Name: Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer een snelle methode voor het analyseren van disulfide-gestabiliseerde eiwitcomplexen met niet-verminderende SDS-PAGE in U-2 OS-cellen. Deze techniek maakt snelle identificatie van multimeren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij waarderen de inspanningen naar voren gebracht door Dr Jennifer Fischer voor de reiniging van de dUTPase polyclonal antilichaam en Kerri Ciccaglione voor al haar inspanningen om te helpen dit manuscript te bewerken. Dit onderzoek werd deels ondersteund door een subsidie van de New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

1. het blokkeren van vrije cysteïne residuen gebruikend Iodoacetamide
<ol><li>Grow U-2 OS cellen in een 6 cm2 schotel tot 50%-60% conﬂuency in minimale essentiële medium met een hoge glucose met 10% foetale boviene serum en 1% natrium pyruvaat bij 37 ° c in 5% Co2.</li>
	<li>Maak een verse voorraad van 10 mM iodoacetamide net voor gebruik, dan gooi alle ongebruikte reagens.</li>
	<li>Voeg 0,1 mM definitieve concentratie iodoacetamide rechtstreeks aan de cel cultuurmedia. Zachtjes Rock de schotel bij kamertemperatuur voor 2 min.</li>
</ol>2. het oogsten van de cellen
<ol><li>Aspireren de media uit de cellen.</li>
	<li>Was drie maal de cellen met 5 mL koud fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Aspireren de definitieve PBS was oplossing Voeg dan 1 mL koude PBS toe.</li>
	<li>Schraap de cellen uit de bodem van de schotel met behulp van een cel schraper. Met behulp van een 1 mL Pipet de PBS en de cel schorsing en afzien van alle vloeistof in een 1,5 mL micro centrifugebuis.</li>
	<li>Draai de cellen op 7.500 x g gedurende drie minuten bij 4 °c. Aspireren de PBS, waardoor de cel pellet achter. De cel pellet kan worden opgeslagen bij-80 °C tot de verwerking</li>
</ol>3. extractie van eiwitten
<ol><li>Bereid 100 µ L van een 1x lysis buffer verdund in ddH2O (Zie de lijst van materialen). Voeg phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) onmiddellijk voor gebruik toe aan een eindconcentratie van 1 mM.</li>
	<li>Voeg 50 µ L van de 1x lysis buffer rechtstreeks aan Cell pellet en suspend. Incubeer dit op ijs voor 5 min.</li>
	<li>Bewerk voor 8 s met behulp van de constante Pulse Mode op 40% (Zie tabel van materialen voor geen ultrasoonapparaat; pas als nodig is voor verschillende sonicators), waarbij het extract op ijs.</li>
	<li>Draai het extract bij 4 °C gedurende 5 min bij 16.000 x g. De bovendrijvende is de oplosbare eiwitfractie. De analyse van Bradford kan worden uitgevoerd om eiwitconcentratie te bepalen indien gewenst.</li>
</ol>4. monstervoorbereiding
<ol><li>Neem 10 µ L van het oplosbare eiwit extract en voeg 10 µ L van een 1x Laemmli SDS-sample buffer toe (4% SDS, 20% glycerol, 0,004% bromophenol blauw, en 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Voeg geen reductie reagentia toe.</li>
	<li>Houd monsters op ijs als SDS-pagina analyse zal worden uitgevoerd die dag; voor opslag op lange termijn,-20 °C is aangewezen. Vlak voor het uitvoeren van de gel, verwarm het monster voor 5 min bij 85 ° c.</li>
</ol>5. in vivo formaldehyde cross-linking van endogene eiwitten in U-2 OS cellen
<ol><li>Kweek U-2 OS cellen in een 175 cm2 kolf tot 70% – 80% conﬂuency (zie sectie 1).</li>
	<li>
Voer de formaldehyde crosslinking reactie
	<ol>
<li>In een rook kap, een hoeveelheid van 37% formaldehydeoplossing gekocht van commerciële bronnen. Voeg de formaldehyde fixatief direct toe aan het medium tot een ﬁnal concentratie van 1% en broed op kamertemperatuur met zachte agitatie gedurende 15 min.</li>
		<li>Om de reactie te doven, voeg 1,25 M glycine tot een definitieve concentratie van 0,125 M en Incubeer bij kamertemperatuur met zachte agitatie op een tuimelschakelaar voor 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de cellen met 5 mL koude PBS drie keer. Aspireren de laatste PBS Wash oplossing en voeg 10 mL PBS. Schraap de cellen uit de bodem van de kolf met behulp van een cel schraper.</li>
	<li>Maak met behulp van een pipet van 10 mL de PBS-en cel ophanging en verdeel alle vloeistof in een kegelvormige centrifugebuis van 15 mL. Draai de cellen bij 500 x g voor 2 min bij 4 °c. Aspireren de PBS, waardoor de cel pellet achter.</li>
</ol>6. fractionering van kernen
<ol><li>Bereid 10 mL homogenisering buffer: 0,25 M sacharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, en 0,5% BSA bij pH 7,4. Voeg PMSF onmiddellijk voor gebruik toe aan een 1 mM eindconcentratie en 3mL van kernen Suspension buffer (0,1% Triton X-100 in PBS).</li>
	<li>Voeg 5 mL homogenisering buffer rechtstreeks aan de cel pellet en suspend volledig. Centrifugeer de suspensie bij 500 x g gedurende 2 min bij 4 °c en verwijder vervolgens de bovendrijvende.</li>
	<li>Suspendeer de pellet in 5 mL homogenisering buffer. Gebruik een strakke glas-Teflon homogeniseer, dounce Meng cellen op 10 slagen/500 rpm.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie bij 1.500 x g gedurende 10 min bij 4 °c, en gooi de bovendrijvende. Opmerking: Gebruik de bovendrijvende voor isolatie van mitochondriën door centrifugeren bij 10.000 x g voor 10 min.</li>
	<li>Schors de pellet in 1 mL kernen schorsing buffer en incubeer op ijs voor 10 min.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g voor 10 min. Gooi de bovendrijvende weg.</li>
	<li>Suspendeer de pellet in 1 mL kernen suspensie buffer en centrifugeer opnieuw. Verwijder de bovendrijvende. De laatste pellet zal worden geïsoleerde kernen.</li>
</ol>7. extractie van eiwitten
<ol><li>Herhaal sectie 4, behalve het toevoegen van 25 µ L van de 1x lysis buffer rechtstreeks aan de cel pellet dan schorsen.</li>
</ol>8. monstervoorbereiding
<ol><li>Bereid twee monsters voor SDS-pagina door het nemen van 10 µ L elk van de oplosbare eiwit extract en voeg 10 µ L van 2x Laemmli SDS-sample buffer en 1 µ L van 2-mercaptoethanol (BME).</li>
	<li>Verwarm één steekproef voor 5 min bij 37 °C en het tweede monster 15 min bij 98 °C om de formaldehyde dwarsverbinding om te keren.</li>
</ol>9. SDS-pagina analyse
<ol><li>Bereid 1 L van 1x tris-Glycine lopende buffer voor (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS).</li>
	<li>
Stel de SDS-pagina lopende apparaten in. Nota: dit protocol gebruikt een 16% geprefabriceerde TGX sds-pagina. Van de nota, een percentage gel kan worden gebruikt.<ol>
<li>Per de fabrikant protocol, open het pakket de gel is opgeslagen in en verwijder de cassette.</li>
		<li>Verwijder de kam die langs de putten en de tape van de onderkant van de cassette.</li>
		<li>Plaats de gel in het lopende apparaat.</li>
		<li>Vul de kamer met de 1x lopende buffer tot de putten zijn ondergedompeld in vloeistof. Met behulp van een plastic pipet, spoel de putten met de running buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laad de monsters op de gel, samen met 10 µ L voorbevlekt standaard marker.</li>
	<li>Voer de gel op 200 V tot de kleurstof voorkant is ongeveer 1 cm van de onderkant van de gel.</li>
</ol>10. westelijke vlek
<ol><li>Bereid 1 L van 1x overdrachts buffer voor (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% methanol) en bewaar bij 4 °C tot het gebruik.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de gel en open de cassette. Met behulp van een scheermes, zorgvuldig knippen en ontdoen van de stapelen gel. Pick-up van de gel met behulp van een hoek en plaats deze in een lade met overdracht buffer, waardoor het zachtjes Rock voor 5 min.</li>
	<li>Terwijl de gel schommelt, plaats een ijs blok (opgeslagen in-20 ° c) in de transfer tank en voeg de overdracht buffer om ¾ volledige.</li>
	<li>NAT de polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan door te weken in 100% methanol voor 30 s.</li>
	<li>Zodra de 5 min zijn verstreken, voor te bereiden op het opzetten van de overdracht in een lade met overdracht buffer. De overdrachts buffer zou genoeg moeten zijn om de vlek volledig onder te dompelen. Stel de Blot-overdracht als volgt in: onderaan de cassettehouder (zwart); dan een dikke spons, extra dik vloeipapier, de Polyacrylamide gel, een PVDF membraan, extra dik vloeipapier, en een dikke spons; dan eindelijk de top van de cassettehouder (wit) aan de bovenkant.</li>
	<li>Vergrendel de cassette en plaats het apparaat in de transfer tank met het PVDF membraan naar de positieve anode en de gel naar de negatieve. Bovenkant van de eenheid met overdrachts buffer tot uw overdracht volledig wordt ondergedompeld.</li>
	<li>Plaats het apparaat op de top van een roer plaat. Voeg een roer bar aan het apparaat en beginnen roeren op 125 rpm.</li>
	<li>Looppas bij 100 V voor 60 min.</li>
	<li>Terwijl de overdracht wordt uitgevoerd, bereiden een oplossing van 5% poedermelk opgelost in tris-gebufferde zoutoplossing, met tween-20, pH 7,5 (TBST).</li>
	<li>Demonteer het apparaat en verwijder het membraan, wijzend op welke kant in contact met de gel was; Zorg ervoor dat deze kant blijft in de lade voor de resterende stappen.</li>
	<li>Week het membraan voor 2 min in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), gevolgd door het blokkeren van het membraan door incubatie in 5 mL van 5% melk-TBST oplossing voor 30 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Vervang de melk met een verse 4 mL van 5% melk-TBST oplossing en voeg het primaire antilichaam bij de juiste verdunning (in dit geval, onze verdunning is 1:2000 voor de dUTPase antilichaam) en incubeer 's nachts met zachte schommelen bij 4 ° c.</li>
	<li>De volgende dag, verwijder de vlek van de 4 °C tuimelschakelaar aan een tuimelschakelaar van de ruimtetemperatuur, die de primaire antistof oplossing verwijdert.</li>
	<li>Doe drie snel wast met TBST, met behulp van voldoende vloeistof om volledig onder de Blot, gevolgd door 3 wasbeurten, 5 min elk, langzaam schommelen.</li>
	<li>Na de laatste wasbeurt, voeg 5 mL van de 5% melk-TBST oplossing en rock de vlek voor 15 min dan weggooien.</li>
	<li>Voeg secundair antilichaam verdund in 5% melk-TBST bij de gewenste concentratie. (In dit geval 1:5000 verdunning van geiten anti-konijn verdund in 5 mL van 5% melk-TBST oplossing)</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur, schommelen voor 1 uur, dan gooi de oplossing.</li>
	<li>Doe drie snelle wast met TBST, gevolgd door 3 wasbeurten, 5 min elk, schommelen langzaam, dan gooi de laatste wasbeurt en voeg 5 mL TBS.</li>
	<li>Bereid een 1:1 mengsel van een ECL chemiluminescentie detectie-oplossingen (1 mL van elk reagens voor een laatste volume van 2 mL) en voeg dit rechtstreeks aan de vlek incubatie voor 1 minuut.</li>
	<li>Verwijder het membraan met een pincet en DEP de hoek met een laboratorium vegen, het verwijderen van overtollige oplossing. Plaats het membraan in shrink wrap en plaats het eiwit kant in een x-ray cassette.</li>
	<li>Bloot het membraan aan x-ray film. Het tijdstip van de blootstelling zal variëren.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen belangenverstrengeling hebben met de inhoud van dit manuscript.

De hier geschetste methode geeft een rechttoe rechtaan protocol voor de analyse van multimeric complexen gestabiliseerd door disulfide verbanden. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen cultuurlijnen, weefsels en organismen waardoor een breed scala van toepassingen.
Een belangrijke stap in deze procedure is ervoor te zorgen dat de disulfide verbanden geen gevolg zijn van de extractie procedure. Elke vrije cysteïne residuen kunnen worden geblokkeerd met behulp van iodoac...

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. In recent werk, deze band is ook geclassificeerd als een omkeerbare post-translationele modificatie, als een cysteïne-gebaseerde "redox switch" waardoor de modulatie van de eiwitfunctie, locatie en interactie1,2, 3,4. Zo is het belangrijk om deze wijziging te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door niet-vermindert SDS-pagina analyse5. SDS-pagina analyse is een techniek die in vele laboratoria wordt gebruikt, waar de resultaten kunnen worden verkregen en worden geïnterpreteerd snel, gemakkelijk, en met minimale kosten, en is voordelig over andere technieken die worden gebruikt om disulfide aaneenschakelingen zoals massaspectrometrie 6 te identificeren ,7 en circulaire dichroism8.
Een belangrijke stap in het bepalen of deze methode is een geschikte techniek om te helpen bij een studie is om grondig te onderzoeken de primaire sequentie van het eiwit van belang te verzekeren zijn er cysteïne residu (s) aanwezig. Een andere nuttige stap moet om het even welke vorige gepubliceerde kristalstructuren onderzoeken of een bioinformatica toepassing gebruiken om de driedimensionele structuur van de proteïne van belang te onderzoeken om te visualiseren waar het cysteïne residu (s) kan worden gevestigd. Als het residu (s) aanwezig is op de buitenkant kan het een betere kandidaat om een disulfide koppeling in plaats van een cysteïne residu begraven op de binnenkant van de structuur te vormen. Het is echter belangrijk op te merken dat eiwitten structurele veranderingen kunnen ondergaan op substraat interacties of eiwit-Eiwitinteracties waardoor deze residuen vervolgens worden blootgesteld aan het milieu ook.
Geïdentificeerde multimeric complexen kan vervolgens worden geverifieerd met chemische cross-linking met behulp van formaldehyde. Formaldehyde is een ideale cross-linker voor deze verificatie techniek als gevolg van de hoge cel permeabiliteit en korte cross-linking span van ~ 2-3 Å, zorgen voor de opsporing van specifieke eiwit-Eiwitinteracties9,10. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS11. Dit protocol kan echter worden aangepast voor andere cel lijnen, weefsels en organismen.

<table><tbody><tr><td>16% precast TGX gels</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 Flask</td><td>Cell star</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 dish</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL detection kit</td><td>GE</td><td>16817200</td><td></td></tr><tr><td>Blot transfer apparatus</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein reagent</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blauw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Cell signaling</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Cell lysis buffer</td><td>Cell signaling</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis apparatus</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Extra thick western blotting paper</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Glass-teflon homogenisator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloridezuur</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell signaling</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-click tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Prestained marker</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Cell signaling</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Small cell scraper</td><td>Tygon</td><td>S-50HL class VI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Sponge pad voor blotting</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Stir plate</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline, met Tween 20, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine running buffer</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

het combineren van niet-vermindert sds-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

De structuren van vele proteïnen worden gestabiliseerd door covalente disulfide aaneenschakelingen. In recent werk is deze obligatie ook geclassificeerd als een post-translationele modificatie. Zo is het belangrijk om deze modificatie in levende cellen te kunnen bestuderen. Een eenvoudige methode om deze cysteïne-gestabiliseerde multimeric complexen te analyseren is door een methode in twee stappen van niet-vermindert SDS-pagina analyse en formaldehyde het cross-linking. Deze methode in twee stappen is voordelig als de eerste stap aan het blootleggen multimeric complexen die door disulfide aaneenschakelingen worden gestabiliseerd toe te schrijven aan zijn technisch gemak en lage kosten van verrichting. Hier, de Human Bone Osteosarcoom Cell line U-2 OS wordt gebruikt om deze methode te illustreren door specifiek analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase.

Nucleaire dUTPase vormt een intermoleculaire disulfide koppeling vormen een stabiele dimeer configuratie door de interactie van twee cysteïne residuen gepositioneerd op het derde aminozuur van elk monomeer eiwit11. Dit wordt aangetoond in Figuur 1a, B. Om ervoor te zorgen dat deze disulfide koppeling was niet een niet-specifieke interactie als gevolg van migratie afwijkingen in de niet-verminderde omgeving, t de opnemi...

Disulfide verbanden zijn al lang bekend om de structuur van veel eiwitten te stabiliseren. Een eenvoudige methode om multimeric complexen te analyseren die door deze aaneenschakelingen worden gestabiliseerd is door niet-vermindert SDS-pagina analyse. Hier wordt deze methode geïllustreerd door het analyseren van de nucleaire isovorm van dUTPase van het menselijk bot Osteosarcoom Cell line U-2 OS.

Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Het is goed vastgesteld dat de structuren van veel eiwitten zijn gestabiliseerd in covalente disulfide koppelingen. In recent werk is deze band geclassificeerd als een post-translationele wijziging. Het is dus belangrijk om cysteïne gestabiliseerde multimercomplexen in levende cellen te kunnen identificeren met behulp van een methode die snel en eenvoudig is.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de resultaten snel, gemakkelijk en met minimale kosten kunnen worden verkregen en geïnterpreteerd. Om te beginnen, groeien U-2 OS cellen in een schaal van zes vierkante centimeter in Minimum Essential Medium High Glucose, aangevuld met 10%FBS en 1% natrium pyruvaat bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide. Maak een verse voorraad van 10 millimolar iodoacetamide net voor gebruik.Nadat cellen 50 tot 60% samenvloeiing bereiken, voeg 0.1 millimolar definitieve concentratie iodoacetamide direct aan de celkweekmedia toe. Wieg de schotel zachtjes op kamertemperatuur gedurende twee minuten. Vervolgens, aspirate de media uit de cellen, en was de cellen met vijf milliliter koude PBS drie keer.Aspirate de laatste PBS wasoplossing, en voeg een milliliter koude PBS. Schraap de cellen van de bodem van de schotel met behulp van een cel schraper. Met behulp van een pipet van één milliliter stelt u de PBS- en celsuspensie op en geeft u alle vloeistof in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Draai de cellen op 7, 500 keer g in vier graden Celsius gedurende drie minuten. Aspirate de PBS verlaten van de cel pellet achter. De celpellet kan worden opgeslagen bij min 80 graden Celsius tot de verwerking.Om het eiwit te extraheren, bereid 100 microliter van een 1X lyse buffer verdund in dubbel gedestilleerd water. Voeg PMSF onmiddellijk voor gebruik toe aan een uiteindelijke concentratie van één millimolar. Voeg vervolgens 50 microliter van de 1X lyse buffer direct toe aan de celpellet en schort deze opnieuw op.Broed het extract vijf minuten op ijs. Sonicate gedurende acht seconden met behulp van de constante pulsmodus op 40%houden van het extract op ijs. Draai het extract vijf minuten lang op vier graden Celsius en 16.000 g.Voer Bradford analyse uit om de eiwitconcentratie te bepalen indien gewenst. Voor de bereiding van het monster neem 10 microliter van de oplosbare eiwit extract en voeg 10 microliter van een 1X Laemmli SDS monster buffer. Hou de monsters op ijs.Verwarm het monster vijf minuten op 85 graden Celsius voordat u de gel uitvoert. Om te beginnen met de formaldehyde cross-linking, groeien U-2 OS cellen in een 175 vierkante centimeter fles tot 70 tot 80%samenvloeiing. Voeg in een rookkap het formaldehyde fixatief direct toe aan het medium tot een uiteindelijke concentratie van 1% en broed het 15 minuten bij kamertemperatuur uit met zachte agitatie.Om de reactie te blussen voeg 1,25 molar glycine toe aan een laatste concentratie van 0,125 molar en incubaal op kamertemperatuur met zachte agitatie op een tuimelschakelaar gedurende vijf minuten. Was de cellen met vijf milliliter koude PBS drie keer. Spoel de uiteindelijke PBS wasoplossing aan en voeg 10 milliliter PBS toe.Schraap de cellen van de bodem van de kolf met behulp van een cel schraper. Met behulp van een 10-milliliter pipet opstellen van de PBS en cel suspensie en alle vloeistof in een 15-milliliter conische centrifuge buis. Draai de cellen op 500 keer g en vier graden Celsius gedurende twee minuten.Aspirate de PBS verlaten van de cel pellet achter. Bereid 10 milliliter van de homogenisatiebuffer door 0,25 molaire sacharose, een millimolar EDTA, 10 millimolar HEPES en 0,5% BSA toe te voegen bij pH 7,4. Voeg vlak voor gebruik PMSF toe aan een eindconcentratie van één millimolar en drie milliliter van de nuclei's ophangingsbuffer.Voeg vijf milliliter van de homogenisatiebuffer direct toe aan de celpellet en volledig opnieuw te besteden. Centrifuge de suspensie op 500 keer g en vier graden Celsius gedurende twee minuten. Gooi na centrifugatie de supernatant weg en verleg de pellet in vijf milliliter van de homogenisatiebuffer.Dan met een strak passend glas Teflon homogenizer dounce homogeniseren de cellen op 10 slagen per 500 RPM en centrifugeren de suspensie op 1, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na centrifugatie gooi de supernatant. Resuspend de pellet in een milliliter van de kernen suspensie buffer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.Na de incubatie, centrifugeren op 600 keer g gedurende 10 minuten. Gooi na de centrifugatie de supernatant weg, verdring de pellet opnieuw in één milliliter van de nucleiesuspensiebuffer en centrifuge opnieuw. De laatste pellet zal de geïsoleerde kernen zijn.Haal de eiwitten zoals beschreven voordat u 25 microliters van de 1X lyse buffer direct aan de celpellet toevoegt. Bereid vervolgens twee monsters voor SDS PAGE door het nemen van 10 microliters elk van de oplosbare eiwit extract en voeg 10 microliter van 2x Laemmli SDS monster buffer en een microliter van BME. Verwarm een monster op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en de tweede steekproef op 98 graden Celsius gedurende 15 minuten om de formaldehyde cross-link te keren.Bereid een liter 1X Tris-glycine lopende buffer door het mengen van 25 millimolar Tris, 192 millimolar glycine en 0,1% gewicht per volume SD. Stel vervolgens het hardloopapparaat van de SDS-pagina in. Open het 16%prefab TGX SDS-PAGE pakket volgens het protocol van de fabrikant en verwijder de cassette. Verwijder de kam die de putten en de tape van de onderkant van de cassette bekleedt en plaats de gel in het loopapparaat.Vul de kamer met de 1X lopende buffer totdat de putten zijn ondergedompeld in vloeistof. Met behulp van een plastic pipet spoel de putten met lopende buffer. Laad de monsters op de gel samen met 10 microliter van de voorbevlekte standaardmarker.Ten slotte, voer de gel op 200 volt tot de kleurstof voorzijde is ongeveer een centimeter van de onderkant van de gel. Een westelijke vlekanalyse van totale celextracten bij afwezigheid van BME verminderende agent toonde een multimeric complexe vorming in verschillende menselijke celbevolking aan. Het complex verdween met de toevoeging van BME in alle vier onderzochte cellijnen, wat de aanwezigheid van een disulfidekoppeling aangeeft.De monomerische bevestiging van dUTPase in menselijke cellen op het moment van oogsten is een combinatie van ten minste drie van de isovormen van dUTPase: de mitochondriale isoform, de nucleaire isoform, en een afgeknotte versie opgemerkt op M24. De mitochondriale isoform gebruikt als een controle niet vormen een disulfide koppeling en gemigreerd naar de voorspelde moleculaire gewicht voor de monomerische eiwit. Formaldehyde cross-linking van nucleaire dUTPase toonde multimeric complexe vorming aan.Toen de kruisverbinding werd omgekeerd door het monster gedurende 15 minuten uit te broeden op 95 graden Celsius, werd het complex gedestabiliseerd en kon het in zijn monomeerstaat worden gevisualiseerd. Het toevoegen van iodoacetamide is een belangrijke stap in deze procedure om de vrije cysteïneresten te blokkeren en ervoor te zorgen dat de disulfide-verbanden geen gevolg zijn van de extractieprocedure. Het is belangrijk om te onthouden geen reducerend middel, zoals BME of DDT toe te voegen aan uw SDS-PAGE-monsters, omdat deze eventuele disulfide-koppelingen in uw monster zullen verminderen.

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

This video describes multimeric PAGE for separating native protein complexes from tissue homogenates. The technique is a hybrid of blue native-PAGE and SDS-PAGE techniques. The separated complexes can be characterized and studied for their role in cell functioning.

Multimer-PAGE for Separating Native Protein Complexes: A Hybrid Separation Technique Consisting of Blue Native-PAGE and SDS-PAGE to Separate Intact Multimeric Proteins From Tissue Lysate

This video describes the technique of separating the protein samples by non-reducing SDS-PAGE to analyze the multimeric protein complexes. This technique retains the multimer subunits of a protein held by the disulfide bonds which can later be analyzed by western blotting.

Non-Reducing SDS PAGE: A Method to Analyze Disulfide-Linked Multimeric Protein Complexes

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), een glycerol gradiënt centrifugatie in de aanwezigheid van een crosslinker, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex.

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Leer een snelle methode voor het analyseren van disulfide-gestabiliseerde eiwitcomplexen met niet-verminderende SDS-PAGE in U-2 OS-cellen. Deze techniek maakt snelle identificatie van multimeren mogelijk.

Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd (Video) | JoVE Journal

Het combineren van niet-vermindert SDS-pagina analyse en chemische crosslinking om multimeric complexen te ontdekken die door disulfide verbindingen in zoogdiercellen in cultuur worden gestabiliseerd

Meer video's verkennen