Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

Deze methode is nuttig om de rol van sommige moleculen in axonale begeleiding en neuronale migratie tijdens de ontwikkeling van het neurosysteem te analyseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de analyse van de resultaten is snel en eenvoudig en vereist geen complexe software die veel training voor onderzoekers zou impliceren. Demonstreren van de procedure zal worden Mirian Segura-Feliu, een technicus van ons laboratorium en ikzelf.

Om plaat 200, 000 COS-1 cellen in 35 millimeter Petri schotels te beginnen en met volledig cultuurmiddel in een couveuse van de celkweek te broeden om 70 tot 80% samenvloeiing 's nachts te lezen. Op de volgende dag, om COS-1 cellen transfecteren met het DNA codering van de kandidaat molecuul met behulp van liposoom gebaseerde transfectie methode. Meng eerst 250 microliter serumvrij medium en één tot 2 microgram DNA in een 1,5 milliliter centrifugebuis en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Om een liposomale buis te bereiden, voeg 240 microliter van het serumvrije medium en 10 microliter liposomale transfection reagens toe en broed gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in. Voeg na incubatie de inhoud van de DNA-buis toe aan de lipsomale buis. Meng en broed 15 minuten voorzichtig op kamertemperatuur.

Vervang het medium op de gekweekte cellen door 1,5 milliliter van het serumvrije medium. Voeg het DNA liposomen mengsel langzaam en laat verstandig naar de cellen. Incubeer in de koolstofdioxidecel kweek incubator voor drie uur.

Na voltooiing van de incubatie, vervang het medium met de volledige cultuur medium en incubeer 's nachts in de couveuse. Spoel de cellen de volgende dag af met PBS van 0,1 molaire Dulbecco. Voeg 800 microliter trypsin EDTA per schotel toe en broed gedurende vijf tot 15 minuten in de koolstofdioxide-incubator.

Verzamel losse cellen met twee milliliter van volledig kweekmedium in een 15 milliliter centrifugebuis en voeg 10 milliliter van hetzelfde medium toe. Centrifugeren de cellen op vier graden celsius op 130 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en bewaar de pellet met COS-1 cellen op ijs.

Na het bereiden van collageen werkmengsel, voeg 100 tot 150 microliter van het collageen mengsel aan de pellet van de transfected cellen en meng zachtjes door pipetting op en neer. Verspreid 45 tot 50 microliter collageen cel pellet mengsel op een 35 millimeter petrischaaltje om een uniforme band van collageen cellen te vormen, ongeveer een tot 1,5 centimeter lang. Plaats de schotel in de couveuse op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide totdat de gelatie wordt waargenomen.

Bereid een tweede strook met controlecellen in een tweede kweekschaal en plaats deze in de couveuse. Wanneer gelatie is voltooid, voeg drie tot vier milliliter van 37 graden celsius opgewarmd COS-1 complete cultuur medium aan elk gerecht met de gelled collageen cel strips en leg ze in de couveuse. Gebruik een fijne scalpel of een weefsel chopper om de collageen cel strips snijden om kleine vierkante stukken te genereren, 400 tot 500 micrometer in lengte.

Breng alle secties van dezelfde transfectie conditie naar een petrischaaltje met drie tot 3,5 milliliter van neuronale cultuur media. Controleer onder een ontleedmicroscoop de kwaliteit van de stukken en plaats de gerechten in de couveuse. Gebruik een schaar om embryohoorns te snijden op embryonale dag 16,5 uit de buikholte van een geofferde zwangere vrouwelijke rat en plaats ze in een grote petrischaal met koude HBSSg buffer.

Plaats de schotel in de laminaire stroomkap en gebruik rechte tangen om de embryo's te extraheren en plaats ze in een nieuwe schotel met koude HBBSg. Met kleine tangen, verwijder de huid, en vervolgens met gebogen en rechte tangen, zorgvuldig ontleden de hersenen en plaats in een schotel met koude HBSSg. Onder een ontleden microscoop, met behulp van een scalpel of fijne schaar, snijd de hersenen in de helft langs de middellijn om zowel de hemisferen te scheiden.

Verwijder vervolgens de diencephalon en verwijder met fijne tangen hersenvliezen en bloedvaten uit de hersendelen. Gebruik 100% ethanol om alle delen van de weefselhakselaar schoon te maken, met name PTFE snijplaat en het scheermesje en houd de weefselhakselaar gedurende 15 minuten in de laminaire fluxkap onder UV-verlichting. Breng elk weefselstuk over op de snijplaat van de weefselhakselaar.

Nadat het weefsel is gehakt, breng de stukken van de 35 millimeter petrischaaltjes gevuld met drie tot vier milliliter van volledige NCM. Met behulp van fijne wolfraamnaalden, maak de weefseldissectie in volledige NCM af. Controleer de kwaliteit van de verkregen plakjes onder de ontledenmicroscoop, zorg ervoor dat de lagen duidelijk herkenbaar zijn in de donkere veldoptica en ontleed het gebied van belang met wolfraamnaalden.

Bewaar de stukken van goede kwaliteit in een compleet NCM-medium in de koolstofdioxide-incubator. Visuele demonstratie is van cruciaal belang in de stappen in verband met de voorbereiding van de co-culturen die de woorden vergemakkelijkt om het proces te begrijpen. Plaats verschillende steriele vier goed cultuur platen in de laminaire flow kap en bereiden een collageen werken mengsel als voorheen.

Voeg 15 tot 20 microliter van het hydrogelmengsel toe aan de bodem van elke put om een cirkelvormige collageenbasis te produceren. Plaats de gerechten in de couveuse totdat volledige gelatie is waargenomen. En controleer de kwaliteit van het gelled collageen.

Breng met een pipet een klein stukje COS-1-celaggregaat over op de hydrogelbasis en gebruik vervolgens een pipet om een weefselstuk op dezelfde basis te plaatsen, dicht bij het stuk cellen op een afstand van één explantgrootte. Na het bereiden van een nieuw werkend collageenmengsel op ijs, voorzichtig pipette 15 tot 20 microliter van dit nieuwe mengsel om de explant en het celaggregaat te bedekken, waardoor een sandwich als hydrogelcultuur wordt gemaakt. Gebruik een fijne wolfraam naald om de explant te heroriënteren, zodat het gezicht van de cel aggregaat op 500 tot 600 micrometer.

Breng de plaat terug naar de couveuse totdat de gelatie wordt waargenomen en voeg vervolgens 0,5 milliliter complete NCM toe aangevuld met 2%B27-supplement en bewaar culturen gedurende 36 tot 48 uur in de couveuse. Toen hippocampal axonen werden geconfronteerd met Netrin-1, groeiden ze bij voorkeur naar de bron van Netrin-1, wat aangeeft dat Netrin-1 fungeert als een chemo aantrekkelijk molecuul voor deze axonen. In de controlevoorwaarde, of mock transfection, groeiden alle axonen radiaal, zonder enige directionele voorkeur.

Toen hippocampal axonen werden geconfronteerd met Sema3E afscheidende cellen, de meeste van hen groeide tegenovergesteld van de cel aggregaat, wat aangeeft dat Sema3E fungeert als een chemo weerzinwekkende molecuul voor deze axonen. Deze schematische weergave van de axonale respons en kwantificeringsmethode toont aan dat in controleomstandigheden de axonen gelijkelijk werden verdeeld in zowel proximale als distale kwadranten, weergegeven met radiale uitgroei. Dit duidde op een proximale distale of PD-verhouding van één.

Toen explants een toename van het aantal axonen in het proximale kwadrant vertoonden in vergelijking met het distale, wat duidt op chemo-aantrekkingskracht, was de PD-verhouding groter dan één. Toen het aantal axonen hoger was in het distale kwadrant dan in het proximale kwadrant, wat duidt op chemoafstoting, was de PD-verhouding lager dan één. Volgens deze methode kunnen onderzoekers essentiële informatie verkrijgen over de rol van sommige moleculen tijdens de neuronale ontwikkeling, waardoor we een startpunt kunnen maken om de functies verder te verkennen.

Hoewel deze techniek nuttig is in neuronale ontwikkeling als dit is, kan het ook worden toegepast in farmacologische screening, angiogenese, en weefsel engineering als strategieën.