Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Dit protocol biedt een kader voor het bestuderen van de integratie van exogene vetzuren uit complexe gastheerbronnen in bacteriële membranen, met name staphylococcus aureus. Het protocol maakt gebruik van onpartijdige lipidomische analyse en lipoproteïne deeltjes geïsoleerd van kip eidooiers als een economische bron van complexe vetzuren te kwantificeren vetzuur integratie in bacteriële lipiden. De massaspectrometrie technieken hier beschrijven bieden een ongeëvenaard perspectief van het vetzuur profiel van staphylococcus aureus lipiden, maar kan worden aangepast aan andere bacteriële membranen te bestuderen.

Bij het uitvoeren van dit protocol moet ervoor worden gezorgd dat elke fractionatiestap de LDL-bevattende fractie identificeert en behoudt. Verwijdering van het ammoniaksulfaat uit de plasmafractie is van cruciaal belang voor downstreamtoepassingen van de MOL's. Geef voldoende ruimte in de slang en verander het water indien nodig om effectieve dialyse mogelijk te maken.

Om te beginnen was twee eidooiers twee keer met 30 milliliter steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing om resterende albumine te verwijderen. Doorboort het vitelline membraan met een steriele pipetpunt en giet de inhoud van het membraan af in een steriele conische centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg ongeveer 24 tot 30 milliliter of 17 molaire natriumchlorideoplossing bij pH zeven toe aan de eigeel en meng krachtig.

Plaats vervolgens de buis op een schommelende shaker om 60 minuten op vier graden Celsius te mengen. Centrifugeer de eidooier verdunning bij 10 graden Celsius bij 10.000 keer g gedurende 45 minuten. Breng de supernatant plasmafractie over in een steriele conische buis van 50 milliliter, waardoor de gepelde korrelvormige fractie achterblijft.

En weer centrifugeren. Meng eerst de plasmafractie met 40 massavolume procent ammoniumsulfaat op een schommelende shaker of vergelijkbaar apparaat bij vier graden Celsius gedurende 60 minuten. Na het aanpassen van de pH, centrifugeren de plasma fractie op vier graden Celsius en 10,000 tijd g voor een duur van 45 minuten.

Verwijder de bovenste halfvaste gele fractie in zeven kilodalton porie grootte dialyse buizen. Zorg voor een minimum van 25% van de extra ruimte in de slang om het te laten zwellen. Plaats de dialysebuis in drie liter ultrazuiver water om 's nachts op drie graden Celsius te dialyseren om het ammoniumsulfaat te verwijderen.

Na dialyse, centrifugeren de oplossing op vier graden Celsius zoals eerder beschreven. Verwijder voorzichtig de bovenste, halfvaste gele fractie tot een steriele buis en bewaar op vier graden Celsius. Na nachtelijke incubatie van de cultuur, breng 500 microliters in twee steriele 250 milliliter verbijsterde kolven met 49,5 milliliter van 1%tryptone bouillon.

Incubeer voor ongeveer vier uur bij 37 graden Celsius met schudden om halverwege de lange fase te bereiken. Breng 100 milliliter cultuur in stappen van 25 milliliter naar vier steriele 50 milliliter centrifugebuizen en centrifugeer de vier buizen op 10.000 keer g om de cellen te pelleteren. Verwijder de supernatant en opnieuw opschorten elke cel pellet in 750 microliter van 1%tryptone bouillon.

Combineer de vier 750 microliter celsuspensies tot één buis van 15 milliliter. En aliquot 350 microliters van de cel suspensie in zes steriele 1,5 milliliter centrifuge buizen. Gebruik een pipet om 30 microliter ldls toe te voegen in de 1,5 milliliter centrifuge buis om een gewenste uiteindelijke concentratie van 5%En incubaat bij 37 graden Celsius te bereiken met schudden gedurende vier uur.

Centrifuge de culturen op vier graden Celsius op 16.000 keer g voor een duur van twee minuten. En schort de celpellets opnieuw op in 330 microliter steriele fosfaatgefferde zoutoplossing om te wassen. Herhaal deze was nog een keer.

Nota van het gewicht van de zes natte celpellets door het gewicht van de lege buis af te trekken. Snap bevriezen van de cel pellets op droog ijs. Voeg eerst een schep van 5 millimeter zirkoniumoxide kralen op de top van elke cel pellet.

Voeg 740 microliters van 75%HPLC-kwaliteit methanol direct gekoeld tot min 80 graden Celsius toe in elke buis. Voeg vervolgens twee microliters van 50 micromolar dimyristoyl fosphatidylcholine toe als interne standaard. Plaats het monster met 1,5 milliliter centrifugebuizen in een beschikbare poort op een bullet blender weefsel homogenizer.

Homogeniseer de monsters op lage snelheid. Zet twee tot drie voor drie minuten. Inspecteer de monsters visueel op homogeniteit.

Als klonten cellen zichtbaar zijn, u de homogenisatie in de bullet blender in stappen van twee minuten voortzetten. Voeg vervolgens 270 microliter chloroform toe aan elk monster in een chemische rookkap. Vortex de monsters krachtig gedurende 30 minuten.

Centrifugeren de monsters in een bench-top centrifuge voor maximaal 30 minuten ten minste 2.000 keer g. In de chemische rookkap, verzamel de monofasische supernatant en breng het naar een nieuwe reageerbuis terwijl voorzichtig het vermijden van de eiwitpellet aan de onderkant van de extractiebuis. Breng de verdunde lipid extracten eerder bereid naar een geschikte autosampler flacon.

Voor flow injection-gebaseerde analyse, plaats de autosampler flacons in een temperatuur-gecontroleerde autosampler van een HPLC-systeem dat in staat is capillaire stroom toepassingen. Stel het HPLC-systeem in volgens het manuscript. Het eluent wordt geïntroduceerd van de HPLC-transferlijn naar de massaspectrometer via een elektrospray-ionisatiebron die is uitgerust met een low-flow 34-meter metalen naald.

Stel in de Thermo Tune Plus instrumentcontrolesoftware de ionisatiespanning in op 4.000 volt en schedegas op vijf. Stel ook de capillaire temperatuur in op 150 graden Celsius en de S-lens op 50%Klik op de scanknop definiëren en selecteer FTMS in het analysemenu. Stel het veld massabereik in op normaal en selecteer 100,000 in het begin van het resolutieveld.

Zorg ervoor dat het scantype op vol is ingesteld. Voer onder het menu scanbereiken 200 in het eerste massaveld in en voer 2.000 in het laatste massaveld in. Na het verder definiëren van waargenomen massanauwkeurigheid, gemiddeld het signaal over de brede piek in het totale ionenchromatogram.

Klik met de rechtermuisknop op het miniatuurpictogram in het weergavevenster voor het massaspectrum en selecteer de weergavespectrumlijst. Selecteer in hetzelfde menu weergaveopties en schakel vervolgens alle pieken in het weergavemenu in. Klik op de knop oke om het weergavevenster te sluiten.

Klik opnieuw op het miniatuurpictogram in het weergavevenster van het massaspectrum en selecteer de exacte massa van het klembord exporteren. Plak de geëxporteerde gegevenscel A1 van het eerste werkblad in de nieuwe Excel-spreadsheet en ga verder volgens het manuscript. Open de LIMSA-software om nauwkeurige massagebaseerde lipide-identificaties uit te voeren.

Selecteer in het hoofdmenu de pieklijst onder het menu van het spectrumtype. Selecteer de positieve modus of de negatieve modus om te corresponderen met de polariteit waarin de massaspectrometriegegevens zijn verkregen. Voer in de piekvolle breedte op de helft van het maximum en over het z-venster het gewenste massazoekvenster in voor piekbevinding.

In dit protocol werd het LDL-gehalte van de plasmafractie verder verrijkt door neerslag van de 30 tot 40 kilodalton bèta levitins. De aanwezigheid van eiwitbanden op 140, 80, 65, 60 en 15 kilodaltons correleren met de apoproteïnen van LDLs. Behandeling met triclosan remt de groei van staph aureus in vetzuurvrij medium.

Terwijl het aanvullen van culturen met eigeel plasma als exogene vetzuurbronnen overwint triclosan-geïnduceerde groeiremming. Evenzo, suppletie van triclosan-behandelde culturen met verrijkte eigeel LDL herstelt de groei. Verder ondersteunt toevoeging van eigeel LDLs de groei van een eerder gekarakteriseerd S.aureus vetzuur, auxotroph.

Pre-vetzuur gehalte werd gemeten in 1%tryptone bouillon of kip eidooier LDL door gebruik te maken van flow injectie hoge resolutie nauwkeurige massaspectrometrie. Minimale hoeveelheden gratis vetzuur werden gevonden. Orthogonale gedeeltelijke minst vierkanten discriminante analyse van overvloedige staph aureus membraan fosfolipiden aangetoond duidelijke klasse scheiding, met een vetzuur samenstelling van onbehandelde en kip eidooier LDL behandelde voorwaarden.

Verrijking van LDLs van kippeneeldooier biedt een goedkope bron van complexe vetzuren voor het onderzoeken van de interacties tussen bacteriële pathogenen en gastheer lipoproteïnen. Chloroform en methanol gebruikt bij de bereiding van lipide extracten zijn gevaarlijk. Zorg ervoor dat u deze reagentia in een chemische rookkap gebruikt en alle afvalstromen bevat.