Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Deze in vivo fagocytosetest stelt onderzoekers in staat om genetische schermen en genoombrede associatiestudies uit te voeren om nieuwe genen te identificeren die fagocytose reguleren in volwassen bloedcellen. Dit experiment is kwantitatief, gemakkelijk uit te voeren en kan worden toegepast op de screening van levende dieren op gastheerfactoren die de herkenning, opname en klaring van ziekteverwekkers beïnvloeden. Na het trekken van dunne wand glazen haarvaten met een naaldtrekker, gebruik maken van een micrometer om de naald onder een microscoop te houden, en gebruik nummer vijf, fijn-punt, roestvrijstalen pincet om de tip te breken tot een 100-micrometer tip diameter.

Om het volume van de vloeistof die zal worden geïnjecteerd in elke vlieg te meten, laad een capillaire naald met steriele 5%voedsel kleuring in PBS, en verdrijft de vloeistof op een druppel minerale olie op een 0,01-millimeter stadium micrometer. Doseer 10 microliter van 1,6 milligram per milliliter deeltjes op een klein vierkantje Parafilm en trek de vloeistof in de naald. Monteer de naald in de injector mondstuk, en lijn de verdoofde vliegen langs hun aangewezen gebied op het vliegkussen, ventrale kant omhoog, met de hoofden gericht op de voorkant van het pad.

Plaats de flesjes in overeenkomstige gebieden op de bank, en injecteer de vliegen in de bovenhoek van de buik met vijf, 100-milliseconde pompen vloeistof om ongeveer 10 nanoplegers van deeltjes in totaal te leveren. Breng elke vlieg in de juiste flacon als het wordt geïnjecteerd, wijzend op de tijd op de flacon. Laad vervolgens een nieuwe naald met 0,4%Trypan Blue-oplossing en stel de pneumatische injector op gated, zodat een constante luchtstroom de vloeistof uit de naald kan duwen.

30 minuten na de eerste injectie, injecteer elke vliegbuik met Trypan Blue totdat de buiken vol en opgezwollen zijn. Monteer de vliegen op microscoop dia's met elektrische tape, ventrale kant naar beneden, duwen de vleugels aan de zijkant van de vlieg om ze te beveiligen aan de tape. Duw vervolgens het hoofd voorzichtig in de tape om ervoor te zorgen dat de vlieg niet beweegt.

Onmiddellijk nadat alle vliegen zijn beveiligd, beeld de insecten, een voor een, op een 25 of 32 keer vergroting op een omgekeerde fluorescentie microscoop bevestigd aan een digitale camera en computer, gericht op de dorsale schip van elke vlieg met behulp van de computer software voor de digitale camera. Noteer vervolgens de belichtingstijd en vergroting tussen experimenten. Om de fluorescentie te kwantificeren, opent u een geschikt beeldanalyseprogramma en opent u één afbeelding.

Om de fluorescentieintensiteit van het dorsale vat te meten, trekt u een veelhoek rond het dorsale vat en selecteert u Meten om de fluorescentieintensiteit in de veelhoek vast te leggen. Om de intensiteit van de achtergrondfluorescentie te bepalen, kopieert u de eerste veelhoek en verplaatst u deze naar een gebied dat grenst aan het dorsale vat van elke vlieg. Selecteer vervolgens De fluorescentieintensiteit van het achtergrondgebied en noteren.

Om de dorsale vat fluorescentie te normaliseren door de achtergrond fluorescentie, na het meten van de fluorescentie intensiteit van de rest van de vliegen, verdeel de dorsale vat fluorescentie door de achtergrond fluorescentie, en bereken de gemiddelde genormaliseerde dorsale vat fluorescentie intensiteit van alle vliegen in een stam. Na te zijn gemonteerd ventrale kant naar beneden op een stuk elektrische tape, de eerste twee segmenten van de buik, waar de rug vat is gevestigd, zijn duidelijk zichtbaar. Belangrijke bronnen van experimentele fout doen zich voor bij de injectie- en beeldvormingsstappen van de procedure.

Met behulp van dezelfde naald om meerdere vliegen te injecteren kan leiden tot het verstopt raken met vliegweefsel of deeltjes. Vliegen die niet genoeg Trypan Blue fluorescentie krijgen in hun hele buik, wat de verhouding van het dorsale vat tot de achtergrondfluorescentie kan verminderen, waardoor de werkelijke fluorescentieintensiteit van het dier afneemt. Vliegen moeten worden gefotografeerd terwijl geïmmobiliseerd door kooldioxide, als actief bewegende vliegen produceren wazige beelden die niet kunnen worden gekwantificeerd.

Een gemuteerde lijn uit de Zuker-verzameling methanesulfonaat behandelde vliegen is niet in staat om gramnegatieve en gram-positieve bacteriën te fagosten en vertoont bijna geen dorsale vaatfluorescentie in de in vivo fagocytosetest, gekoppeld aan de isogene zuker-stam op de achtergrond en een andere veel voorkomende laboratoriumcontrolestam. Houd de tijd en de volgorde bij waarin vliegen worden geïnjecteerd om ervoor te zorgen dat vliegen zich in vergelijkbare stadia van pathogene herkenning en opname bevinden wanneer ze worden afgebeeld. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fagocytische defecten kunnen worden bepaald door het bestuderen van enkele hemocyten met confocale microscopie of na fluorescentie-geactiveerde celsorling of door magnetische kraalisolatie van volwassen hemocyten.