Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de snel groeiende bacterie Vibrio natriegens

Ons protocol voor celvrije eiwitexpressie maakt gebruik van zeer actief ruw extract uit de snelgroeiende bacterie Vibrio natriegens, die wordt voorbereid met behulp van een eenvoudig en tijd-efficiënt tweestapsonicatie-centrifugatieproces. Ruwe cel extract voorbereiding en cel-vrije eiwitsynthese kan worden bereikt in een tot twee dagen door een enkele gebruiker waardoor deze techniek gemakkelijk worden geïntegreerd in pijpleidingen voor bioproductie of synthetische biologie toepassingen. Om te beginnen wassen een milliliter van de 's nachts Vibrio natriegens cultuur door centrifugeren in een benchtop centrifuge op 10, 600 keer g gedurende een minuut.

Aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet, en resuspend in een milliliter van verse LB-V2 media. Inoculeren een milliliter gewassen 's nachts cultuur in een liter verse LB-V2 groeimedia in een autoclaved vier-liter verbijsterd Erlenmeyer fles met steriele dekking te bereiken een-op-een duizend verdunning rantsoen. Kweek cultuur op 30 graden Celsius terwijl schudden tot 225 RPM.

Gebruik een spectrofotometer om de culturen OD 600 te controleren. En wanneer het 1,0 plus of min 0,2 oogst oogst de cultuur door het te centrifugeren in twee 500-milliliter buizen op 3, 500 keer g gedurende 20 minuten op vier graden Celsius, en dan op ijs. Aspirate de supernatant en het proces van de pellet onmiddellijk.

Gebruik 10 milliliter van deze koude S30 lysis buffer om alle pellets als gevolg van dezelfde één litercultuur opnieuw op te schorten. En breng de vering over naar een buis van 50 milliliter. Centrifuge deze suspensie op 3, 500 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en dan aspirate de supernatant zonder verstoring van de pellet en plaats het op ijs.

Werken in een koude kamer voeg 500 microliters van koude S30 lyse buffer aan de pellet in de 50-milliliter buis geplaatst op ijs. Gebruik een brede boring pipet tip om de pellet resuspend en zorgvuldig overbrengen naar een twee-milliliter buis ook op ijs. Om zeer actieve ruwe extracten te produceren moeten we ervoor zorgen dat de cellen niet over verdund zijn met S30-buffer, maar voldoende vloeistof hebben voor een efficiënte sonicatie.

Vul een bekerglas van 600 milliliter met ijs en leg een tubehouder van twee milliliter bovenop het ijs. Vortex de buis kort om de cellen te homogeniseren. Veeg om eventuele cellen op de bodem van de dop te verwijderen en plaats in buishouder met open dop.

Lagere sonicator tip in de cel suspensie in de buis, zodat het net onder het vloeibare oppervlak. Bereid de sonicatie-opstelling voor met behulp van een sonicator en sonde met een tipdiameter van 1/8 inch. Stel de sonicator in op een frequentie van 20 kilohertz en 50%amplitude.

Polstijd van 10 seconden, en puls-off tijd van 60 seconden. Voer het pulssoononicatieprotocol uit voor drie cycli. En dan 30 tot 45 minuten bij vier graden Celsius ruwe celextract centrifugeren tot lysaat vrij is van cellulair puin.

Het visueel inspecteren van cellyse als sonicatie plaatsvindt is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat sonicatie heeft gewerkt zoals verwacht. Werken in een koude kamer aliquot 50 microliters van de resulterende supernatants aan nieuwe twee-milliliter buizen ervoor te zorgen niet om de pellet te verstoren. Om te knipperen bevriezen deze ruwe cel extracten plaats de buizen in een buis houder met een dompelen string bevestigd en onderdompelen in een deoorlog met vloeibare stikstof en controleren of bevroren.

Om celvrije eiwitexpressie uit te voeren met behulp van DNA-sjabloon dooi 10X energie-oplossing master mix, 4X aminozuur master mix aliquots, en DNA-sjabloon op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de T7 RNA polymerase- en RNAse-remmervoorraden uit de minus 20 graden Celsius vriezer en plaats op ijs. Zodra de DNA-sjabloon, 10X energie-oplossing master mix, en 4X aminozuur master mix zijn ontdooid, plaats op ijs.

Bereid een celvrije reactiemastermix door elk onderdeel in de juiste volgorde toe te voegen aan een buis van twee milliliter op ijs en veeg de buis voorzichtig na elke toevoeging aan de mastermix. Verwijder Vibrio natriegens ruwe cel lysate uit de min 80 graden Celsius vriezer en plaats op ijs voor 10 tot 20 minuten ontdooid. Voeg het juiste volume ontdooid ruw celextract toe aan de celvrije reactiemastermix en meng voorzichtig met een pipet.

Om endpoint celvrije eiwitexpressie uit te voeren met behulp van thermocycler, voeg u eerst 10 microliters van de celvrije reactiemastermix per put van de bodem van een PCR-plaat met 96 goed toe om de mastermix te mengen door de buis zachtjes tussen elke overdracht naar de PCR-plaat te bewegen. Centrifuge de plaat op 1,000 keer g gedurende 10 seconden tot het zwembad van een master mix die kan zijn geplakt aan de zijkanten van de putten. En sluit de putten af met een plaatlijm om verdamping te voorkomen.

Plaats de plaat in een thermocycler ingesteld op 26 graden Celsius met een verwarmd deksel ingesteld op 105 graden Celsius. Na het uitbroeden van de reacties in de PCR-plaat gedurende minimaal drie uur, kunnen uitgedrukte eiwitten worden gezuiverd, gekwantificeerd en gebruikt voor downstreamprocessen. Om cel-vrije eiwit expressie kinetiek met behulp van een plaatlezer pipet 10 microliters per put van de cel-vrije reactie master mix te controleren tot de bodem van een zwarte 384-well assay plaat met heldere glazen bodems.

En sluit de putten af met een heldere plaatlijm om verdamping te voorkomen. Plaats de testplaat in een plaatlezer die op 26 graden Van Celsius wordt geplaatst en incubbate drie tot zes uur terwijl het controleren van de aangewezen fluorescente opwinding/emissiegolflengten die aan het uitgedrukte eiwit overeenkomen. Cel-vrije expressie systeem beschreven in dit protocol bereiken de beste resultaten met plasmid DNA template opbrengst aanzienlijk hogere hoeveelheid eiwit dan dezelfde hoeveelheid lineair DNA, zoals blijkt uit eindpunt en kinetische testen.

mRNA gegenereerd door in-vitro transcriptie reacties kunnen ook worden gebruikt, maar hogere hoeveelheden mRNA zijn vereist. De opbrengst van de eiwitproductie werd aanzienlijk beïnvloed door de concentratie magnesium en kaliumionen. Onder geoptimaliseerde omstandigheden bleek de optimale magnesiumionconcentratie 3,5 millimolar te zijn en voor kaliumion, 80 millimolar.

Zo kunnen afwijkingen van deze optimale ionenconcentraties resulteren in een verminderde capaciteit voor dit expressiesysteem om aanzienlijke opbrengsten van eiwitten te produceren. Het is belangrijk om alle reagentia zoveel mogelijk op ijs te houden of in een koelcel te werken. Bovendien is een goede en volledige sonicatie van cruciaal belang voor het succes van dit protocol.

Na dit protocol zullen gebruikers de capaciteit hebben om eiwitten uit te drukken in een hoge doorvoervorm, die kan worden gebruikt om te zuiveren en te screenen op activiteit van veel verschillende eiwitten. Deze techniek toont het gebruik van nieuwe organismen met unieke eigenschappen voor celvrije expressie. Vibrio natriegens is een halofiele snelgroeiende bacterie die unieke voorwaarden kan bieden voor expressie van eiwitten of kleine moleculen die voorheen onontgonnen waren in gevestigde modelorganismen.