouden.</li>
	<li>Reinig alle delen van het weefsel Chopper met 100% ethanol (met name de polytetrafluorethyleen (PTFE) snijplaat en het scheermesje). Houd het weefsel Chopper in de laminaire flux kap onder UV-verlichting voor 15 minuten.</li>
	<li>Breng elk weefsel stuk (b.v., schors met zeepaardje) aan de scherpe plaat van de weefsel Chopper over. Voor Hippocampus, plaats deze loodrecht op het scheermesje en het verkrijgen van weefsel delen van 450-500 µm in dikte.</li>
	<li>Bereid verscheidene 35 mm Petri schotels met 3-4 mL van volledige NCM en overdrachts weefsel stukken van de weefsel Chopper plaat aan de Petri schalen voor. Veel gerechten kunnen nodig zijn als regio's van belang zijn ontleed.</li>
	<li>Afwerking van het weefsel dissectie in de volledige NCM met behulp van fijne Tungsten naalden. Controleer de kwaliteit van de verkregen segmenten onder de ontleden Microscoop. Zorg ervoor dat de lagen duidelijk herkenbaar zijn in de Darkfield optiek en ontleden de regio van belang (bijv. CA regio van de hippocampus) met Tungsten naalden. Beschadigde segmenten verwijderen. Houd hippocampale Explants in complete NCM medium in de CO2 incubator.</li>
</ol>4. voorbereiding van 3-D co-culturen in collageen hydrogels
<ol><li>Plaats verschillende steriele 4-well cultuur platen in de laminaire stroom kap en bereid een collageen werkend mengsel zoals eerder aangegeven in stappen 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Plaats 15-20 l van het hydrogel mengsel in de bodem van een put om een cirkelvormige collageen basis te produceren. Herhaal deze stap voor de rest van de putten. Bereid niet meer dan vijf platen op hetzelfde moment om overmatige vloeibare verdamping te voorkomen van de hydrogel basis.</li>
	<li>Houd de gerechten in de incubator tot de volledige gelering (± 15-20 min) wordt waargenomen en neem de platen uit de incubator alleen wanneer de gelering is voltooid. Controleer de kwaliteit van de gegeleerde collageen.</li>
	<li>Breng een klein stukje COS1 cel aggregaat met een pipet. Plaats het op de hydrogel basis en plaats een tissue stuk op dezelfde basis met een pipet dicht bij het stuk cellen aggregaat op een explant-formaat.</li>
	<li>Bereid een nieuw werkend collageen mengsel op ijs zoals in stappen 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Pipet voorzichtig 15-20 l van dit nieuwe mengsel en bedek het explant en de cel aggregaat. Een sandwich-achtige hydrogel cultuur zal worden waargenomen. Op dit moment, re-oriënteren de explant met een fijne Tungsten naald (niet aanraken van de COS1 cel aggregaat!), zodat het geconfronteerd met de cel aggregaat op ± 500-600 μm.</li>
	<li>Breng de plaat terug naar de incubator tot de gelering wordt waargenomen (± 10-15 min), en 0,5 mL volledige NCM aangevuld met 2% B27 supplement en houd culturen voor 36 tot 48 h in de incubator (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>5. fixatie van explant samenwerking en immunocytochemische procedure
<ol><li>Na 36-48 h van incubatie, verwijder het medium en spoel met 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,3. Daarna, bevestig de culturen voor 1 h met 4% Paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7,3, bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de fixatief en voorzichtig spoelen van de culturen 3-4 keer (10-15 min elk) in 0,1 M PB, pH 7,3.</li>
	<li>Maak de hydrogel sandwich los van de bodem van de put met spatel of Tang. Breng het collageen blok met een fijne penseel naar een 6-well cultuur plaat met 0,1 M PBS met 0,5% niet-ionische wasmiddel.</li>
	<li>Incubeer vrij zwevende hydrogels in de blokkerende oplossing (10% serum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, en 0,2% gelatine in 0,1 M PBS) voor 2-3 h bij RT met zachte agitatie.</li>
	<li>Spoel 3 keer (10-15 min elk) met 0,1 M PBS met 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof.</li>
	<li>Incubeer met primair antilichaam verdund in PBS dat 5% serum bevat, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, 0,2% gelatine, en 0,02% natrium azide. Incubeer met het primaire antilichaam voor 36-48 h bij 4 °C op een shaker. Opmerking: Gewoonlijk wordt een antilichaam tegen klasse III β-tubulin (α-TUJ-1) (verdund 1:2000) gebruikt om de axonale groei in 3-D hydrogel culturen te bepalen.</li>
	<li>Na incubatie, spoelen als in stap 5,5.</li>
	<li>Incubeer met secundair antilichaam voor 4 h bij RT (of 6-7 h bij 4 °C) op een shaker verdund in 5% serum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, en 0,2% gelatine. Een paard anti-muis biotinylated antilichaam (verdunde 1:200) wordt gebruikt in dit experiment.</li>
	<li>Spoel culturen zoals in 5,5.</li>
	<li>Incubatie de culturen voor 2 dagen bij 4 °C met avidin-Biotine complex (ABC) oplossing 1:100 verdund in PBS met 5% serum, 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve stof, en 0,2% gelatine. Als alternatief, gebruik mierikswortelperoxidase (HRP)-tagged streptavidin (verdund 1:300-400) in dezelfde buffer.</li>
	<li>Spoel culturen zoals beschreven in 5,5.</li>
	<li>Spoel de culturen meerdere malen met 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,6 voor 1 uur.</li>
	<li>Incubeer de culturen met 0,03% van 3, 3 ′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (schar) oplossing in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.</li>
	<li>Voeg 5-8 µ L van 1% H2O2 en wacht 10-15 min. monitor de ontwikkeling van DAB onder een microscoop met behulp van een 4-10x doelstelling.</li>
	<li>Stop de reactie door het verwijderen van DAB-oplossing met 0,1 M Tris-HCl buffer, pH 7,6.</li>
	<li>Spoel de culturen in PBS voor 30 min (verscheidene veranderingen).</li>
	<li>Monteer de hydrogels op glazen glijbanen met behulp van op water gebaseerde montage media.</li>
	<li>Analyseer de lengte en distributie van de axonen in de hydrogel met behulp van Sholl analyse plug-in of met NeuriteJ plug-in voor ImageJ software30.</li>
</ol>

<ol><li>Ramón y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B3n+y+Cajal%2C+S+%22Les+nouvelles+id%C3%A9es+sur+la+structure+du+syst%C3%A8me+nerveux+chez+l%27homme+et+chez+les+vert%C3%A9br%C3%A9s%22">Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés</a>. , (1894).</li>
<li>Ramón y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B3n+y+Cajal%2C+S+%22Nuevo+concepto+de+la+histolog%C3%ADa+de+los+centros+nerviosos%22">Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos</a>. , (1893).</li>
<li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+neuronal+cell+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of axon guidance.</a> Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Rosentreter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+navigation+in+substrate-bound+ephrin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients.</a> Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).</li>
<li>Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+mechanisms%3A+semaphorins+as+simultaneous+repellents+and+anti-repellents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents.</a> Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).</li>
<li>Jessell, T. M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development.+The+decade+of+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Development. The decade of the developing brain.</a> Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).</li>
<li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+netrins+define+a+family+of+axon+outgrowth-promoting+proteins+homologous+to+C.+elegans+UNC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6.</a> Cell. 78 (3), 409-424 (1994).</li>
<li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens%3A+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).</li>
<li>Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+transmission+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force transmission in migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).</li>
<li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastellani%2C+VB+%22Protocols+for+Neuronal+Cell+Culture%22">Protocols for Neuronal Cell Culture</a>. , Humana Press Inc. (2001).</li>
<li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).</li>
<li>Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+examining+organotypic+CNS+cultures+with+Nomarski+optics%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics.</a> In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Earliest+sensory+nerve+fibres+are+guided+to+peripheral+targets+by+attractants+other+than+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor.</a> Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).</li>
<li>Chedotal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorins+III+and+IV+repel+hippocampal+axons+via+two+distinct+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors.</a> Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li>
<li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+signaling+in+morphogenesis%2C+neural+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li>
<li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li>
<li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis%3A+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li>
<li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li>
<li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite-J%3A+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li>
<li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix%3A+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li>
<li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-hydroxyproline+%283Hyp%29-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li>
<li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+%28CD11c-CD18%2C+gp150-95%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li>
<li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li>
<li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gels+and+the+%27Bornstein+legacy%27%3A+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De groei van het ontwikkelen van axonen is hoofdzakelijk invasief en omvat ECM degradatie en het remodelleren. Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, kunnen onderzoekers verkrijgen van een homogene 3-D matrix gevormd door de natuurlijke type I collageen waarin axonen (of cellen) kan reageren op een chemische gradiënt afgescheiden door genetisch gemodificeerde cellen zoals ze doen in vivo. Verschillende axonale reacties op gradiënten van aantrekkelijke of remmende cues (eiwitten, lipiden, enz.) kan gemakkelijk w...

Neuronale axonen, eindigend in axonale groei kegels, migreren lange afstanden door de extracellulaire matrix (ECM) van het embryo over specifieke wegen om hun juiste doelen te bereiken. De groei kegel is het distale gedeelte van Axon en het is gespecialiseerd om het fysieke en moleculaire milieu van cel te voelen1,2. Vanuit moleculair oogpunt, worden de groei kegels geleid door minstens vier verschillende moleculaire mechanismen: de aantrekkelijkheid van het contact, chemoattraction, de weerzin van het contact, en chemorepulsion veroorzaakt door verschillende axonale begeleidings cues3,4 , 5 , 6. contact-gemedieerde processen kunnen gedeeltelijk worden bewaakt in twee-dimensionale (2D) culturen op micro-patroon substraten (bijv. met strepen7,8 of spots9 met de moleculen). Nochtans, kunnen axons aan hun doel in een niet-Diffusive manier navigeren door verscheidene aantrekkelijke en weerzinwekkende molecules van guidepost cellen in het milieu4,5,10te ontdekken. Hier beschrijven we een eenvoudige methode van 3-D cultuur om te controleren of een afgescheiden molecuul induceert chemorepulsive of chemoattractive effecten op de ontwikkeling van axonen.
De vroegste studies gericht op het bepalen van de effecten van Axon begeleiding cues gebruikt explant culturen in drie-dimensionale (3-D) matrices te genereren gradiënten simuleren in vivo voorwaarden11,12. Deze aanpak, samen met in vivo experimenten, toegestaan voor de identificatie van vier grote families van oriëntatie cues: netrinse, spleten, semaphorins, en Ephrins4,5,6. Deze moleculaire cues en andere factoren13 zijn geïntegreerd door de groeiende axonen, triggering de dynamiek van adhesie complexen en transducing mechanische krachten via de cytoskelet14,15,16. Voor het genereren van moleculaire gradiënten in 3-D culturen voor axonale navigatie, baanbrekende onderzoekers gebruikt plasma stolsel substraten17, die ook werd gebruikt voor organotypic slice preparaten18. Nochtans, in 1958, werd een nieuw protocol om 3-D collageen hydrogels te produceren gerapporteerd voor het bestuderen met Maximow ´ s apparaten19, een cultuur platform, dat in verscheidene studies geschikt voor microscopische observaties20wordt gebruikt. Een andere pionier studie rapporteerde collageen gel als hulpmiddel om menselijke fibroblasten in te bedden voor het bestuderen van de differentiatie van fibroblasten in myofibroblasten in wond helende processen21. Parallel, Lumsden en Davies paste collageen van de boviene dermis toe om het vermeende effect van de factor van de zenuwgroei (NGF) op het begeleiden van sensorische zenuwvezels te analyseren22. Met de ontwikkeling van nieuwe cultuur platforms (b.v., multi-well platen) door verschillende bedrijven en laboratoria, werden de collageen culturen aangepast aan deze nieuwe apparaten6,23,24,25 ,26. Parallel, werd een uittreksel van ECM materiaal dat uit de Engelbreth-Holm-zwerm tumor cel lijn wordt afgeleid gemaakt commercieel beschikbaar om deze studies uit te breiden27.
Onlangs, zijn verscheidene protocollen ontwikkeld om moleculaire gradiënten met vermeende rollen in axon begeleiding te produceren gebruikend 3-D hydrogels (b.v., collageen, fibrine, enz.) 28. als alternatief kan de kandidaat-molecuul worden gemobiliseerd op verschillende concentratie in een poreuze matrix (BIJV. NGF29) of gegenereerd door kweken in een klein gebied van de 3-D hydrogel cel aggregaten afscheiden van het molecuul om een radiale genereren gradiënt4,23,24,25,26. De laatste mogelijkheid zal worden toegelicht in dit protocol.
De hier gepresenteerde procedure is een eenvoudige, snelle en zeer reproduceerbare methode gebaseerd op de analyse van de axonale groei in 3-D hydrogel culturen van de embryonale muis hersenen. In vergelijking met andere methoden, is het protocol zeer geschikt voor niet-opgeleide onderzoekers en kan volledig worden ontwikkeld na een korte opleiding (1-2 weken). In dit protocol, isoleren we eerst collageen van volwassen rat staarten om verder te genereren 3-D matrices waarin genetisch gemodificeerde cel aggregaten worden gekweekt in de voorkant van de embryonale neuronale weefsel. Deze cel aggregaten vorm radiale chemische gradiënten van een kandidaat-molecuul dat een reactie voor de groeiende axonen ontlokt. Ten slotte kan de evaluatie van de effecten van het molecuul op de groeiende axonen gemakkelijk worden uitgevoerd met behulp van een fasecontrast microscopie of, alternatief, immunocytochemische methoden.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tabletten (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Volwassen Sprague-Dawley ratten (8 tot 9 weken oud)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidine-biotine-peroxidase complex (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumvrij supplement 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) eiwitbepalingskit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>cDNA plasmide vectoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS1-cellijnen</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose (45% oplossing in water) voor compleet Neurobasal-medium</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium 1x ) voor COS1-kweekmedium</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaatgebufferde zoutoplossing 10x (zonder Ca2+ en Mg2++) (D-PBS) voor culturen</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur dihydraat dinatriumzout (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemontagemedium (bijv. Fluoromount-G of soortgelijk)</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Gelatinepoeder&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>IJsazijnzuur (Panreac, cat. nr. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s gebalanceerde zoutoplossing&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>Verhit geïnactiveerd foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>Verhit geïnactiveerd paardenserum&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide (H2O2, 32 tot 33% in water)</td><td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM oplossing (100x) voor compleet Neurobasal en COS1-medium</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Zwangere vrouwelijke muizen (embryonale dag 12,5 tot 16,5; E12,5-16,5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gemodificeerd Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaal antilichaam tegen klasse III &beta;-tubuline (kloon TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>1,040,051,000</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine-oplossing 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing 10x (PBS) voor immunocytochemie</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam: biotinylered paard anti-muis&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>Serumvrij medium (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat-oplossing 7,5%&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Steriele cultuurkwaliteit H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-base&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (Trypsine (0,05% (wt/vol) met EDTA (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Utrusting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 grote en 1 kleine gebogen schaar voor dissectie&nbsp;</td><td>Fine tools Instruments of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL conische centrifugeerbuizen&nbsp;</td><td>Eppendorf of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische centrifugeerbuizen&nbsp;</td><td>Corning of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 hemostaten&nbsp;&nbsp;</td><td>Fine tools Instruments of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 kleine rechte dissectiescharen</td><td>Fine tools Instruments of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL centrifugeerbuizen voor centrifugatie</td><td>Nalgene of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL steriele glazen kegelkolven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 L glazen beker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4- en 6-well kweekplaten&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 en 140675</td><td></td></tr><tr><td>Automatische pijpompen en wegwerpbare 10 mL en 25 mL filterbevattende steriele plastic pipetten.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf of soortgelijk&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische pipetten, steriele filtertips en huidige steriele tips&nbsp;</td><td>Gilson, Eppendorf of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge met hoekvaste rotor&nbsp;</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop gekoelde centrifuge met zwaaiende emmer rotor (met 1,5, 15 en 50 mL buisadapters)</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter of soortgelijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celkweekincubator bij 37 &deg;C, 5% CO2 en 95% lucht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dialysebuis cellulosemembraan</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Dialysebuis afsluitingen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp glas pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissec

generatie van 3-d collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Dit protocol maakt gebruik van natuurlijke type I collageen te genereren drie-dimensionale (3-D) hydrogel voor het toezicht op en het analyseren van de axonale groei. Het protocol is gecentreerd op kweken kleine stukjes van de embryonale of vroege postnatale knaagdieren hersenen in een 3-D hydrogel gevormd door de rat staart pees-afgeleide type I collageen met specifieke porositeit. Weefsel stukken worden gekweekt in de hydrogel en geconfronteerd met specifieke hersen fragmenten of genetisch gemodificeerde cel aggregaten te produceren en afscheiden moleculen geschikt voor het creëren van een gradiënt in de poreuze matrix. De stappen van dit protocol zijn eenvoudig en reproduceerbaar, maar omvatten kritische stappen om zorgvuldig te worden overwogen tijdens de ontwikkeling ervan. Bovendien kan het gedrag van de groeiende axonen direct worden gecontroleerd en geanalyseerd met behulp van een phase-contrast Microscoop of mono/multi foton fluorescentiemicroscoop na fixatie door immunocytochemische methoden.

Hier presenteren we een algemeen toegankelijke methodologie om de axonale groei in 3-D hydrogel collageen culturen van embryonale muis zenuwstelsel studie. Hiertoe isoleerden we collageen van volwassen rat staarten om 3-D matrices te genereren waarin we gekweekte genetisch gemodificeerde cel aggregaten uitdrukken Netrin-1 of Sema3E geconfronteerd met embryonale neuronale weefsel (bijv. CA regio van de hippocampus). Deze cel aggregaten vormden een radiaal verdeelde gradiënt van de kandidaat-molecule binnen de collageen ma...

Hier bieden wij een methode voor het analyseren van het gedrag van de groeiende axonen in 3D-matrices, het nabootsen van hun natuurlijke ontwikkeling.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Deze methode is nuttig om de rol van sommige moleculen in axonale begeleiding en neuronale migratie tijdens de ontwikkeling van het neurosysteem te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de analyse van de resultaten is snel en eenvoudig en vereist geen complexe software die veel training voor onderzoekers zou impliceren. Demonstreren van de procedure zal worden Mirian Segura-Feliu, een technicus van ons laboratorium en ikzelf.Om plaat 200, 000 COS-1 cellen in 35 millimeter Petri schotels te beginnen en met volledig cultuurmiddel in een couveuse van de celkweek te broeden om 70 tot 80% samenvloeiing 's nachts te lezen. Op de volgende dag, om COS-1 cellen transfecteren met het DNA codering van de kandidaat molecuul met behulp van liposoom gebaseerde transfectie methode. Meng eerst 250 microliter serumvrij medium en één tot 2 microgram DNA in een 1,5 milliliter centrifugebuis en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Om een liposomale buis te bereiden, voeg 240 microliter van het serumvrije medium en 10 microliter liposomale transfection reagens toe en broed gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in. Voeg na incubatie de inhoud van de DNA-buis toe aan de lipsomale buis. Meng en broed 15 minuten voorzichtig op kamertemperatuur.Vervang het medium op de gekweekte cellen door 1,5 milliliter van het serumvrije medium. Voeg het DNA liposomen mengsel langzaam en laat verstandig naar de cellen. Incubeer in de koolstofdioxidecel kweek incubator voor drie uur.Na voltooiing van de incubatie, vervang het medium met de volledige cultuur medium en incubeer 's nachts in de couveuse. Spoel de cellen de volgende dag af met PBS van 0,1 molaire Dulbecco. Voeg 800 microliter trypsin EDTA per schotel toe en broed gedurende vijf tot 15 minuten in de koolstofdioxide-incubator.Verzamel losse cellen met twee milliliter van volledig kweekmedium in een 15 milliliter centrifugebuis en voeg 10 milliliter van hetzelfde medium toe. Centrifugeren de cellen op vier graden celsius op 130 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en bewaar de pellet met COS-1 cellen op ijs.Na het bereiden van collageen werkmengsel, voeg 100 tot 150 microliter van het collageen mengsel aan de pellet van de transfected cellen en meng zachtjes door pipetting op en neer. Verspreid 45 tot 50 microliter collageen cel pellet mengsel op een 35 millimeter petrischaaltje om een uniforme band van collageen cellen te vormen, ongeveer een tot 1,5 centimeter lang. Plaats de schotel in de couveuse op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide totdat de gelatie wordt waargenomen.Bereid een tweede strook met controlecellen in een tweede kweekschaal en plaats deze in de couveuse. Wanneer gelatie is voltooid, voeg drie tot vier milliliter van 37 graden celsius opgewarmd COS-1 complete cultuur medium aan elk gerecht met de gelled collageen cel strips en leg ze in de couveuse. Gebruik een fijne scalpel of een weefsel chopper om de collageen cel strips snijden om kleine vierkante stukken te genereren, 400 tot 500 micrometer in lengte.Breng alle secties van dezelfde transfectie conditie naar een petrischaaltje met drie tot 3,5 milliliter van neuronale cultuur media. Controleer onder een ontleedmicroscoop de kwaliteit van de stukken en plaats de gerechten in de couveuse. Gebruik een schaar om embryohoorns te snijden op embryonale dag 16,5 uit de buikholte van een geofferde zwangere vrouwelijke rat en plaats ze in een grote petrischaal met koude HBSSg buffer.Plaats de schotel in de laminaire stroomkap en gebruik rechte tangen om de embryo's te extraheren en plaats ze in een nieuwe schotel met koude HBBSg. Met kleine tangen, verwijder de huid, en vervolgens met gebogen en rechte tangen, zorgvuldig ontleden de hersenen en plaats in een schotel met koude HBSSg. Onder een ontleden microscoop, met behulp van een scalpel of fijne schaar, snijd de hersenen in de helft langs de middellijn om zowel de hemisferen te scheiden.Verwijder vervolgens de diencephalon en verwijder met fijne tangen hersenvliezen en bloedvaten uit de hersendelen. Gebruik 100% ethanol om alle delen van de weefselhakselaar schoon te maken, met name PTFE snijplaat en het scheermesje en houd de weefselhakselaar gedurende 15 minuten in de laminaire fluxkap onder UV-verlichting. Breng elk weefselstuk over op de snijplaat van de weefselhakselaar.Nadat het weefsel is gehakt, breng de stukken van de 35 millimeter petrischaaltjes gevuld met drie tot vier milliliter van volledige NCM. Met behulp van fijne wolfraamnaalden, maak de weefseldissectie in volledige NCM af. Controleer de kwaliteit van de verkregen plakjes onder de ontledenmicroscoop, zorg ervoor dat de lagen duidelijk herkenbaar zijn in de donkere veldoptica en ontleed het gebied van belang met wolfraamnaalden.Bewaar de stukken van goede kwaliteit in een compleet NCM-medium in de koolstofdioxide-incubator. Visuele demonstratie is van cruciaal belang in de stappen in verband met de voorbereiding van de co-culturen die de woorden vergemakkelijkt om het proces te begrijpen. Plaats verschillende steriele vier goed cultuur platen in de laminaire flow kap en bereiden een collageen werken mengsel als voorheen.Voeg 15 tot 20 microliter van het hydrogelmengsel toe aan de bodem van elke put om een cirkelvormige collageenbasis te produceren. Plaats de gerechten in de couveuse totdat volledige gelatie is waargenomen. En controleer de kwaliteit van het gelled collageen.Breng met een pipet een klein stukje COS-1-celaggregaat over op de hydrogelbasis en gebruik vervolgens een pipet om een weefselstuk op dezelfde basis te plaatsen, dicht bij het stuk cellen op een afstand van één explantgrootte. Na het bereiden van een nieuw werkend collageenmengsel op ijs, voorzichtig pipette 15 tot 20 microliter van dit nieuwe mengsel om de explant en het celaggregaat te bedekken, waardoor een sandwich als hydrogelcultuur wordt gemaakt. Gebruik een fijne wolfraam naald om de explant te heroriënteren, zodat het gezicht van de cel aggregaat op 500 tot 600 micrometer.Breng de plaat terug naar de couveuse totdat de gelatie wordt waargenomen en voeg vervolgens 0,5 milliliter complete NCM toe aangevuld met 2%B27-supplement en bewaar culturen gedurende 36 tot 48 uur in de couveuse. Toen hippocampal axonen werden geconfronteerd met Netrin-1, groeiden ze bij voorkeur naar de bron van Netrin-1, wat aangeeft dat Netrin-1 fungeert als een chemo aantrekkelijk molecuul voor deze axonen. In de controlevoorwaarde, of mock transfection, groeiden alle axonen radiaal, zonder enige directionele voorkeur.Toen hippocampal axonen werden geconfronteerd met Sema3E afscheidende cellen, de meeste van hen groeide tegenovergesteld van de cel aggregaat, wat aangeeft dat Sema3E fungeert als een chemo weerzinwekkende molecuul voor deze axonen. Deze schematische weergave van de axonale respons en kwantificeringsmethode toont aan dat in controleomstandigheden de axonen gelijkelijk werden verdeeld in zowel proximale als distale kwadranten, weergegeven met radiale uitgroei. Dit duidde op een proximale distale of PD-verhouding van één.Toen explants een toename van het aantal axonen in het proximale kwadrant vertoonden in vergelijking met het distale, wat duidt op chemo-aantrekkingskracht, was de PD-verhouding groter dan één. Toen het aantal axonen hoger was in het distale kwadrant dan in het proximale kwadrant, wat duidt op chemoafstoting, was de PD-verhouding lager dan één. Volgens deze methode kunnen onderzoekers essentiële informatie verkrijgen over de rol van sommige moleculen tijdens de neuronale ontwikkeling, waardoor we een startpunt kunnen maken om de functies verder te verkennen.Hoewel deze techniek nuttig is in neuronale ontwikkeling als dit is, kan het ook worden toegepast in farmacologische screening, angiogenese, en weefsel engineering als strategieën.

generation-3-d-collagen-based-hydrogels-to-analyze-axonal-growth

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode wordt beschreven voor de bereiding van een 3-dimensionale matrix van collageen type I en primaire humane fibroblasten. Deze organotypische gel dient als nuttige substraat invasieve celmigratie beoordelen omdat het bootst basiskenmerken van weefsel stroma en vatbaar is voor vele vormen van microscopie.

Organotypische Collageen I Assay: een Smeedbaar Platform to Cell Gedrag beoordelen in een 3-dimensionale Context

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor...

Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays

This video demonstrates a method to generate three-dimensional astrocyte scaffolds within hydrogel micro-columns. The inside of the microcolumns are coated with collagen. Astrocytes are introduced, which adhere to collagen and, with further incubation, self-assemble into a three-dimensional scaffold.

An In Vitro Method to Generate Astrocyte Scaffolds within Hydrogel Micro-columns

In dit werk presenteren we een techniek voor de snelle fabricage van levend vasculair weefsel door directe cultivatie van collageen, gladde spiercellen en endotheelcellen. Daarnaast wordt een nieuw protocol beschreven voor de mechanische karakterisering van gefabriceerd vasculair weefsel.

Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Inzicht in de complexe werkingen van de hersenen vereist geavanceerde onderzoeksinstrumenten. Hier demonstreren we een nieuwe op zijde-collageen gebaseerd 3D-geengineerd model van zenuwweefsel dat lijkt op een hersen-achtige architectuur. Het model kan worden gebruikt om de assemblage van neuronale netwerken, axongeleide, cel-cel interacties en elektrische activiteit te bestuderen.

Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.

Voorbereiding van de 3D Collageen Gels en Microkanalen voor de Studie van 3D-Interacties<em&gt; In Vivo</em

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.

Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation

In dit manuscript demonstreren we de bereiding van een biohybride hydrogel bioink met grafeen voor gebruik in perifere tissue engineering. Met behulp van dit 3D-biohybride materiaal wordt het neurale differentiatieprotocol van stamcellen uitgevoerd. Dit kan een belangrijke stap zijn om vergelijkbare biomaterialen naar de kliniek te brengen.

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (&lt; 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.

Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning

Leer axonale groei analyseren in 3D collageen-hydrogels voor neuroontwikkelingsonderzoek met COS-1-cellen en embryonale ratweefsel. Deze methode biedt snelle, eenvoudige observatie van moleculaire effecten op neuronale migratie.

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel (Video) | JoVE Journal

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Meer video's verkennen