Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Het protocol maakt een snelle geïsoleerde functie van kleine subpopulaties van cellen binnen pancreaseilandjes van Langerhans mogelijk. De voordelen van deze techniek omvatten de real-time aard en een hoog statistisch vermogen, en dus een hoge reproduceerbaarheid, van de verkregen gegevens. Om de eilandjes voor beeldvorming te immobiliseren, monteer je een beeldkamer voor een omgekeerde microscoop en plaats je een glazen afdekbrief in de kamer.

Zorg ervoor dat de glazen kamerinterface waterdicht is en bevestig dat de afdeksel zich binnen het bereik van de microscoopdoelstelling bevindt. Snijd vervolgens 20 bij 20 millimeter vierkanten fijn en grof gaas en gebruik 45 tot 50 micrometer stukjes dikke plakband om twee afstandswanden te creëren op een stuk fijn gaas. Dompel het grove gaas en een gewicht onder in een petrischaaltje van 35 millimeter met beeldvormingsoplossing en leg het fijne gaas onder een ontledenmicroscoop.

Draai het fijne gaas met de spacer muren ondersteboven en de afstandhouders naar boven gericht. En gebruik een p20 pipet om verschillende eilandjes over te brengen tussen de twee afstandhouders. Met behulp van de tang'forceps, plaats het gaas ondersteboven in de beeldkamer van de omgekeerde microscoop, zodat de afstandhouders naar beneden staan om direct te zitten op de kamer deksel slip, het vangen van de eilandjes tussen de afstandhouders en het gaas in het midden van de cover slip.

Zorg ervoor dat het gaas goed gehydrateerd is zonder overmatige hoeveelheden oplossing te bevatten die de zijdelingse beweging van het monster zouden veroorzaken. Plaats vervolgens het grove gaas en het gewicht bovenop het fijne gaas in de kamer en voeg de beeldoplossing toe aan de kamer. Zodra de eilandjes zijn geïmmobiliseerd, selecteert u de beeldmodus en doelstelling op de omgekeerde microscoop en plaatst u de kamer met de eilandjes op het temperatuurgestuurde stadium van de microscoop.

Na het instellen van de perfusie, plaats de instroom lager dan de uitstroom in de kamer en stel de uitstroom te zijn groter dan de instroomflux. Zorg ervoor dat de uitstroom minimaal contact heeft met de oplossing, zodat de oplossing in meerdere opeenvolgende kleine druppeltjes wordt verwijderd, waardoor lange intervallen van continue oplossingsverwijdering worden vermeden. Start vervolgens de perfusie met beeldvormingsoplossing met drie millimolarglucose en selecteer het lichtpad en de filters voor beeldvorming groene fluoroforen.

Voer vervolgens live beeldvorming uit om de beeldvormingsparameters in te stellen en de weergave aan te passen om de bezienswaardigheden van belang vast te leggen. Als u de signaal-ruisverhouding van het beeld wilt optimaliseren, past u de intensiteit van het excitatielicht, de belichtingstijd en de binning aan, zodat de instellingen een duidelijke visualisatie van elke cel in de eilandjes mogelijk maken bij de minimale mogelijke lichtintensiteit en belichting. Beeld vervolgens de eilandjes op 0,1 tot 5 hertz, het controleren van de kwaliteit van de verkregen gegevens als het wordt vastgelegd.

Wanneer de alfacelactiviteit detecteerbaar is, gebruikt u een online grafiek van de signaaldynamiek binnen de acquisitiesoftware mogelijk en voeg adrenaline of glutamaat gedurende twee tot vijf minuten toe aan de badoplossing. Een snelle sprong in calcium gevolgd door een vertraging of annulering van de alfacel oscillaties zal worden waargenomen. Voeg vervolgens ghreline toe, waarvan onlangs is gemeld dat ze deltacellen selectief activeren.

Een snelle omkeerbare toename van calcium zal worden waargenomen in een kleine subpopulatie van eilandjecellen. Voeg vervolgens 10 millimolar glucose toe. Een gecoördineerde oscillatory reactie in de bètacel subpopulatie zal worden waargenomen.

Let ook op de reacties van cellen die eerder werden geactiveerd door adrenaline of glutamaat en ghreline. Na het opslaan van de beelden importeert u de gegevens in een geschikt softwareprogramma voor gegevensanalyse en normaliseert u de gegevens over de ruwe fluorescentieintensiteit tot de initiële waarde van fluorescentie. Als de gegevensset van cel-cel-celvariabiliteitsfluorescentie nog steeds aanzienlijk is, definieert u een controlegebied voor het tijdsbereik waarin de controleoplossing is toegepast.

Als het controlegebied een duidelijk niet-oscorcillatoriesignaal heeft, gaat u ervan uit dat de fluorescentieintensiteit na elke toepassing van de besturingsoplossing is teruggekeerd naar de uitgangswaarde. Als u de time lapse-gegevens voor elke cel wilt corrigeren, splitst u de gegevens op in segmenten die zijn gescheiden door de punten waarop de besturingsoplossing is toegevoegd en past u lineaire correctie toe op elk segment. Als het controlebereik duidelijke trillingen heeft of er extra factoren aanwezig zijn, gebruikt u een algoritme voor piekdetectie.

Om de frequentie van calciumpieken en de reactie op de toevoeging van agonisten en antagonisten te meten, splitst u de opname in gelijke tijdsintervallen, telt u de pieken binnen het interval en normaliseert u de intervalduur om de tijdstuur van de gedeeltelijke frequentie te berekenen. U ook de drempel instellen en de plateaufractie voor elk van de intervallen berekenen. De fractie geeft het tijdspercentage aan binnen het interval dat de cel in de opgewonden status heeft doorgebracht.

Of bereken het gedeeltelijke gebied onder de curve voor elk van de intervallen. Tenzij de lipidesamenstelling van het membraan is aangetast, worden eilandjes redelijk goed belast met tropische kleurstoffen. De menselijke adenovirus type 5 vector richt zich ook met succes op eilandjecellen.

Calcium spiking in alfacellen kan gemakkelijk worden gedetecteerd bij lage glucoseniveaus, en er is een hoge cel-per-cel correlatie tussen de activiteit bij lage glucose en de reactie op adrenaline en glutamaat. Ghreline activeert een aantal adrenaline responsieve cellen bij lage glucose, maar heeft geen effect op de calciumdynamiek in de meeste cellen die worden geactiveerd door lage glucose. Wanneer geanalyseerd in termen van gedeeltelijke frequentie, adrenaline of ghreline-gestimuleerd cellen vertonen een aanzienlijke toename onder de alles-of-niets voorwaarden, hoewel de algemene veranderingen tussen basale stekelen en de adrenaline-effect zijn subtiel.

In tegenstelling, het gedeeltelijke gebied onder de curve is gevoelig voor de veranderingen geïntroduceerd door adrenaline in alle cellen, zelfs wanneer de basale activiteit hoog is. Zorg ervoor dat alle mazen in contact zijn met de beeldvormingsoplossing en zorg ervoor dat het weefsel redelijk dicht wordt positioneren om luchtbellen te voorkomen. De methode kan worden uitgebreid met de kunstmatige intelligentie voor het differentiëren tussen de celtypen.

De farmacologische markers kunnen worden vervangen door de patroonherkenningstechnologie, waardoor de opnametijd wordt verkort.