Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Dit protocol maakt het mogelijk om cellijnen en identiteiten efficiënt te traceren in levende embryo's en tegelijkertijd gedetailleerde celmorfologieën zoals axonen en dendrieten te analyseren bij het ontwikkelen van C.elegans neuronen. In vergelijking met confocale microscopie biedt dual-view omgekeerde selectieve vlakverlichtingsmicroscopie of diSPIM een hoger signaal naar ruis, meer isotropische ruimtelijke resolutie en is beter geschikt voor lange termijn in vivo beeldvorming. Begin met het toevoegen van 500 microliters van 1%methylcellulose oplossing in de depressie van een concave microscoop dia.

Met behulp van een platina draadpluk, breng volwassenen van een nematode groeimediumplaat naar de M9 methylcellulose oplossing. Gebruik de geslepen uiteinden van 18 meter hypodermische naalden om elk dier dwars in het midden van het lichaam te snijden tot ten minste een tot vier cel embryo's. Met een aspirator mondstuk zachtjes tussen de tanden gehouden, prefill een microcapillaire pipet met 10 tot 15 microliter M9 buffer en zachtjes aanzuigen verschillende embryo's uit de glijbaan in de capillaire.

Doe de embryo's in de centrale rechthoek van de coverslip van een stalen beeldkamer gevuld met verse M9 buffer. Oriënteer de embryo's voorzichtig verticaal, zodat de lange as van elk embryo loodrecht staat op de lange as van de coverslip. Plaats vervolgens de stalen beeldkamer in de monsterhouder op het podium van een diSPIM.

Om de embryo's voor te bereiden op beeldvorming, open micromanager en stel de laserintensiteiten in op 179 microwatt 0,5% equivalentie voor 488 nanometer en 79 microwatt 0,25% equivalentie voor 561 nanometer. De kalibratie tussen softwareaanpassing en echte laseroutput moet van tevoren worden uitgevoerd om de ruimte voor specifieke microwatt te bepalen. Selecteer in het menu plug-ins apparaatbesturing en toegepaste wetenschappelijke beeldvorming diSPIM om het toegepaste wetenschappelijke beeldvormingsduimmaging dual-view omgekeerde selectieve vlakverlichtingsmicroscopievenster te openen.

Controleer onder het acquisitietabblad of de parameters zijn ingesteld zoals aangegeven. Stel onder het tabblad autofocus de aangegeven parameters in. Houd er rekening mee dat het autofocuskanaal het nucleaire fluorescentiekanaal moet opgeven voor de geplande lineaging-experimenten.

Controleer de balk en bladvakken voor pad A of B en klik live om de afbeeldingsverwerving te beginnen. Er wordt een live view venster geopend. Teken vervolgens een vak rond het embryo van belang om het autofocus-analysegebied van het embryo te selecteren en klik op startacquisitie om de multidimensionale beeldopname op lange termijn te starten.

Voor beeldweergave, verwerking en cellijnanalyse dubbelklikt u na het downloaden en extraheren van de softwarebundel op het CytoSHOW_app jnlp-bestand om cytoSHOW te gaan uitvoeren. Selecteer onder het bestandsmenu de nieuwe en diSPIM-monitormicromanager om de map met hoofdgegevensset te vinden waarin de raw-afbeeldingen van microbeheer zijn opgeslagen.

Selecteer de map met het tijdstippunt en klik op Openen. Multidimensionale navigatievensters worden automatisch geopend voor zowel SPIM A als SPIM B.Met behulp van het polygoonselectiegereedschap klikt u net buiten de voorste, achterste, rug- en ventrale randen van het embryo van belang om een vlinderdaspatroon over het embryo te genereren in zowel de SPIM A- als DE SPIM B-weergaven en klik op diSPIM. Lijn de groene en rode kanalen voor elke SPIM-arm uit en klik nogmaals op diSPIM.

De verschuivingen worden geactiveerd in alle andere positievensters. Klik vervolgens op diSPIM en zekering om het dialoogvenster gedeconvolveerde zekering diSPIM-onbewerkte gegevensvolumes te openen en de parameters in te stellen zoals aangegeven. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, klikt u op ja en geeft u de uitvoermap op waarin de verwerkte bestanden kunnen worden opgeslagen voordat u op OK klikt. Verplaats in het voorbeeldvenster de t-scrollbalk naar tijdpunt twee van het venster en verplaats de z-slider totdat de weergave direct langs de lange as van het embryo wordt weergegeven.

Verplaats de t-scrollbalk terug naar tijdpunt één in het voorbeeldvenster en gebruik het gereedschap Lijnselectie om een lijn te trekken uit de meest ronde kern van de ventrale kern door het vlak van de AB-celmetafafaseplaten. Klik op de diSPIM-voorbeeldknop om de fijne aanpassingen aan de richting van het voorvertoningsvolume op te slaan. Stel de t-scroll-balken van de diSPIM-monitorvensters in op de begin- en eindtijdpunten van de volledige reeks afbeeldingen die moeten worden verwerkt.

Klik vervolgens op OK. Voor een efficiënte en nauwkeurige analyse van de cellijn is het van cruciaal belang om een nauwkeurige ADL-oriëntatie van de gegevensvolumes te bereiken voorafgaand aan de verwerking van Starry Night. Als u de starry night-lijntraceringsreeks in AceTree wilt openen, opent u het meegeleverde aangepaste AceTree-bestand en selecteert u geopend configureren bestand om de eerder aangegeven uitvoermap te vinden. Open de smeltondermap voor het embryo van belang en selecteer het bewerkte bestand.

Klik vervolgens op Openen en ga verder met de lineagevisualisatie en bewerking zoals eerder beschreven. Geoptimaliseerde protocollen veroorzaken geen detecteerbare fototoxiciteit aan de embryo's zoals beoordeeld door de tijd van het uitkomen en de timing in verband met ontwikkelingsmijlpalen. Met behulp van dit protocol zoals aangetoond, de niet-geïdentificeerde cellen in deze transgene groene fluorescerende eiwit uitdrukken aaltjes stam werden bepaald om te corresponderen met motorneuronen, de excretie kanaal cel, en twee spiercellen.

De geïdentificeerde neuronen werden schuin gevormd al 360 minuten na bevruchting met de langere cellulaire as die de daaropvolgende as voor neurite uitgroei. Van 385 tot 410 minuten na de bevruchting strekten de RMDD-neurites zich uit over ongeveer zes micrometer voorste van de cellichamen. Van 415 tot 445 minuten na de bevruchting, beide neurites uitgebreid dorsaal in en rond de vermoedelijke zenuwring.

Gemiddeld strekte elk RMDD neurite zich uit op ongeveer 11 micrometer van het cellichaam voordat het synchroon zijn contralaterale tegenhanger aan de top van de ring ontmoette. Samen tonen deze gegevens aan dat neuronale ontwikkelingskenmerken voor enkele identificeerbare cellen kunnen worden onderzocht, vergeleken en gekwantificeerd met behulp van dit geïntegreerde protocol. Het is belangrijk om te onthouden om de embryo's verticaal te oriënteren, zodat de lange as van elk embryo loodrecht staat op de lange as van de coverslip.

Met behulp van dit protocol zijn we begonnen met het verkennen van het ontluikende embryonale zenuwstelsel vanuit alle hoeken. Bijvoorbeeld tijdens celgeboorte, migratie en differentiatie, neuritevorming, uitgroei en fasciculatie.