Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Hier hebben we een eenvoudig experimenteel systeem opgezet dat de reconstructie mogelijk maakt van actieve Pol II-rekcomplexen die geschikt zijn voor het onderzoeken van de functionele koppeling van Pol II-transcriptie en RNA-aftopping. Met deze methode kunnen functionele rekcomplexen eenvoudig worden geassembleerd met slechts een paar componenten. De rekcomplexen zijn geïmmobiliseerd op magnetische kralen, zodat het gemakkelijk is om reactieomstandigheden te veranderen.

Om DNA oligo met biotine op magnetische kralen te immobiliseren, voeg je eerst 200 microliter magnetische kralen toe aan een eiwitarme binding van 1,5 milliliter en plaats je de buis vervolgens twee minuten op een magnetisch rek. Terwijl de buis op het magnetische rek, gebruik een pipet om de vloeistof te verwijderen uit de buis zonder verstoring van de kralen. Om de kralen te wassen, verwijder de buis uit het rek, en voeg een milliliter wasbuffer met Tris-hydrochloride, EDTA, en natriumchloride.

Breng de buis terug naar het rek. Na twee minuten verwijdert u de wasoplossing en herhaalt u de wasbeurten nog twee keer met 200 microliter van dezelfde buffer. Resuspend de magnetische kralen in 400 microliters van 2X buffer.

Voeg vervolgens 380 microliter water en 20 microliter van 10 micromolar niet-sjabloon biotinylated DNA oligo toe om te mengen. Plaats de buis op een nutator, en incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Daarna, was de kralen met geïmmobiliseerde niet-sjabloon DNA oligo drie keer met behulp van 200 microliters van buffer en vervolgens drie keer met 200 microliters van opslag en verdunning buffer.

Bewaar de buis op vier graden Celsius 's nachts om te eindigen met het blokkeren van de kralen met BSA. De volgende dag, gooi de oplossing, resuspend de kralen in 200 microliters van opslag en verdunning buffer, om een geschatte DNA-concentratie van vijf micromolar te bereiken, en vervolgens de overdracht van de oplossing met de kralen naar een nieuwe buis. Om de DNA-RNA duplex te verkrijgen, moet u een 10-microliter annealing mix in een PCR-buis voorbereiden met een twee-op-een RNA-DNA-molaire verhouding, zoals beschreven in het geschreven protocol.

Plaats de buis in een thermische cycler. Stel het programma vijf minuten in op 45 graden Celsius, gevolgd door 12 cycli van elk twee minuten, beginnend bij 43 graden Celsius en het verlagen van de temperatuur met twee graden Celsius per cyclus. Tot slot, houd het stationair op vier graden Celsius.

Om gezuiverde RNA polymerase II op de DNA-RNA hybride te laden, mengt u één microliter DNA-RNA duplex met 13 microliters van vers bereide polymerase II buffer in een buis. Voeg een microliter gezuiverde RNA polymerase II toe en meng door zachtjes op en neer te pipetten en te roeren met de pipetpunt, zonder bellen te introduceren. Broed de buis 10 minuten in bij 30 graden Celsius.

Om het rekcomplex te voltooien, voegt u een microliter van geïmmobiliseerde niet-sjabloon DNA-oligokralen toe aan 14 microliter van niet-sjabloon-DNA-buffer, voegt u het mengsel van 15 microliter toe aan de eerder geïncmobileerde buis en ontcunelijk het nog 10 minuten bij 37 graden Celsius. Plaats het monster twee minuten op het magneetrek. Was het monster één keer met 30 microliter wasbuffers om ongeordende polymerase II en oligo's te verwijderen.

Om de rekcomplexen met RNA 23mers te radiolabelen, voeg je één microliter ATP en één microliter radioactief gelabelde UTP toe aan 23 microliters pulsbuffer, en voeg dit mengsel toe aan de gewassen magnetische kralen om opnieuw op te stellen. Broed de reactie gedurende 10 minuten om de synthese van radiogelabelde 23mers mogelijk te maken. Voeg 1,5 microliter oplossing toe met 100 micromolar ATP en 100 micromolar UTP-mix tot 3,5 microliter chase buffer en voeg het mengsel toe aan de buis met voorgemonteerde langwerpcomplexen op kralen.

Nogmaals, broeden de buis voor vijf minuten om alle ontluikende transcripties jagen in 23mers. Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek en was zoals eerder werd gedaan om niet-opgenomen nucleotiden te verwijderen. Resuspend het monster in 30 microliter van wasbuffer.

Om rekcomplexen met langere transcripties te genereren, volg je de vorige procedures en schaal je viervoudig op om 120 microliters van gewassen rekcomplexen te genereren voor vier reacties. Label drie nieuwe buizen 23mer, 25mer en 29mer. Breng 30 microliter gewassen rekcomplexen over naar de 23mer buis en voeg 94 microliter stopmix toe met proteinase K en glycogeen.

Plaats de buis met de resterende 90 microliter gewassen rekcomplexen gedurende twee minuten op het magnetische rek, verwijder de supernatant en zet kralen opnieuw op in 90 microliter BTB, aangevuld met 1,2 microliter ATP en CTP. Incubeer gedurende 10 minuten bij 30 graden Celsius. Breng na het wassen met 90 microliter wasbuffers 30 microliter rekcomplexen over naar de 25mer buis en voeg 94 microliter stopmix toe met proteinase K en glycogeen.

Nogmaals, plaats de buis met de resterende 60 microliters van rekcomplexen twee minuten op het magnetische rek. Herhaal de BTB-behandeling met 60 microliter buffer aangevuld met 0,8 microliter ATP en CTP. Na incubatie en wassen zoals eerder gedaan, resuspend het monster in 60 microliters van wasbuffer.

Breng 30 microliter van het monster naar de 29mer buis, en voeg 94 microliter van stop mix met proteinase K en glycogeen. Analyseer reactieproducten op een denaturering polyacrylamide gel. Ten eerste, genereren gewassen rekcomplexen met 23mers door het opschalen van 13-voudige de procedure eerder beschreven om 390 microliters te verkrijgen voor 12 reacties en een extra.

Om fosforylatie van polymerase II CTD uit te voeren, verwijdert u de supernatant na het plaatsen van het monster in het magnetische rek en resuspend de kralen in 377 microliter van BTB. Label twee nieuwe buizen plus H en min H.To plus H, voeg drie microliters van transcriptie initiatie factor TFIIH bij de concentratie van 300 nanogram per microliter, en tot min H, voeg negen microliters van opslag en verdunning buffer. Voeg 87 microliter van de gewassen rekcomplexen toe aan de plus H-buis en 261 microliters aan de minus H-buis.

Incubeer de buizen gedurende 10 minuten en was met wasbuffer. Om RNA-aftopping uit te voeren, voegt u 87 microliter aftoppingsmix toe aan de plus H-buis en 261 microliters aan de minus H-buis om opnieuw te worden opgetrokken. Label vier nieuwe buizen, vijf plus H, vijf min H, 15 min H en 45 min H, en geef drie microliters van vijf, 15 of 45 nanogram per microliter aftoppingenzym in de overeenkomstige buizen.

Bereid vervolgens 12 nieuwe buizen met 94 microliter stopbuffer. Start de eerste aftopping reactie door het toevoegen van 87 microliters van rekcomplex behandeld met TFIIH aan de buis gelabeld vijf plus H.Incubate op 30 graden Celsius in een warmteblok. De aftopping reacties moeten precies worden getimed met behulp van een stopwatch.

Bij het werken met meerdere reacties moeten de begintijden voor elke reactie worden gespreid. Na een, twee of vier minuten, overdracht 30 microliter van de vijf plus reactie mengsel naar buizen gelabeld een, twee, en drie met 94 microliter stop buffer om de reacties te stoppen. Ga verder met het afdekken van reacties voor de monsters in de resterende minus H-buizen op precies dezelfde manier, met behulp van rekcomplexen behandeld zonder TFIIH.

Analyseer reactieproducten op een denaturering polyacrylamide gel. Een diagram wordt hier getoond voor DNA- en RNA-moleculen in kunstmatige rekcomplexen. Met behulp van de synthetische RNA oligo van 20 nucleotiden als de RNA primer tijdens de assemblage van de kunstmatige rekcomplexen, werden nucleotiden toegevoegd tijdens elke opeenvolgende loopstap van het protocol om een 23mer, een 25mer en een 29mer te genereren.

Reacties met RNA polymerase II uit verschillende bronnen werden vergeleken. Kunstmatige rekcomplexen werden geassembleerd met endogene polymerase II van het wildtype gezuiverd uit rattenlever of splijtingsgist en liepen om 23mers of 25mers te genereren. Een test werd uitgevoerd om aftopping van radiogelabelde transcripties in verband met kunstmatige rek complexen met 23 nucleotide transcripten met een vijf-prime triphosfate einde te meten.

De laatste twee rijstroken tonen de producten van reacties waarbij rekcomplexen werden geïncubeerd met of zonder aftoppingsenzym in aanwezigheid van TFIIH. De meer langzaam en sneller migrerende banden bevatten afgetopte en niet-afgetopte transcripties, respectievelijk. De eerste 12 rijstroken tonen aftopping van transcripties in verband met rekcomplexen met een fosforyleerde of onfosforylated CTD.

Activiteiten van polymerase II en andere enzymen kunnen variëren van prep tot prep, dus het is noodzakelijk om reactieomstandigheden te optimaliseren door enzymconcentraties te titreren om optimale niveaus te definiëren. Het is belangrijk om radioactief materiaal veilig te gebruiken en besmetting te voorkomen. Zorg ervoor dat u uw laboratorium- en instituutsrichtlijnen volgt bij het doen van experimenten met radioactiviteit.