Gebruik van een lineaire versneller voor het uitvoeren van in vitro radiobiologie experimenten

Radiotherapie wordt het vaakst geleverd met behulp van lineaire versnellers. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de biologische effecten van straling op cellen te beoordelen met behulp van een lineaire versneller. Het voordeel van deze techniek is dat onderzoekers met behulp van een lineaire versneller een breed scala aan klinisch relevante doses en dosissnelheden kunnen bestuderen.

Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor alle soorten kankercellen. Deze methode kan worden uitgevoerd met behulp van soortgelijke apparatuur als die hier getoond. Bijvoorbeeld lineaire versnellers die door andere leveranciers zijn vervaardigd.

Personen die niet ervaring hebben met het uitvoeren van dosimetrische berekeningen met behulp van een lineaire versneller kunnen moeite hebben om het juiste aantal monitoreenheden te berekenen dat nodig is om de gewenste dosis aan het monster te leveren. Ze zouden profiteren door advies in te winnen van een ervaring medisch fysicus of dosimetrist. Het nauwkeurig leveren van de dosis aan het monster met behulp van een lineaire versneller vereist een zorgvuldige plaatsing.

Twee dagen voor de geplande bestraling, werken in een cultuur kap, gebruik maken van een steriele vijf milliliter pipet om glioom stam-achtige cellen te verzamelen van een cultuurplaat in een 15 milliliter centrifuge buis. Centrifugeren de cellen op 200 keer g gedurende drie minuten in een aanrecht centrifuge. Gooi de supernatant weg en verleg de celpellet met een milliliter trypsine-EDTA.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten om de pellet te verteren en een enkele cel suspensie te maken in trypsin-EDTA. Schud elke twee minuten tijdens de spijsvertering voorzichtig de onderkant van de centrifugebuis om er zeker van te zijn dat de cellen grondig worden verteerd. Voeg vervolgens drie milliliter stamcelcultuurmedia toe om trypsine te doven, meng voorzichtig en centrifuge gedurende drie minuten op 200 keer g in een aanrechtcentrifuge.

Na het weggooien van de supernatant, resuspend de cel pellet met vijf milliliter van cel cultuur media en tel de cellen met een hemocytometer. Plaat vijf miljoen cellen verdeeld in twee 10 centimeter platen met 10 milliliter celcultuurmedia en 48 uur uitbroeden bij 37 graden Celsius. Vlak voor de geplande bestraling, verzamel de cellen en centrifuge zoals eerder gedaan.

Gooi de supernatant weg en stel de celpellet opnieuw op met vijf milliliter celkweekmedia. Breng een milliliter celsuspensie over in een 35 millimeter plaat met twee milliliter celkweekmedium, zodat het medium een hoogte van één centimeter bereikt. Breng de vergulde cellen over naar een secundaire container om het risico op besmetting te verminderen en breng de cellen in de container op een nutswagen naar de bestralingsfaciliteit om de cellen te bestralen.

Een dag voor bestraling, werken in de cel cultuur kap, gebruik maken van een Pasteur pipet aangesloten op een vacuüm om DMEM medium te verwijderen uit de cel cultuur plaat naar de bijgevoegde cellijn. Was vervolgens de cellen met vijf milliliter steriele PBS om het resterende medium af te spoelen. Voeg een milliliter trypsin-EDTA in de cultuur schotel en voorzichtig kantelen de cultuur plaat om ervoor te zorgen dat de hele schotel is bedekt.

Na het uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, blus de trypsin-EDTA reactie met drie milliliter DMEM-media. Gebruik een vijf milliliter pipet om de cellen te verzamelen in 15 milliliter centrifuge buis, centrifuge, en vervolgens de cultuur van de cellen zoals beschreven in het manuscript. Om deze eerder voorbereide cellen te bestralen met behulp van de LINAC console software, het gaspedaal gantry en collimator ingesteld op nul graden, open de x en y kaken op een symmetrische vijf bij vijf vierkante centimeter veldgrootte, en trek de multileaf collimators.

Voeg ten minste vijf centimeter water-equivalent materiaal op de behandeling bank en plaats de cel schotel te worden bestraald op het in het midden van de LINAC crosshairs. Plaats de cellen op een diepte van maximale dosis in een zes megavolt röntgenstraal rond 1,5 centimeter en voeg een extra centimeter water-equivalent materiaal op de top van de schotel. Breng de vooraanwijzer aan op de kop van de LINAC en verleng deze totdat deze het oppervlak van het opbouwmateriaal raakt.

Pas de tabelhoogte aan tot de afstand van de bron tot het opbouwoppervlak 100 centimeter is. Verlaat de behandelingskluis, om ervoor te zorgen dat alle andere individuen zijn vertrokken. Controleer of er geen andere cellen in de kamer zijn en sluit vervolgens de kluisdeur.

Bevestig de veldgrootte, monitoreenheden en monitoreenheden per minuut op de console en schakel de straal in voor een stralingscel. Drie monsters van glioom stam-achtige cellen werden bereid met behulp van dit protocol en verzameld 24 uur na bestraling. Daar werden celcyclusprofielen berekend en weergegeven met de percentages cellen in verschillende fasen van de celcyclus.

G2-celcyclusarrestatie werd waargenomen na bestraling van glioomstamcellen met een standaarddosispercentage of een extra hoge dosissnelheid, vergeleken met niet-bestraalde controlecellen. Om de juiste dosis te laten leveren, is het het belangrijkste om de hoogte van de media in de kweekschotel te meten om ervoor te zorgen dat deze een centimeter bereikt. Na deze procedure kunnen andere biologische tests worden uitgevoerd, zoals immunostaining, westelijke vlek en celcyclusanalyse.

Aangezien deze procedure biedt de onderzoekers klinisch relevante dosis en dosis tarief instellingen, het kan worden gebruikt om de straling effect op veel celcultuur gebaseerde modellen te evalueren.