Beoordeling van zebravis lens Nucleus lokalisatie en Sutural integriteit

Onze protocollen vormen een uitgangspunt voor functionele studies van lensontwikkeling en fysiologie en voor omgekeerde genetische screening van lensfenotypes bij zebravissen. Onze protocollen overbruggen in vitro en in vivo analyses van zebrafish lens membraan morfologie en bieden een nieuwe en eenvoudige methode voor het kwantificeren van de ontwikkeling van zebravis lens optica. Het analyseren van zebravis lens morfologie en optica leidt tot inzichten in mechanismen die de ontwikkeling van de lens, normale fysiologie en pathofysiologie.

Deze inzichten kunnen op hun beurt leiden tot een vermogen om cataract te vertragen of te voorkomen. Er zijn geen meldingen geweest bij andere soorten dan zebravissen van asymmetrisch gelokaliseerde lenskernen. Het identificeren van lens hechtingen is van cruciaal belang voor het correct oriënteren van de lens om nucleus lokalisatie te meten.

Na bevestiging van voldoende sedatie met Tricaine, gebruik microdissection schaar om onmiddellijk accijns beide ogen van een volwassene of een larven zebravis en plaats beide ogen in een 35-millimeter op maat gemaakte petrischaal met een siliconen dissectie mal gevuld met PBS. Om de lens te oogsten van een volwassen zebravis, plaats het oog achterste kant omhoog en steek tangen in een minder dan 45-graden hoek door de optische schijf. Gebruik dissectie schaar om twee of drie radiale incisies te maken door het netvlies en sclera van de optische schijf naar de ciliary zone in het geïmmobiliseerde oog en schil terug het netvlies en sclera zoals bloemblaadjes.

Draai het oog, hoornvlies-kant omhoog, en gebruik de platte kant van de schaar om de lens indirect immobiliseren via manipulatie van de sclera en hoornvlies met behulp van tangen weg te trekken het netvlies en bijgevoegde weefsels, dan zorgvuldig trim weg overtollig weefsel van de lens. Voor larve zebravis lens oogst, plaats een larvale oog achterste kant omhoog op het vlakke deel van een siliconen schotel van PBS en gebruik een geslepen wolfraam naald om radiale bezuinigingen te maken door het netvlies en sclera terwijl immobilisatie van het oog met een andere naald of tangen, dan voorzichtig schep de lens van de gedoog met de stompe kant van een op maat gemaakte wolfraam-draad naald en zorgvuldig weg te trekken het bijgevoegde weefsel. Om de voorste aslens nucleus lokalisatie te meten, oriënteer je de vers uitgesneden lenzen axiaal in PBS in een 35-millimeter schotel met een afdekglas met de palen en hechtingen die parallel aan het vlak van focus zijn georiënteerd.

Om de lenskern te identificeren, zoekt u naar een verschil in de brekingsindex, die meestal optreedt op de interface van de lensschors en de lenskern. Als lens hechtingen zijn niet duidelijk, een lichte lik met tangen aan de lens capsule onthult de hechtingen en de lens kern, helpen oriënteren van de lens voor de meting. Plaats de schotel op het podium van een dissectie microscoop uitgerust met een camera en beeld de lenzen met de lens kern in focus onder brightfield verlichting of met differentiële interferentie contrast optica.

Afbeelding van een micrometer onder dezelfde vergroting voor kalibratie en klik op Live View. Klik op Momentopname om een afbeelding te verkrijgen en sla de afbeelding op als TIFF-bestand. Als u de verworven lensafbeeldingen wilt kalibreren, selecteert u in een geschikt softwareprogramma voor beeldverwerking het gereedschap rechte lijn en tekent u een lijn van bekende lengte op het beeld van de micrometer.

Klik op Schaal analyseren en instellen en voer de bekende afstand en eenheden in, selecteer vervolgens Globale kalibratie en klik op OK. Als u de afstand van het midden van de lenskern tot de voorste paal wilt meten, identificeert u de locatie van de lenshechting en gebruikt u het gereedschap rechte lijn om een lijn te trekken over het afgebeelde midden van de lenskern in een axiale oriëntatie. Het centrum van deze lijn is het midden van de lenskern. Teken een andere lijn van dit punt naar de voorste paal van de lens en selecteer Meten in het menu Analyseren om de afstand te meten.

Trek een andere lijn van de voorste paal naar de achterste paal en meet deze afstand als de lensdiameter, kopieer deze lengtes van het venster Resultaten naar een spreadsheet en bereken de genormaliseerde lokalisatie van de lenskern ten opzichte van de lensstraal. Door drie dagen na de bevruchting vormen zich voorste hechtingen aan de voorste pool en wordt de opvallende convergentie van cellen duidelijk gevisualiseerd door phalloïdine kleuring van de smalle vezelcelmembranen in vaste embryo's. Sterkere breedvezelcellabeling in lensmembraan gelokaliseerde mApple transgenic maakt live visualisatie van membraan subdomeinen mogelijk, maar mist de suturale convergentie.

Achterste hechtingen kunnen zowel in vitro als in vivo worden gevisualiseerd na drie dagen na de bevruchting. In een equatoriaal vlak, phalloidin sterk labels de buitenste corticale vezelcellen, onthullen een afgeplatte zeshoekige vorm. Phalloidin is uitgesloten van de verdichte lenskern en wilde type en mutant lens kijken niet te onderscheiden.

De sterke etikettering van brede vezelcellen in lensmembraan-gelokaliseerde mApple mozaïeken transgenics onthullen verstoringen in het celvolume in de mutant lens. Aangezien transgene expressie niet wordt beperkt door doorlaatbaarheid, sommige mozaïeken onthullen lens kern etikettering. Bij wilde dieren begint de lenskern dichter bij de voorste lenspool tijdens de vroege stadia van ontwikkeling voordat ze centraliseren tijdens de volwassenheid.

Expressie van groengelabelde eiwitten in een transgene gastheer waarin de celmembranen rood fluorescerend rood mogelijk maken, evenals de beoordeling van vezelcelmorfologie in vivo. Zebravissen zijn vooral geschikt voor in vivo studies. Met behulp van de hier beschreven tools kunnen we lensmechanismen, grotendeels bestudeerd in vitro, in een in vivo systeem onderzoeken.