Electroretinogram opname in larvale Zebrafish met behulp van A roman kegel-vormig spons-tip elektrode
27 maart 2019
Hier presenteren we een protocol dat de meting van lichte evoked electroretinogram reacties van larvale zebrafish vereenvoudigt. Een roman kegelvormige spons-tip-elektrode kan helpen om de studie van visuele ontwikkeling in larvale zebrafish met behulp van de electroretinogram ERG gemakkelijker te bereiken met betrouwbare resultaten en lagere kosten.
Dit protocol helpt bij het vereenvoudigen van de metingen van elektroretinogrammen of ERG's in larve zebravissen die een belangrijke functionele uitlezing van visuele ontwikkeling en genetische ziektemodellen biedt. De zachte spons tips van het opnemen van elektroden gebruikt in dit protocol is gemakkelijk te vervaardigen met behulp van economische en direct beschikbare materialen en voorkomt mogelijke schade aan de larve ogen. De zachtere spons-getipte elektrode kan herhaalde ERG-metingen van hetzelfde oog vergemakkelijken.
Personen die nieuw zijn in deze procedure kan het moeilijk vinden om te werken onder de schemerige rode verlichting die wordt gebruikt tijdens de procedure. Maar het is belangrijk dat de duistere aanpassing wordt gehandhaafd. Om de kegelvormige spons opnameelektrode voor te bereiden, snijd het einde van een platina elektrode loodextensie en gebruik een scalpel om 10 millimeter van de buitenste polytetrafluorethyleen isolatie coating te verwijderen uit het nieuwe uiteinde van de uitbreiding.
Snijd een stuk van 40 millimeter van een zilverdraad met een diameter van 0,3 millimeter en verwekt de zilverdraad met de blootgestelde binnendraad om de draad stevig aan het elektrodelood te bevestigen. Bekapsel het gewricht met isolerende tape waardoor een ongeveer 15 millimeter lengte van zilverdraad blootgesteld. Sluit een andere draad aan op de negatieve terminal van de batterij en dompel het andere uiteinde van de draad onder in de zoutoplossing.
Dompel de blootgestelde zilverdraad onder in normale zoutoplossing en sluit het andere uiteinde aan op de positieve terminal van een negen volt gelijkstroombron. Na 60 seconden, plaats de draad op absorberend weefsel te drogen. Snijd ondertussen een 20 bij 20 millimeter vierkant polyvinylacetaat spons in een kegelvorm en verzadig de spons in één keer de buffer van Ringer.
Onder een lichtmicroscoop met een schaalbalk op het oculair, gebruik een scalpelblad om de top van de kegel vorm te geven aan een diameter van ongeveer 40 micrometer. Droog de kegelvormige spons op absorberend tissuepapier aan de lucht tot het vast is. Voordat u de zilverdraad in de gedroogde vaste kegelvormige polyvinylacetaat spons door de basis van de kegel, met behulp van plakband om overtollig blootgesteld metaal te isoleren om fotovoltaïsche artefacten te verminderen.
Op de dag van het experiment dompel je de spons-getipte elektrode gedurende 15 minuten onder in de buffer van Ringer om de spons volledig te verzadigen. Plaats ten minste acht uur voor de opnames niet meer dan 20 zebravislarven in een enkele buis van 15 milliliter zonder deksel en verpakt in aluminiumfolie in een donkere couveuse. Giet aan het einde van de incubatie de donker aangepaste zebravis in een petrischaaltje onder schemerige rode verlichting van een lichtgevende diode.
Ter voorbereiding van de spons platform, snijd een stuk van polyvinyl acetaat spons ongeveer gelijk in dikte tot de diepte van een 35 millimeter petrischaal, zodat de spons zal goed passen in de schotel. Maak een kleine verticaal gesneden door een uiteinde van de spons om de zilveren draad van de referentie-elektrode tegemoet te komen en geniet van de spons in de buffer van de goudvis Ringer totdat de spons verzadigd is. Plaats vervolgens de spons in een schone 35 millimeter petrischaal en gebruik een papieren handdoek om de extra vloeistof te absorberen totdat er geen oplossing uit de spons straalt in reactie op een lichte vingerdruk.
Om het dier voor het experiment te positioneren, gebruikt u een Drie millimeter Pasteur pipet om een verdoofde larve over te brengen op een drie bij drie centimeter vierkante papieren handdoek en gebruik tangen om het vierkant op de bevochtigde spons te plaatsen. Met behulp van een fijne borstel gedrenkt in de buffer van Ringer, pas de positie van de larve met een oog naar boven en uit de buurt van een vloeistof op de handdoek onder de larve. Glazuur het larvenlichaam met hydraterende ooggel om het dier gehydrateerd te houden tijdens de elektroretinogram opname.
En plaats de schotel op een klein, met water verwarmd platform voor de Ganzfeld kom licht stimulus gelegen in een Kooi van Faraday. Plaats de referentieelektrode in de snede gemaakt in de platformspons. En sluit een commercieel verkregen grondelektrode aan op de Kooi van Faraday.
Bevestig de opnameelektrode aan een elektrodehouder en bevestig de houder aan de stereotaxic-arm van een micromanipulator. Met behulp van een drie millimeter Pasteur pipet, resaturate de spons tip van de elektrode met een druppel van de oplossing ringer's en plaats de microscoop in de Kooi Van Faraday over het elektroretinogram platform. Gebruik de punt van een absorberend weefsel om overtollige vloeistof te verwijderen uit de elektrode spons tip en onder de microscoop, plaats de actieve elektrode, zodat de spons tip zachtjes raakt het centrale hoornvlies oppervlak van de larve zebravis oog.
Verplaats vervolgens de Ganzfeldkom naar het sponsplatform en zorg ervoor dat de larve bedekt is met de kom en sluit de kooi om vreemd elektromagnetische ruis te verminderen. De gevoeligheid van het larvende zebravisvlies voor dimmerflitsen neemt toe met de leeftijd. Aangezien de a- en b-golven niet herkenbaar zijn bij intensiteiten lager dan min 1,61 log candela seconde per vierkante meter bij vier dagen na bevruchting, terwijl duidelijke signalen detecteerbaar zijn bij deze intensiteiten in de oudere larven.
De b-golf amplitude neemt aanzienlijk toe tussen vier en vijf na de bevruchting. Op zeven dagen, het signaal op 2,48 log candela seconde per vierkante meter is groter in vergelijking met dagen vijf en zes na bevruchting. A-en b-wave impliciete tijden worden aanzienlijk sneller na vijf dagen na de bevruchting.
Met over het algemeen, deze resultaten tonen een rijping in zebravis retinale functie tussen vier tot zeven dagen na de bevruchting. Om dit protocol succesvol uit te voeren is het van cruciaal belang dat sponzen volledig verzadigd zijn met vloeistof die helpt de geleidbaarheid van de opnameelektrode te behouden en de geluidsniveaus verlaagt. Als de a-golf van bijzonder belang is, kunnen farmacologische behandelingen worden toegepast om de b-golfcomponent te blokkeren, waardoor de volledige a-golf wordt blootgelegd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol helpt bij het vereenvoudigen van de metingen van elektroretinogrammen (ERG's) bij zebravislarven, wat een belangrijke functionele readout biedt van de visuele ontwikkeling en genetische ziektemodellen. Het gebruik van een nieuwe kegelvormige sponspunt-elektrode vergemakkelijkt betrouwbare resultaten en is bovendien kosteneffectief.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Visuele Ontwikkeling
Achtergrond
- Electroretinogrammen (ERG's) zijn essentieel voor het beoordelen van de visuele functie.
- Zebravislarven dienen als model voor het bestuderen van de visuele ontwikkeling.
- Bij traditionele methoden bestaat het risico dat de delicate ogen van de larven beschadigd raken.
- Zachte elektroden met een sponspunt kunnen dit risico beperken.
Doel van de studie
- Om de meting van ERG's bij zebravislarven te vereenvoudigen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van de visuele ontwikkeling.
- Om herhaalde metingen mogelijk te maken zonder de proefpersonen te schaden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van kegelvormige spons-registratie-elektroden.
- Gebruik van zwak rood licht om de donkeradaptatie te handhaven.
- Fabricage van elektroden uit economische materialen.
- Meerdere ERG-registraties uitvoeren bij hetzelfde oog.
Belangrijkste resultaten
- De elektroden met sponspunt zijn eenvoudig te vervaardigen en te gebruiken.
- Ze voorkomen beschadigingen aan de ogen van de zebravislarven.
- Gefaciliteerde herhaalde ERG-metingen leveren consistente resultaten op.
- Het handhaven van donkeradaptatie is cruciaal voor nauwkeurige metingen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare en kosteneffectieve methode voor ERG-metingen.
- Het verbetert de studie naar de visuele ontwikkeling bij zebravissen.
- Toekomstig onderzoek kan profiteren van deze vereenvoudigde aanpak.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol biedt een kosteneffectieve, reproduceerbare methode voor de functionele beoordeling van de visuele ontwikkeling bij zebrafish-larven, een belangrijk model voor targetvalidatie bij de ontdekking van geneesmiddelen in de neurowetenschappen. De innovatieve sponspunt-elektrode vermindert technische barrières en weefselschade, wat betrouwbare ERG-metingen mogelijk maakt die bijdragen aan de mechanistische risicoreductie van retinaal-paden. De eenvoud ervan vergemakkelijkt de standaardisatie van assays tussen laboratoria, waardoor het voorspellend vertrouwen bij vroegtijdige screening van de visuele functie wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoek naar functionele pathways van het retina mogelijk via a- en b-golfmetingen, wat het testen van doelhypothesen in de visuele neurowetenschappen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van economische, gemakkelijk beschikbare materialen om de drempels voor het opzetten van ERG-assays in workflows voor doelvalidatie te verlagen.
- Voorspellende waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare elektrofysiologische resultaten die helpen bij het verminderen van risico's rond mechanistische aannames over de effecten van genen of verbindingen op de retinale verwerking.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert consistente a- en b-golfamplitudes en implicitietijden als kwantitatieve biomarkers voor retinale rijping en functie.
- Operationele waarde: Het gemak van fabricage en hantering van de elektrode ondersteunt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de assay voor screening met een medium doorvoersnelheid.
- Klaarheid voor assay: Maakt een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door stabiele, niet-invasieve registraties te bieden die geschikt zijn voor longitudinale studies in hetzelfde larvale oog.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt ziekterelevante modellering door de functionele visuele rijping van 4 tot 7 dagen na bevruchting te volgen, wat aansluit bij kritieke perioden in genetische ziektemodellen.
- Mechanische risicoreductie: Maakt farmacologische isolatie van a-golfcomponenten mogelijk om de bijdragen van fotoreceptoren versus bipolaire cellen te analyseren, waardoor de doelspecifiteit wordt verbeterd.
- Preklinisch nut: Maakt sensitieve detectie van functionele veranderingen over verschillende ontwikkelingsstadia mogelijk, wat helpt bij dosis-responsonderzoeken en tijdreeksbeoordelingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische beoordeling, en biedt een functionele brug tussen genetische manipulatie en fenotypische uitkomsten in onderzoek naar het visuele systeem.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door retinale elektrofysiologische responsen op lichtstimuli te meten, waardoor de pathway-activiteit in ontwikkelende zebravis wordt verduidelijkt.
- Screening: Levert gestandaardiseerde ERG-outputs met weinig ruis, die vergelijkingen tussen genetische omstandigheden of behandelcondities mogelijk maken.
- Analytics: Biedt meetbare afhankelijke variabelen (a-golf amplitude, b-golf amplitude, impliciete tijden) voor statistische vergelijking van de retinale functie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontwikkelingsgerelateerde elektrofysiologische veranderingen met ziektemodellen, wat de afstemming van biomarkers bij visuele dysfunctie ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar, kosteneffectief platform voor ERG-testen dat gedeeld kan worden tussen projecten die retinale genen, toxines of therapeutische kandidaten bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door directe, functionele meting van de neurale activiteit van het netvlies.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en vermindert variabiliteit via gestandaardiseerde elektrodevoorbereiding en registratiecondities in het donker.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege functionele gegevens te leveren over de integriteit van het visuele systeem, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen of genetische doelwitten mogelijk op basis van objectieve visuele functionele uitkomsten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en het werken met zebravissen om de signaalintegriteit te waarborgen.
- Afhankelijkheid van basisapparatuur voor elektronica en microscopie voor de vervaardiging van elektroden en signaalacquisitie.
- Standaardisatie van protocollen voor donkeradaptatie en zoutoplossingsperfusie over verschillende gebruikers is noodzakelijk om vergelijkbaarheid te garanderen.
- Overwegingen voor adaptatie omvatten het aanpassen van de elektrodegrootte en de samenstelling van de zoutoplossing voor verschillende larvale leeftijden of soorten.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor elektrodeverzadigingsniveaus en omgevingslicht, welke gecontroleerd moeten worden om ruis te minimaliseren.
