Name: Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer celstamlijn-analyse met diSPIM-microscopie voor neuroontwikkeling in Caenorhabditis elegans embryo's. Deze methode volgt neuronale morfologie en celidentiteit met subcellulaire resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken John Murray voor geïntegreerde spanning, ujIs113, te genereren lineaging stam BV514; Brandon Harvey (NIBIB) voor hulp bij het testen van het Protocol; Jon Daniels en Gary Rondeau (toegepaste wetenschappelijke instrumentatie) voor hulp met Micro-Manager en diSPIM instrument; en Andrew York en Hank Eden voor hun kritische feedback op de diSPIM systeem. Wij danken ook het onderzoekscentrum voor minderheids instellingen programma en het Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) voor het verstrekken van een vergadering en brainstormen platform. Veel van dit werk werd uitgevoerd bij het mariene biologische laboratorium bij het gat van het hout door het programma van Whitman. Dit werk werd gesteund door de intramurale Onderzoeksprogramma's van het NIH Nationaal Instituut voor biomedische beeldvorming en Biotechniek en door NIH Grant No. U01-HD075602 en Nee. R24-OD016474. Mark W. Moyle werd ondersteund door F32-NS098616 en Leighton H. Duncan werd ondersteund door een diversiteit aanvulling op R24-OD016474.

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li>
<li>Bao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+tracing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage tracing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (8), 2707-2712 (2006).</li>
<li>Santella, A., Du, Z., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-local+neighborhood-based+framework+for+probabilistic+cell+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A semi-local neighborhood-based framework for probabilistic cell lineage tracing.</a> BMC Bioinformatics. 15, 217(2014).</li>
<li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580(2010).</li>
<li>Boyle, T. J., Bao, Z., Murray, J. I., Araya, C. L., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AceTree%3A+a+tool+for+visual+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AceTree: a tool for visual analysis of Caenorhabditis elegans embryogenesis.</a> BMC Bioinformatics. 7, 275(2006).</li>
<li>Katzman, B., Tang, D., Santella, A., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AceTree%3A+a+major+update+and+case+study+in+the+long+term+maintenance+of+open-source+scientific+software%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AceTree: a major update and case study in the long term maintenance of open-source scientific software.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 121(2018).</li>
<li>Murray, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+embryonic+gene+expression+with+cellular+resolution+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of embryonic gene expression with cellular resolution in C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (8), 703-709 (2008).</li>
<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+%28diSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li>
<li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Astronomical+Journal%22%5BJournal%5D)">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li>
<li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA%22%5BJournal%5D)">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Behavior.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+microManager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 14, Unit14 20 (2010).</li>
<li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIM-fluid%3A+open+source+light-sheet+based+platform+for+high-throughput+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging.</a> Biomedical Optics Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).</li>
<li>Ardiel, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Calcium+Flux+in+Freely+Moving+Nematode+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualizing Calcium Flux in Freely Moving Nematode Embryos.</a> Biophysical Journal. 112 (9), 1975-1983 (2017).</li>
<li>Walton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicoid+class+homeodomain+factors+ceh-36%2FOTX+and+unc-30%2FPITX+cooperate+in+C.+elegans+embryonic+progenitor+cells+to+regulate+robust+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Bicoid class homeodomain factors ceh-36/OTX and unc-30/PITX cooperate in C. elegans embryonic progenitor cells to regulate robust development.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005003(2015).</li>
<li>Altun, Z. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltun%2C+ZF+%22WormAtlas%22">WormAtlas</a>. , (2002).</li>
<li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryology%3A+In+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Press%22%5BJournal%5D)">Embryology: In the nematode C. elegans.</a> Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 8, 215-241 (1988).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314 (1165), (1986).</li>
<li>Bao, Z., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+Caenorhabditis+elegans+embryos+for+live+imaging+of+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2011).</li>
<li>Christensen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untwisting+the+Caenorhabditis+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Untwisting the Caenorhabditis elegans embryo.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Santella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormGUIDES%3A+an+interactive+single+cell+developmental+atlas+and+tool+for+collaborative+multidimensional+data+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">WormGUIDES: an interactive single cell developmental atlas and tool for collaborative multidimensional data exploration.</a> BMC Bioinformatics. 16, 189(2015).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first+version+of+the+Caenorhabditis+elegans+Promoterome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A first version of the Caenorhabditis elegans Promoterome.</a> Genome Research. 14 (10B), 2169-2175 (2004).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+transcription+factor+gene+duplication+from+Caenorhabditis+elegans+Promoterome-driven+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Insight into transcription factor gene duplication from Caenorhabditis elegans Promoterome-driven expression patterns.</a> BMC Genomics. 8 (27), (2007).</li>
<li>WormBase. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.wormbase.org">https://www.wormbase.org</a> (2019).</li>
<li>Lee, R. Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBase+2017%3A+molting+into+a+new+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">WormBase 2017: molting into a new stage.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), D869-D874 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

C. het is de enige organisme met de laatste posities en connectiviteit van elke volwassen neuron bekend27. De ontwikkelingsdynamiek die leidt tot de organisatie van de werkkringen en netwerken die de C. connectome is, blijft echter onbekend. Gebaseerd op kansen die uit vooruitgang in lichte microscopie voortkomen, kunnen wij de posities van de cel, morfogenese, en neurogenese door C. de embryonale ontwikkeling van het gebied nu vangen en analyseren.
De procedure die we hebben beschreven en die we regelmatig gebruiken in het Lab levert 4D-isotrope beelden van gelabelde neuronen en kernen voor cel-lineaging in C. de embryo's. Nog belangrijker, we hebben geoptimaliseerd op lange termijn imaging voorwaarden met de diSPIM en gekoppeld semi-geautomatiseerde lineaging mogelijkheden met hoge-resolutie beelden om de snelheid en precisie van het analyseren van C. embryogenese te verbeteren. Dit geïntegreerde protocol zal gebruikers toelaten om cellen en quantitate drie-dimensionale eigenschappen zoals neuriet migratie en Axon Fasciculatie door begin van het vroege trillen te visualiseren en te identificeren. Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast in elke faciliteit met een ASI diSPIM systeem, en we raden dit systeem speciaal voor dit protocol. Andere SPIM formules die commercieel worden aangeboden kunnen afwijken van de ASI-configuratie in de sample kamer en optische eigenschappen. Gegevens die vanuit andere platforms worden geëxporteerd, kunnen echter ook via onze gegevens pijplijn worden ingevoerd. Daarom is de beoordeling van hun waarde in lineaging, een veeleisende test van beeldkwaliteit en stabiliteit van het instrument, haalbaar. Alhoewel we actief de diSPIM gebruiken om andere specimens (zoals fruitvlieg en zebravis embryo's) regelmatig te verbeelden, is de beschreven en uitgebreide lineaging analyse van embryo's momenteel nog beperkt tot de nematodensoorten. Voor grotere of dikke monsters, kiezen we voor fase-Scanning benaderingen, die de monsters scannen via een stationaire licht plaat. Kumar et al. hebben eerder aangetoond dat deze verbeterde diSPIM sectioning om beelden van hoge kwaliteit van dikke monsters opbrengst zonder extra wijzigingen aan de diSPIM10.
De kritieke stappen binnen het protocol omvatten het opzetten van C. de embryo's van de poly-L-lysine met een laag bedekte dekglaasje, gegevensaanwinst, en gegevens-verwerking. Oogsten en monteren C. de embryo's van de dekglaasje op het glas kunnen uitdagend zijn voor onervaren gebruikers, maar hier bieden we een gedetailleerd protocol van belangrijke stappen om het leren te vergemakkelijken. Als de lange termijn beeldvorming gewenst is, krijgen we de beste resultaten oogsten vier-cel of eerder embryo's van 8-10 jonge volwassenen28. Merk op dat oude volwassenen minder wenselijk zijn om vroege embryo's te oogsten omdat ze de neiging hebben om oudere embryo's in de baarmoeder en onbevruchte eieren te bevatten. Met betrekking tot de montage van embryo's kunnen problemen zoals verstopping in de geassembleerde aspirator (mond pipet) of een te grote opening in de microcapillaire pipet een goede montage en oriëntatie van embryo's voorkomen. Om voor te bereiden op een optimale beeldvorming, voeren we pre-acquisitie testen op vroege en late pre-twitching embryo's om de prestaties van de licht platen, camera's, doelstellingen en autofocus te controleren. We krijgen de beste resultaten wanneer al deze operaties worden getest en leveren beelden van hoge kwaliteit tijdens onze pre-acquisitie testen. Dit is met name relevant voor het genereren van beelden met isotrope ruimtelijke resolutie, waarvoor RAW-beelden verkregen uit beide opvattingen (doelstellingen) moet van hoge kwaliteit. Na overname worden de voor elke weergave verworven volumes verwerkt om isotrope beelden op te leveren. Het is belangrijk om een geschikte GPU-kaart (graphics processing unit) te gebruiken zoals beschreven in dit Protocol (zie hieronder). Dit verbetert de verwerkingssnelheid waarmee de isotropically gesmolten beelden worden gegenereerd, verkorting van de tijd tot data-analyses. Het is ook noodzakelijk dat de gebruikers de recentste versie van CytoSHOW in werking stellen en de parameters gebruiken die met onze Download bundel voor StarryNite auto-lineaging worden verstrekt. Als gebruikers geïnteresseerd zijn in het gebruik van auto-lineaging voor andere monsters (bijv. zebravis, fruitvliegje enz.) dan is extra optimalisatie van de parameters gebruikt in StarryNite nodig zal zijn (zie verwijzingen3,4).
Hoewel ons geïntegreerd protocol afbeeldingen en lineaging resultaten oplevert in het pre-twitching embryo, moeten gebruikers zich ervan bewust zijn dat geautomatiseerde lineaging in het post-twitching embryo momenteel niet haalbaar is: de kern posities veranderen in de volgorde van seconden in de post-twitching embryo, te snel om Lineage tracking mogelijk te maken. Nochtans, heeft diSPIM inderdaad een veelbelovend vermogen aangetoond om neurologische gebeurtenissen te vangen en sommige cel posities in de post-twitching stadia van embryogenese23,29te volgen. Als gebruikers geïnteresseerd zijn in het onderzoek van de post-twitching embryo, de diSPIM doet de snelheid te verkrijgen volumetrische snapshots en track fijne neurologische gebeurtenissen, zoals neuriet uitgroei, in snel bewegende embryo's.
Dit protocol zal worden fundament voor de cel-voor-cel voltooiing van de WormGUIDES Atlas30, want het zal een geïntegreerde aanpak met hoge resolutie isotrope beelden te identificeren en te vangen 3D-morfologie van het label neuronen tijdens de eerste 430 minuten van embryogenese. Zoals het er nu, het prototype WormGUIDES Atlas biedt nucleaire posities van cellen in het ontwikkelende embryo en is gericht op het vastleggen van de ontwikkelingsdynamiek van een subset van embryonale neuronen. Dit protocol zal een sleutel zijn voor de integratie van extra ontwikkelings neuronen in de WormGUIDES Atlas30.
Ons geïntegreerd protocol zal ook het verkennen van nieuwe genexpressie profielen in het C. het embryo van de genen vereenvoudigen. In transgene C., vele cel-specifieke promotors ruimte en tijdelijk controle transgene uitdrukking. Hoewel de expressie patronen van de meeste genen zijn uitgebreid gekenmerkt in het volwassen dier31,32,33,34, bijna allemaal nog te worden gekenmerkt in de ontwikkelingslanden (met name het late stadium) embryo. De C. promoterome is een nuttige bron voor de worm Gemeenschap om cel-specifieke transgene expressie te rijden, en om te bepalen of gene functie cel-autonoom of niet-autonoom is. Het vastleggen van isotrope hoge-resolutie en dynamische expressie patronen van genen, en nauwkeurig identificeren van uitdrukken cellen via lineaging zal waardevol zijn voor velen in de wetenschappelijke gemeenschap.
Embryogenese bestaat uit twee met elkaar verweven belangrijke processen, cellulaire differentiatie en weefsel morfogenese. Er is een groot deel bekend over de mechanismen en moleculen die verschillende typen cellen definiëren tijdens de ontwikkeling van C.. Er is echter weinig bekend over de mechanismen die belangrijk zijn voor cel migratie, cel adhesie, en cel vorm in de C. het embryo. Met de C. de onveranderlijke lijn van de cel van d. van de variant gekend, ons protocol laat ons gemakkelijk de gecatalogiseerde 3D-microanatomie van het embryo tijdens morfogenese op nieuwe niveaus van detail onderscheiden: b.v., axon Fasciculatie, synaptogenese, en neuronale activiteit. Ardiel et al. hebben eerder aangetoond dat de kracht van de diSPIM om calcium voorbijgaande aard vast te leggen op het niveau van een enkele neuronen in C. de embryo's van de. Vele andere aspecten van Ontwikkelingsfysiologie zijn rijp voor onderzoek door deze methodes.
Tot slot, dit protocol is grotendeels geautomatiseerd en systematisch vermindert de tijd die het kost om dewinding beelden te genereren en uit te voeren Cell-lineaging via StarryNite en Acetree. De software strategieën die worden gebruikt in dit protocol kunnen worden toegepast op veel vragen van de biologie ver van de zeer specifieke gebieden waarin we hebben aangetoond dat ze hier.
Details over software compatibiliteit en download toegang
Informatie over micro-manager en plugins voor diSPIM Imaging zijn beschikbaar op http://dispim.org/software/micro-manager en https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
De gegevensverwerkings pijplijn vereist momenteel een Windows-besturingssysteem. Wij hebben één enkel archiefdossier gebundeld om installatie van alle vereiste gegevensverwerkende Programma's en steundossiers te vereenvoudigen. Het is beschikbaar voor download op http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) is gebaseerd op de wijd gebruikte en open source image analyse platform, ImageJ (v1). Java moet worden geïnstalleerd en up-to-date op de computer te gebruiken CytoSHOW, en updates voor CytoSHOW worden automatisch geïmplementeerd via Java Web Start. Veel ImageJ functies van CytoSHOW zijn zoals beschreven en geïllustreerd op https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW is aangepast om multidimensionale ruwe gegevens van de ASI diSPIM weer te geven, evenals andere imaging software die TIFF-uitgang creëert. In principe kunnen andere Multi-View SPIM imaging systemen worden ondersteund door kleine wijzigingen van CytoSHOW om dit protocol te laten uitvoeren op verschillende Microscoop systemen.

SpimFusion werd geschreven in CUDA/C++ met behulp van Visual Studio 2013 met CUDA Toolkit v 7.5. Running SpimFusion vereist specifieke computer hardware: een NVIDIA graphics processing unit (GPU) kaart met CUDA Compute Capability 1,0 of hoger en een minimum van 2 GB grafische kaart geheugen. Op het moment van publicatie van ons protocol, SpimFusion is ongepubliceerde (min Guo en Hari Shroff), maar beschikbaar in de software bundel archief hierboven vermeld.

Een speciaal gebouwde Command-Line gestuurde versie van StarryNite vereist dat de vrij beschikbare MATLAB compiler runtime is geïnstalleerd, maar vereist geen licentie voor commerciële MATLAB software. De MATLAB compiler runtime is opgenomen in de hierboven genoemde software bundel archief. De code voor StarryNite zoals gebruikt in dit protocol is hoofdzakelijk onveranderd van dat gebruikt voor confocale beelden6. Nochtans, zijn verscheidene operationele kwesties in de verwezenlijking van input beelden voor StarryNite verwerking en de behandeling van StarryNite resultaten hier behandeld door methodes in CytoSHOW die een ononderbroken gegevensverwerkings pijpleiding voor gesmolten isotrope toelaten diSPIM Volumes. Deze wijzigingen worden geautomatiseerd door CytoSHOW code die deze pre-en post-processing stappen verwerkt. CytoSHOW bewerkt ook een vooraf geoptimaliseerde diSPIM-specifieke sjabloon StarryNite parameter ingesteld om het segmentatie algoritme automatisch af te stemmen op de fluorescentie intensiteit van de kernen in de beeldgegevens. De unieke parameters gebruikt door StarryNite op elke diSPIM data set worden vervolgens opgeslagen in een bestand samen met de output image en lineaging gegevens.
Een aangepaste versie van AceTree die met 16-bits afbeeldingen werkt en compatibiliteit met Java3D-rendering onderhoudt, is het meest geschikt voor dit protocol. Het is ook opgenomen in de software bundel archief hierboven vermeld.

C. het enige organisme waarin elke cel in het embryo kan worden waargenomen door neurologische. Met de hele cel-Lineage bekend en invariante1, en met de ontwikkeling van nieuwe instrumenten die het mogelijk maken etikettering en continue beeldvorming van enkele cellen in embryo's, biologen kunnen nu beginnen met het onderzoeken van verschillende stappen in de ontwikkeling van de nematode nerveus systeem vanuit alle hoeken-cel geboorte; migratie en differentiatie; neuriet vorming, gerichte uitgroei en Fasciculatie; Synaps vorming; en tuning van functionele schakelingen. Het vastleggen van neuronale uitgroei dynamiek in het C. het embryo, door stabiel uitgedrukte verslaggevers en fluorescentie microscopie te combineren, is waardevol voor de wetenschappelijke gemeenschap.
Ontwikkelingsstudies in C. de varianten maken vaak gebruik van de invariante cel-lineage en de cel-lot kaarten van deze soort om contextueel begrip te vergroten op de single-cell niveau binnen het intacte organisme1. Auto-lineaging analyse-met behulp van StarryNite2,3,4 en AceTree5,6,7,8 software-voordelen van hoog contrast, hoge resolutie beelden van fluorescente kernen. Om optimaal te kunnen werken, is StarryNite/AceTree ook afhankelijk van voorspelbare gespannen oriëntatie van afgebeelde embryo's tijdens de ontwikkeling. Confocale microscopie, gedaan in C. de embryo's die tussen twee-dekglaasjes zijn gecomprimeerd, is al meer dan tien jaar de standaard auto-lineaging microscopie methode, omdat het zowel een hoog contrast/hoge resolutie biedt als een voorspelbare beperkte oriëntatie van het embryo7,8. We hebben eerder beschreven de bouw en het gebruik van een nieuwe licht-Sheet-based Dual-View omgekeerde selectieve vliegtuig Illumination Microscoop (diSPIM) voor Live Sample Imaging zoals C. embryogenese9,10 , 11 , 12 , 13. de licht-blad microscopie, in het algemeen, verstrekt lage fototoxischheid, hoge snelheid, en op lange termijn beeldvorming van levende 3D specimens14,15. De diSPIM methode, in het bijzonder, produceert vier-dimensionale (4D) beelden met bijna isotrope ruimtelijke resolutie van ongeveer 330 nm9.
Vergeleken met confocale microscopie, diSPIM biedt hogere signaal-ruis en snelheid, meer isotrope ruimtelijke resolutie, en is meer geschikt voor lange termijn in vivo Imaging16. We hebben daarom gewerkt aan de aanpassing van diSPIM gegevens voor input in StarryNite/AceTree en onderzocht of dit de lineaging analyses zou verbeteren. Een belangrijke hindernis is dat de diSPIM specimens niet gemakkelijk door eierschaal-compressie kunnen worden beperkt om verwachte richtlijnen voor StarryNite/AceTree goed te keuren. Willekeurige oriëntatie van de cel posities in het volume wordt geanalyseerd degradeert de nauwkeurigheid van de auto-lineaging analyse.
Wij werkten daarom CytoSHOW, een kijker-geleide gebruikersinterface die gebruikers toestaat om nauwkeurige 3D richtlijn van embryo's tijdens pre-processing van diSPIM beelden te selecteren, opbrengend beeldgegevens die zowel kwaliteit-geoptimaliseerde als context-bewust voor input in StarryNite /AceTree. Bij de gebruiker-selectie van afgebeelde embryo's, CytoSHOW orkestreert een geautomatiseerde verwerking van gegevens pijpleiding. Bijgesneden en op de achtergrond afgetrokken embryo beelden worden opgeslagen in TIFF stack bestanden voor elke positie, timepoint en View. CytoSHOW dan iteratief roept het programma SpimFusion te co-register en gezamenlijk deconvolve de twee pre-processed views, met behulp van de Richardson-Lucy17,18 algoritme om isotrope hoge resolutie volumetrische beelden opleveren. Een diSPIM reeks parameters is geoptimaliseerd voor StarryNite om zijn gedrag tijdens beeld-segmentation en kern-volgt in isotropically gesmolten beelden te regeren. Gesmolten beelden en lineaging resultaten worden vervolgens bewerkt met behulp van AceTree, die gebruikers in staat stelt te identificeren en eventuele fouten in de auto-Lineage Trace gegenereerd door StarryNite vast te stellen. AceTree kan ook voorstellen Lineage-boom en 3D gemodelleerde renderings van bijgehouden kernen in het embryo. We vinden dat auto-lineaging snelheid en nauwkeurigheid zijn aanzienlijk verbeterd met behulp van isotropically gesmolten beelden, in vergelijking met RAW-beelden van een van beide SPIM camera. Ons protocol, geoptimaliseerd voor de C. -toepassing die hier wordt beschreven, kan in het algemeen worden aangepast voor auto-Lineaging van diSPIM gegevens die voor andere soorten of specimens worden geproduceerd. Als dit het beoogde gebruik van het protocol is, gelieve te noteren dat extra tuning van de StarryNite parameters waarschijnlijk vereist zal zijn voor nieuwe specimens, zoals beschreven in3,4.
Succesvolle implementatie van dit protocol resulteert in beelden met 4D-isotrope resolutie en stelt biologen in staat om cellen te traceren, terwijl het gelijktijdig identificeren en analyseren van neuronen in de ontwikkelingslanden C. het embryo. Bovendien, door het samenvoegen van verschillende post-processing algoritmen-met hardwareversnelling is de meest tijdrovende van deze-kunnen we nu analyseren zowel fijne subcellulaire Details en de cel-lineages en cel-lot van levende embryo's in wezen real-time. Dit nieuwe protocol staat nauwkeurige, geïnformeerde manipulatie en observatie van het gedrag van de cel toe tijdens bewijzende studies van differentiatie en morfogenese in vivo. In dit manuscript presenteren we een gedetailleerde uitleg van de verbeterde protocollen die we hebben ontwikkeld voor lineaging en Cell tracking in de ontwikkeling van C. de embryo's van de, om studies van embryogenese, genexpressie of neurologische te verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Stappen 1-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concavity slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1519006</td><td>5-18mm diameter, 0.6-0.8mm diep, 1.2-1.5mm</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop met 10x-50x zoombereik</td><td>Motic</td><td>SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Glazen deksels, nr. 1.5, 24 x 50 mm</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>M9-buffer</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>Methylcellulose &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509-25G</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaire pipette aspiratorbuis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaire pipettes, 0,4 mm i.d</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-800</td><td></td></tr><tr><td>Naald, nr. 18G x 1 &frac12; (1,2mm x 40mm)</td><td>BD Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NGM-platen</td><td></td><td></td><td>bereid zoals beschreven door Brenner (1974)</td></tr><tr><td>O-ring voor beeldvormingskamer</td><td>O-Rings West</td><td>M1.5X40</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipet</td><td>Corning/Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095D5X</td><td></td></tr><tr><td>Platinedraad, 0,5 mm diameter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267201</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen rechthoekige kamer (76,0 mm x 50,5 mm)</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td>I2450</td><td></td></tr><tr><td>Worm Eyelash Pick</td><td></td><td></td><td>Hart, A. C. Gedrag. WormBook.&nbsp; (2006).</td></tr><tr><td>Worm Pick</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Stappen 5-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm longpass-filter</td><td>Semrock</td><td>LP02-488 RU-2</td><td></td></tr><tr><td>561-nm notch-filter</td><td>Semrock</td><td>NF03-561E-25</td><td></td></tr><tr><td>BLP02-561R-25, aantal 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>561 nm EdgeBasic beste waarde langpass randfilter</td></tr><tr><td>Besturingssoftware voor onderste camera</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>ProgRes CapturePro</td></tr><tr><td>diSIPM-assemblagevideo</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com</td></tr><tr><td>diSPIM-uitlijningsvideo</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td></tr><tr><td>diSPIM-beeldvormings-pc</td><td>Intel</td><td></td><td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 kernen in totaal, 64 GB geheugen, Windows 7</td></tr><tr><td>FF01-525/45-25, aantal 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>525/45 nm BrightLine enkele bandbandpassfilter</td></tr><tr><td>FF555-DI03-25X36, aantal 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>555 nm rand BrightLine enkele rand dichroische beamsplitter</td></tr><tr><td>Beeldvormings-pc grafische kaart</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti grafische kaarten</td></tr><tr><td>Kumar et al diSPIM-setup</td><td>Applied Scientifics Instrumentations (ASI)</td><td></td><td>Instrumentensetup voor dit protocol is identiek aan Kumar et al 10,11 &nbsp;diSPIM, dat gebruik maakt van 40x 0.8NA waterimmersielenzen voor beeldvorming. (Zie stappen 5.1 en opmerking)</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Wijzigingen in Kumar et al diSPIM-setup (zie hieronder)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische tafel met isolatoren, 4 voet &times; 6 voet &times; 12 inch</td><td>TMC</td><td>784-651-02DR en 14-416-34</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Stappen 7-10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyse-pc</td><td>Intel</td><td></td><td>Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 kernen in totaal, 64 GB geheugen, Windows 10</td></tr><tr><td>Analyse-pc grafische kaart</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti grafische kaarten</td></tr><tr><td>Installatie-instructies</td><td>Softwarebundel</td><td></td><td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td></tr><tr><td>Softwarebundel</td><td>Softwarebundel</td><td></td><td>http://dispimlineage.wormguides.org</td></tr></tbody></table>

isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde cell lineage analyses catalogus caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis (C.het is de enige organisme waarin de uitdaging van het begrijpen van de cellulaire oorsprong van een volledig zenuwstelsel kan worden waargenomen, met een enkele cel resolutie, in vivo. Hier presenteren we een geïntegreerd protocol voor het onderzoek van neurologische in C. de embryo's van de. Ons protocol combineert Imaging, lineaging en neuroanatomische tracering van enkelvoudige cellen in het ontwikkelen van embryo's. We bereiken op lange termijn, vier-dimensionale (4D) beeldvorming van levende C. de embryo's van de isotrope met bijna ruimtelijke resolutie door het gebruik van Dual-View omgekeerde selectieve vliegtuig verlichting microscopie (diSPIM). Kernen en neuronale structuren in de nematoden embryo's zijn afgebeeld en isotropically gesmolten om beelden te leveren met een resolutie van ~ 330 nm in alle drie de afmetingen. Deze miniem-door-minieme hoge resolutie 4D gegevensreeksen worden dan geanalyseerd om definitieve cel-Lineage identiteiten met gen uitdrukking en morfologische dynamica bij eencellige en subcellulaire niveaus van detail te correleren. Ons protocol is gestructureerd om modulaire uitvoering van elk van de beschreven stappen mogelijk te maken en studies over embryogenese, genexpressie of neurologische te verbeteren.

We hebben eerst de levensvatbaarheid van embryo's afgebeeld met behulp van de parameters van het protocol voor diSPIM acquisitie (secties 1-6) gevalideerd. Tien embryo's werden gelijktijdig afgebeeld bij 20 °C, één volume/embryo/minuut, van de 2-Cell fase tot de 2-voudige fase (7,5 uur, 451 volumes/embryo). Om te controleren cel divisies in embryogenese, gebruikten we stam BV514, die ubiquitously drukt de mCherry::histone reporter construeert uit de geïntegreerde transgene array ujIs11324. Figuur 6 toont een tijdlijn van deze eerste helft van de embryonale ontwikkeling voor een van de afgebeelde embryo's. Elke afbeelding vertegenwoordigt een projectie met een maximale intensiteit van één weergave (geproduceerd door stap 7-8) van het afbeeldings embryo. Wij vonden dat de geoptimaliseerde protocollen geen waarneembare fototoxischheid aan de embryo's veroorzaakten, zoals die door timing van celdeling (niet getoond) worden beoordeeld, tijd van het uitbroeden, en timing met betrekking tot ontwikkelings mijlpalen (Figuur 6 en verwijzingen1 , 25 , 26).
Vervolgens hebben we het protocol toegepast om de groeidynamiek van enkele neuronen in het ontwikkelen van embryo's te analyseren. We imaged DCR7692 (olaex4655), een transgene nematode stam die uitdrukt GFP uit de neuropeptide FLP-19 promotor in een subset van niet-geïdentificeerde cellen (DACR2819, PFLP-19 (3.6 KB):: Syn21:: GFP:: CAAX::p 10 3 ' UTR) . Naar aanleiding van de stappen van het protocol hier uiteengezet, hebben we vastgesteld dat de niet-geïdentificeerde cellen overeenkomen met motorische neuronen RMDDL en RMDDR, de uitscheidings Canal Cell, en twee spiercellen (Figuur 7). Vervolgens hebben we onderzocht en gekwantificeerd de uitgroei dynamiek van de RMDDL en RMDDR neuronen. We merkte op dat de RMDDL en RMDDR neuronen zijn schuin gevormd zo vroeg 360 minuten na de bevruchting, met de langere cellulaire as die de daaropvolgende as voor neuriet uitgroei (Figuur 7 en film S1). Met behulp van de "Simple neuriet tracing" plugin in FIJI en toe te passen op 3D reconstructies van isotropically gesmolten volumes, we vervolgens gekwantificeerd de stereotiepe uitgroei van de RMDDL en RMDDR neurites voor zes embryo's. We hebben vastgesteld dat de groeidynamiek werd gestereotypeerd voor RMDDL en RMDDR over embryo's (hierin genoemd RMDDs). Vanaf 385-410 minuten na de bevruchting, de RMDDs neurites Extended 6.0 ± 0,5 µm (mean ± SEM; n = 12 neurites) anterior van de cel lichamen (figuur 7b, C, I). Vanaf 415-445 minuten na de bevruchting, zowel neurites uit te breiden dorsaal in en rond de vermoedelijke zenuw ring (asterisk in figuur 7d). Gemiddeld, elke RMDD neuriet uitgebreid 11,0 ± 0,6 µm (mean ± SEM; n = 12 neurites) van het cel lichaam vóór synchroon het ontmoeten van zijn contralaterale tegenhanger bij de top van de ring (figuur 7I). Belangrijk is dat onze representatieve resultaten aantonen dat we in staat zijn te onderzoeken, te vergelijken en te kwantificeren neuronale ontwikkelings functies voor enkelvoudige identificeerbare cellen met behulp van onze geïntegreerde Protocol (Figuur 7 en Figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> Figuur 1: diSPIM steekproef montage Setup. Avoorbereiding van dekglaasje met poly-L-lysine. In de inzet, 10 µ L van poly-L lysine werd gebruikt om de vacht van de dekglaasje voor 5 minuten. Poly-L-lysine kan het embryo eierschaal vast te houden aan de dekglaasje in de rechthoek. Bschematische weergave van de staal Imaging kamer en de gemonteerde kamer. In de inzet, representatieve embryo's zijn georiënteerd met de voorste-posterior as loodrecht op de lange as op de dekglaasje. (C) gemonteerde aspirator buis met microcapillaire pipet. (D) staal Imaging kamer gemonteerd in monsterhouder onder diSPIM 40x doelstellingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> Figuur 2: diSPIM Imaging Setup op lange termijn in Micro-Manager. (A) aanbevolen diSPIM Laser Power parameters (rode rechthoek) geoptimaliseerd voor langdurige beeldvorming, terwijl het verminderen van fototoxiciteit (zoals beoordeeld door hogere broed snelheid van C. de embryo's van de. Reeks 561 de laser van nm aan 79 µW (0,25) en 488 nm laser aan 179 µW (0,5). Merk op dat de exacte kalibratie van software-instellingen op laservermogen varieert tussen diSPIM installaties. Het wordt aanbevolen dat de gebruikers meten en kalibreren van de laservermogen om 79 µW (561 nm) en 179 µW (488 nm) laservermogen te bereiken. (B) diSPIM parameters voor het opslaan van gegevens (groene rechthoek), volume-instellingen (blauw vierkant), en slice-instellingen (oranje vierkant). (C) diSPIM autofocus parameters voor lange-termijn beeldvorming van C. embryogenese (Zie stappen 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> Afbeelding 3: beeld visualisatie en gegevensverwerkings instellingen met CytoSHOW. (A) RAW diSPIM beelden geopend door CytoSHOW. CytoSHOW is in staat om beelden te openen die door zowel camera wegen (SPIM A en B) worden gevangen. Deze ruwe beelden worden geopend in multidimensionale Vensters genoemd diSPIM monitor. In diSPIM monitorwordt een "bowtie patroon" gegenereerd om de voorste, achterste, dorsale en buik randen van het embryo te selecteren (zie stap 9,1). Bow-tie selecties geven het embryo oriëntatie voor dewinding en StarryNite-Assisted lineaging tracing. (B) geoptimaliseerde parameters gebruikt voor het genereren van isotrope beelden. Stel in het Deconvolved tijdens het verwerven van het venster de parameters in die zijn opgegeven in stappen 9.5.1-9.5.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> Figuur 4: diSPIM cameraconfiguratie. (A) foto van diSPIM camera plaatsingen en oriëntaties. (B) voorstelling van + 90-graden rotaties van spim A om de verzamelde spim B-beelden te evenaren. (C) input volumes ten opzichte van oriëntatie-index + 1 op basis van onze diSPIM cameraconfiguratie (zie stap 9.5.2). Wij roteren SPIM een beeld (s) + 90 graden rond Y-as vóór registratie om SPIM B beeld (s) aan te passen. Schaal staven = 10 µm. beelden zijn representatieve Single-View, maximale intensiteit projecties en dewindion beelden van 1,5-voudige embryo met gelabelde kernen (561-nm, rood) en neuronen (488-nm, groen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> Figuur 5: curatie en bewerking C. de embryonale afstamming in AceTree. (A) we gebruiken AceTree om de lijn sporen van StarryNite te bewerken (zie referenties5,6,8; manuscripten zijn ook opgenomen in onze Download bundel). AceTree zal C. de systematische namen van elke kern (groene rechthoek) na voltooiing van stappen 10.1-10.2 tonen. Dit venster (a) geeft informatie (zwarte rechthoek) over elke cel in de Lineage trace (ABa, gemarkeerd in blauw) die gebruikers helpen begeleiden bij het bijhouden en bewerken van de Lineage sporen. Het wordt aanbevolen dat gebruikers te verifiëren en te vergelijken lineaged cellen en hun posities aan de C. de embryonale stamcel lijn die eerder door Sulston et al.1 is gerapporteerd bovendien, als gebruikers geïnteresseerd zijn in het lokaliseren van specifieke cellen in de deconvolved data-serie (zie hieronder, B) Voer de systematische naam C. -in in de zoekbalk (oranje rechthoek). (B) de deconvolved gegevensreeks van de gebruiker wordt ook automatisch geopend na voltooiing van de stappen 10.1-10.2. Hier weergegeven een isotropically gesmolten beeld van een vier-Cell fase embryo met kernen gelabeld in het rood. Tijdens het volgen van een kernen, moeten gebruikers veranderen de intensiteit van het beeld (rode vierkant) en navigeren door de tijd en z met behulp van de pijltjestoetsen op hun toetsenbord (tijd-links/rechts, z-up/down). (C) 3D Cartoon van de timepoint in (B) met bepaalde functionaliteiten (paarse rechthoek) die het mogelijk maakt draaibare 3D-visualisatie. Voor een overzicht van AceTree en zijn 3D functionaliteit, zie verwijzingen5,6,8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> Figuur 6: getimede ontwikkelingsdynamiek van C. de embryo's van de diSPIM. Bovenste paneel, diSPIM beelden die de eerste helft van de embryonale ontwikkeling voor een van de afgebeelde embryo's (stam BV514 ujIs11324). Embryo's werden voortdurend afgebeeld, elke minuut voor 7,5 uur (bij 20 ° c). De eerste twee beelden van het bovenste paneel vertegenwoordigen 4-en 8-cel embryo's met kernen (rood) en posities van polaire lichamen (dichte rode bollen, gemarkeerd met blauwe sterretjes). Elk beeld vertegenwoordigt een Single-View maximale intensiteit projectie van de afgebeelde embryo. Schaal staven = 10 µm. De chronologie (horizontale staaf) vertegenwoordigt notulen post bemesting (m.p.f.) van de ontwikkeling van C. de embryo's van de van de. Wij bevestigden dat de parameters van ons protocol voor diSPIM aanwinst geen waarneembare fototoxiciteit aan de afgebeelde embryo's veroorzaakten zoals die door levensvatbaarheid, timing van cel afdelingen, timing van het uitbroeden en timing van ontwikkelings mijlpalen worden beoordeeld (zie verwijzingen 1 , 25 , 26). we merken op dat de timing van de ontwikkelings-mijlpalen is reproduceerbaar over embryo's met onze imaging parameters (SEM ± 8,174 minuten voor 6,4 uur lange Imaging sessies; n = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> Figuur 7. Cellulaire identificatie en enkelvoudige cel karakterisering van neuriet ontgroei dynamiek in de ontwikkeling van C. de embryo's. Dual-Color beeldvorming van een stam gemaakt door kruising BV514 ujIs11324 (voor lineaging) en DCR7692 (olaex4655), een transgene nematode stam die uitdrukt GFP uit de neuropeptide FLP-19 promotor in een subset van niet-geïdentificeerde cellen. (a-H) Naar aanleiding van de stappen van het protocol hier uiteengezet, hebben we vastgesteld dat de niet-geïdentificeerde cellen overeenkomen met motorische neuronen RMDDL en RMDDR (gele pijlen), de uitscheidings Canal Cell (blauwe pijlen), en twee spiercellen (witte pijlen). (I) kwantificering van de uitgroei dynamiek van de RMDDL en RMDDR neuronen met behulp van Fiji plugin "Simple neuriet tracering" en toe te passen op 3D reconstructies van isotropically gesmolten volumes. Merk op hoe zowel RMDDL en RMDDR stereotype uitgroei dynamiek tonen, elk die synchroon voor een totale lengte van 11.0 ± 0.6 µm (gemiddelde ± SEM uitbreidt; n = 12 neurites) en vergadering bij de dorsale top van zenuw ring (Zie ook Movie S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> Figuur 8: onderzoek van isotrope diSPIM beelden van neuronale morfologie in C. de embryo's van het type. Isotrope visualisatie van AVHL en AVHR neuronen (gele pijlen). Met behulp van de diSPIM, neuronale morfologie kan worden gevangen opleveren vier-dimensionale (4D) beelden met isotrope ruimtelijke resolutie van ongeveer 330 nm. De diSPIM staat gebruikers toe om beeld volumes met identieke resolutie in alle richtingen vrijwel te roteren. Beelden in A-D zijn maximale intensiteits prognoses van dezelfde isotropically gesmolten diSPIM beeld volume van verschillende rotaties rond de lange as van het embryo. Schaal staven = 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Supplementaire film S1: C. het embryo van de ontwikkeling van 280 tot 434 minuten post bemesting. Isotrope film van stam DCR7692 (olaex4655) het uitdrukken van UJIS113 ubiquitously met DACR2819 dun etikettering RMDD neurites (figuur 7A-D, gele pijlen). DACR2819 ook labels twee spiercellen (figuur 7A-d, witte pijlen) en uitscheidings Canal Cell (figuur 7A-d, blauwe pijl) tijdens de embryonale ontwikkeling (figuur 7A-d). Schaal staven = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">gelieve Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Dit protocol maakt het mogelijk om cellijnen en identiteiten efficiënt te traceren in levende embryo's en tegelijkertijd gedetailleerde celmorfologieën zoals axonen en dendrieten te analyseren bij het ontwikkelen van C.elegans neuronen. In vergelijking met confocale microscopie biedt dual-view omgekeerde selectieve vlakverlichtingsmicroscopie of diSPIM een hoger signaal naar ruis, meer isotropische ruimtelijke resolutie en is beter geschikt voor lange termijn in vivo beeldvorming. Begin met het toevoegen van 500 microliters van 1%methylcellulose oplossing in de depressie van een concave microscoop dia.Met behulp van een platina draadpluk, breng volwassenen van een nematode groeimediumplaat naar de M9 methylcellulose oplossing. Gebruik de geslepen uiteinden van 18 meter hypodermische naalden om elk dier dwars in het midden van het lichaam te snijden tot ten minste een tot vier cel embryo's. Met een aspirator mondstuk zachtjes tussen de tanden gehouden, prefill een microcapillaire pipet met 10 tot 15 microliter M9 buffer en zachtjes aanzuigen verschillende embryo's uit de glijbaan in de capillaire.Doe de embryo's in de centrale rechthoek van de coverslip van een stalen beeldkamer gevuld met verse M9 buffer. Oriënteer de embryo's voorzichtig verticaal, zodat de lange as van elk embryo loodrecht staat op de lange as van de coverslip. Plaats vervolgens de stalen beeldkamer in de monsterhouder op het podium van een diSPIM.Om de embryo's voor te bereiden op beeldvorming, open micromanager en stel de laserintensiteiten in op 179 microwatt 0,5% equivalentie voor 488 nanometer en 79 microwatt 0,25% equivalentie voor 561 nanometer. De kalibratie tussen softwareaanpassing en echte laseroutput moet van tevoren worden uitgevoerd om de ruimte voor specifieke microwatt te bepalen. Selecteer in het menu plug-ins apparaatbesturing en toegepaste wetenschappelijke beeldvorming diSPIM om het toegepaste wetenschappelijke beeldvormingsduimmaging dual-view omgekeerde selectieve vlakverlichtingsmicroscopievenster te openen.Controleer onder het acquisitietabblad of de parameters zijn ingesteld zoals aangegeven. Stel onder het tabblad autofocus de aangegeven parameters in. Houd er rekening mee dat het autofocuskanaal het nucleaire fluorescentiekanaal moet opgeven voor de geplande lineaging-experimenten.Controleer de balk en bladvakken voor pad A of B en klik live om de afbeeldingsverwerving te beginnen. Er wordt een live view venster geopend. Teken vervolgens een vak rond het embryo van belang om het autofocus-analysegebied van het embryo te selecteren en klik op startacquisitie om de multidimensionale beeldopname op lange termijn te starten.Voor beeldweergave, verwerking en cellijnanalyse dubbelklikt u na het downloaden en extraheren van de softwarebundel op het CytoSHOW_app jnlp-bestand om cytoSHOW te gaan uitvoeren. Selecteer onder het bestandsmenu de nieuwe en diSPIM-monitormicromanager om de map met hoofdgegevensset te vinden waarin de raw-afbeeldingen van microbeheer zijn opgeslagen.Selecteer de map met het tijdstippunt en klik op Openen. Multidimensionale navigatievensters worden automatisch geopend voor zowel SPIM A als SPIM B.Met behulp van het polygoonselectiegereedschap klikt u net buiten de voorste, achterste, rug- en ventrale randen van het embryo van belang om een vlinderdaspatroon over het embryo te genereren in zowel de SPIM A- als DE SPIM B-weergaven en klik op diSPIM. Lijn de groene en rode kanalen voor elke SPIM-arm uit en klik nogmaals op diSPIM.De verschuivingen worden geactiveerd in alle andere positievensters. Klik vervolgens op diSPIM en zekering om het dialoogvenster gedeconvolveerde zekering diSPIM-onbewerkte gegevensvolumes te openen en de parameters in te stellen zoals aangegeven. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op ja en geeft u de uitvoermap op waarin de verwerkte bestanden kunnen worden opgeslagen voordat u op OK klikt. Verplaats in het voorbeeldvenster de t-scrollbalk naar tijdpunt twee van het venster en verplaats de z-slider totdat de weergave direct langs de lange as van het embryo wordt weergegeven.Verplaats de t-scrollbalk terug naar tijdpunt één in het voorbeeldvenster en gebruik het gereedschap Lijnselectie om een lijn te trekken uit de meest ronde kern van de ventrale kern door het vlak van de AB-celmetafafaseplaten. Klik op de diSPIM-voorbeeldknop om de fijne aanpassingen aan de richting van het voorvertoningsvolume op te slaan. Stel de t-scroll-balken van de diSPIM-monitorvensters in op de begin- en eindtijdpunten van de volledige reeks afbeeldingen die moeten worden verwerkt.Klik vervolgens op OK. Voor een efficiënte en nauwkeurige analyse van de cellijn is het van cruciaal belang om een nauwkeurige ADL-oriëntatie van de gegevensvolumes te bereiken voorafgaand aan de verwerking van Starry Night. Als u de starry night-lijntraceringsreeks in AceTree wilt openen, opent u het meegeleverde aangepaste AceTree-bestand en selecteert u geopend configureren bestand om de eerder aangegeven uitvoermap te vinden. Open de smeltondermap voor het embryo van belang en selecteer het bewerkte bestand.Klik vervolgens op Openen en ga verder met de lineagevisualisatie en bewerking zoals eerder beschreven. Geoptimaliseerde protocollen veroorzaken geen detecteerbare fototoxiciteit aan de embryo's zoals beoordeeld door de tijd van het uitkomen en de timing in verband met ontwikkelingsmijlpalen. Met behulp van dit protocol zoals aangetoond, de niet-geïdentificeerde cellen in deze transgene groene fluorescerende eiwit uitdrukken aaltjes stam werden bepaald om te corresponderen met motorneuronen, de excretie kanaal cel, en twee spiercellen.De geïdentificeerde neuronen werden schuin gevormd al 360 minuten na bevruchting met de langere cellulaire as die de daaropvolgende as voor neurite uitgroei. Van 385 tot 410 minuten na de bevruchting strekten de RMDD-neurites zich uit over ongeveer zes micrometer voorste van de cellichamen. Van 415 tot 445 minuten na de bevruchting, beide neurites uitgebreid dorsaal in en rond de vermoedelijke zenuwring.Gemiddeld strekte elk RMDD neurite zich uit op ongeveer 11 micrometer van het cellichaam voordat het synchroon zijn contralaterale tegenhanger aan de top van de ring ontmoette. Samen tonen deze gegevens aan dat neuronale ontwikkelingskenmerken voor enkele identificeerbare cellen kunnen worden onderzocht, vergeleken en gekwantificeerd met behulp van dit geïntegreerde protocol. Het is belangrijk om te onthouden om de embryo's verticaal te oriënteren, zodat de lange as van elk embryo loodrecht staat op de lange as van de coverslip.Met behulp van dit protocol zijn we begonnen met het verkennen van het ontluikende embryonale zenuwstelsel vanuit alle hoeken. Bijvoorbeeld tijdens celgeboorte, migratie en differentiatie, neuritevorming, uitgroei en fasciculatie.

isotropic-light-sheet-microscopy-automated-cell-lineage-analyses-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Dit artikel beschrijft een techniek voor de visualisatie van de vroege gebeurtenissen van embryogenese in de...

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's.

Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor<em&gt; In Toto</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt; Ontwikkeling

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Deze studie schetst kwantitatieve metingen van synaptische grootte en lokalisatie, spier morfologie, en mitochondriale vorm in C. elegans met behulp van vrij beschikbare beeldverwerkings hulpmiddelen. Deze aanpak maakt het mogelijk toekomstige studies in C. elegans te kwantificatief vergelijken de omvang van weefsel en organel structurele veranderingen als gevolg van genetische mutaties.

Kwantitatieve benaderingen voor de studie van cellulaire structuren en organelle morfologie in Caenorhabditis elegans

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en monteren van Caenorhabditis elegans-embryo's , het registreren van de ontwikkeling onder een 4D-microscoop en het traceren van de cellijn.

4D-microscopie: Caenorhabditis elegans embryonale ontwikkeling ontrafelen met behulp van Nomarski-microscopie

Dit protocol beschrijft op microfluïdische wijze gebaseerde C. elegans time-lapse-beeldvorming gedurende de gehele post-embryonale ontwikkeling.

Beeldvorming van C. elegans met hoge resolutie in alle larvale stadia

Leer celstamlijn-analyse met diSPIM-microscopie voor neuroontwikkeling in Caenorhabditis elegans embryo's. Deze methode volgt neuronale morfologie en celidentiteit met subcellulaire resolutie.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie (Video) | JoVE Journal

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Meer video's verkennen