Name: Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer organoïden genereren van muis extrahepatische galwegen voor cholangiocytbiologie. Deze methode biedt een reproduceerbaar, kostenefficiënt model om weefselregeneratie en celinteracties te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse Vereniging voor de studie van lever ziekten Pinnacle award (naar N.R.) en de National Institutes of Health, nationale Instituut van Diabetes en spijsverterings- en nierziekten (awards P30 DK34933 aan N.R., P01 DK062041 aan J.L.M.). Wij danken Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) voor zijn hulp bij de ontwikkeling van deze methode.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. bereiding van uitrusting en materiaal voor muis EHBD isolatie
<ol><li>Bereiden seeding medium en wassen buffer (Tabel van materialen) in 50 mL conische buizen en houden hen bij 4 ° C of op ijs tot gebruik.</li>
	<li>Een chirurgische tabel (figuur 1B) instellen. Bereiden gesteriliseerde chirurgische instrumenten (Figuur 1 c).</li>
	<li>Plaats een steriele 24-well-plaat in de incubator weefselkweek 37 ° C om vooraf het te warm.</li>
	<li>Plaats een aliquoot deel van kelder matrix op ijs. Kelder matrix alleen gebruiken wanneer het volledig is vloeibaar.</li>
</ol>2. EHBD isolatie en gal Organoid cultuur
<ol><li>
Isolatie en voorbereiding van een enkele celsuspensie van muis EHBD
	<ol>
<li>Een volwassen muis (ouder dan 2 maanden) volgens de richtlijnen van de institutionele euthanaseren. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggende positie. Open de buikholte met behulp van een middellijn aanpak en intrekken van de lever om te rusten op het middenrif.</li>
		<li>Identificeer de Galgang die zich onmiddellijk onder de lever Hilus door zachtjes te trekken van de proximale twaalfvingerige darm met een hemostat. EHBD scheiden van de omliggende weefsels met behulp van een scalpel blad. Houd het proximale einde van de Galgang met een tang en ontleden van het distally net boven haar moment met de twaalfvingerige darm, dan ontleden de proximale einde van de buis van de lever (Figuur 1 d). Onmiddellijk in koud wassen buffer geïsoleerde EHBD (figuur 1E) te plaatsen.</li>
		<li>De EHBD verwijderen uit de buffer wassen en gehakt in 0.5 mm secties met een steriel scalpel blad. Plaats het weefsel op een glazen plaat op ijs tijdens de procedure (figuur 1B).</li>
		<li>Plaats de EHBD secties in een buis met 500 µL van de dissociatie-buffer. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Neutraliseer de dissociatie buffer door 500 µL cultuurmedium ijskoude cel toe te voegen.</li>
		<li>Triturate de celsuspensie naar boven en beneden de 18 en 20 G naalden, 20 keer elk modeltraject. Filtreer de celsuspensie door een 70 µm cel zeef en vang de doorstroming in een tube van 50 mL. Opmerking: Voorwaarde vooraf de zeef met 500 µL van steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat er wordt gefilterd om de passage van de celsuspensie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tot oprichting van EHBD organoids
	<ol>
<li>Centrifugeer de doorstroming uit stap 2.1.5 bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 mL ijskoud steriel PBS. Breng de hersuspensie in een nieuwe 1,5 mL-buis. Herhaal stap 2.2.1.</li>
		<li>Na het centrifugeren, verwijder voorzichtig het supernatant uit gewassen cellen verzameld aan de onderkant van de buis. Resuspendeer de pellet cel in 120 µL van vloeibaar ijskoude kelder matrix door pipetteren op en neer met behulp van P200 tips. Opmerking: Cel pellet hersuspensie in kelder matrix moet worden uitgevoerd op ijs-bad.</li>
		<li>Plaat 40 µL van de cel hersuspensie in kelder matrix in het midden van een goed in een voorverwarmde 24-well-plate. Opmerking: Vermijd het suctioning van lucht terwijl het manipuleren van de kelder matrix om te voorkomen dat de formatie van de zeepbel.</li>
		<li>Terug naar de plaat met cellen geresuspendeerde in kelder matrix de 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 15 minuten of totdat de kelder matrix is gestold. Voeg 600 µL van het seeding medium opgewarmd tot 37 ° C aan elk putje (Tabel van materialen). De plaat terug naar de 37 ° C weefselkweek incubator.</li>
		<li>Vervang het seeding medium met 600 µL van het kweekmedium verse organoid in 3 dagen en daarna om de 3 dagen. Monitor organoid groei met een omgekeerde Microscoop. Gebruik organoids voor een stroomafwaartse toepassing of split elke 7 tot 9 dagen vóór de ophoping van puin en organoid ineenstorting van de intraluminale worden waargenomen (figuur 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD Organoid Passage en opslag
<ol><li>
Passage van EHBD organoids 1:3 tot en met 1:4 elke 7 tot en met 9 dagen
	<ol>
<li>Verwijder het medium uit de put en Voeg 400 µL van ijskoude PBS. Resuspendeer de organoids door zachtjes pipetteren het mengsel op en neer 10 keer in de put. Breng het mengsel tot een 1,5 mL koker.</li>
		<li>Passage het mengsel door een 25 G naald 4 keer te distantiëren van de organoids. Centrifugeer het mengsel bij 400 x g gedurende 4 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in de kelder matrix (1:3 tot en met 1:4) voor verder kweken (stap 2.2.4.) of de cellen met ijs koud PBS wassen voor verdere verwerking. Opmerking: 250-300 cellen zijn meestal verzinkt in de 24-well plaat voor downstream toepassingen. Plating efficiëntie kan worden geëvalueerd door heldere veld microscopie met behulp van een omgekeerde Microscoop op dag 3-5 na passaging door het aantal organoids tellen en hun procent ten opzichte van de oorspronkelijke cel nummer te berekenen. mRNA kan worden geïsoleerd van EHBDOs gewassen in PBS met het standaard protocol met behulp van guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Langdurige opslag van EHBD organoids
	<ol>
<li>Verwijder het medium uit de put en wassen van de organoids met kamertemperatuur PBS. PBS verwijderen uit de put zonder verstoring van de daling van de matrix kelder.</li>
		<li>Voeg 500 µL van ijskoude cel bevriezing medium naar de waterput. Zachtjes resuspendeer de organoids in vloeibaar kelder matrix en cel bevriezing van middellange en breng het mengsel in cryogene flesjes.</li>
		<li>De flesjes bij-80 ° C gedurende 48 h. overdracht de flesjes aan een stikstof tank voor opslag op lange termijn in een damp fase opslaan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Organoid Pprocessing voor het insluiten van paraffine
<ol><li>Resuspendeer de EHBDOs in 500 µL van ijskoude PBS (4 ° C) door pipetteren op en neer 5 tot 10 keer. Verzamelen geresuspendeerde EHBDO in vloeibaar kelder matrix in een 1,5 mL-buis. Opmerking: Om te voorkomen breken organoids, afgesneden van de onderkant 2-3 mm van een P1000 tip en verwijder de bovendrijvende vloeistof zeer zorgvuldig.</li>
	<li>Centrifuge EHBD organoids bij 350 x g gedurende 5 min. Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de organoid pellet.</li>
	<li>Voeg 1 mL ijskoud 4% paraformaldehyde (PFA) tot de organoids en Incubeer de organoids in 4% PFA overnacht bij 4° C. Verwijderen van 4% PFA uit de organoids met behulp van een P1000 tip na een incubatieperiode van de overnachting.</li>
	<li>1000 µL van kamertemperatuur PBS toevoegen aan de buis met de organoids en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Centrifugeer de buis met organoids in PBS bij 350 x g gedurende 5 min. herhalen dit proces nog tweemaal.</li>
	<li>Verwijderen van PBS en voeg 1 mL 30% ethanol tot de organoids. Incubeer gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 350 x g gedurende 5 min op RT. verwijderen 30% ethanol. Voeg 1 mL 70% ethanol en incubeer gedurende 5 min op RT.</li>
	<li>Centrifugate bij 350 x g gedurende 5 min. verwijderen 70% ethanol. Voeg 1 mL 100% ethanol en incubeer gedurende 5 min op RT. Opmerking: Organoids kan worden gehouden in 100% ethanol bij kamertemperatuur voor tot 48u vóór verdere verwerking.</li>
	<li>Verwarm specimen verwerking gel in een magnetron voor 20 s of totdat het vloeibaar. Voeg 50 µL van specimen gel in de buis met organoids verwerking. Plaats de buis op ijs totdat het specimen verwerking gel is gestold.</li>
	<li>Verwijder de daling van het specimen verwerking gel met organoids uit de buis en plaats tussen de blauwe spons pads in een cassette voor verdere verwerking in de weefsel-processor. Gebruik 15 minuten voor elke stap in de paraffine-embedder tijdens de verdere verwerking...</li>
	<li>Sectie paraffine-ingebedde organoids in monster verwerking gel op 4 µm. doorgaan met immunohistochemische kleuring als eerder beschreven16.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li>
<li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+the+Wild+West+of+Organoids%2C+Enteroids%2C+and+Mini-Guts%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Dit werk beschrijft de generatie van een 3-dimensionaal model van de organotypic van muis EHBD cholangiocytes. Belangrijke stappen in de EHBDO cultuur generatie omvatten nauwgezet EHBD dissectie Voorkom alvleesklier cel besmetting, onderhoud van steriele omstandigheden ter voorkoming van bacteriële en schimmelinfecties besmetting en zorgvuldige manipulatie na het centrifugeren om te voorkomen dat de verlies van celmateriaal. Een nauwe aanhankelijkheid aan beschreven temperatuursomstandigheden is vereist. Er zijn enkele b...

Cholangiopathies zijn ongeneeslijke chronische progressieve aandoeningen die invloed hebben op biliaire cellen gelegen in intra- en extrahepatic biliaire leidingen (EHBDs)1. Sommige cholangiopathies, zoals acute primaire scleroserende cholangitis, cholangiocarcinoma, biliaire atresie en choledochal cysten, is hoofdzakelijk van invloed op EHBDs. Ontwikkeling van therapieën voor cholangiopathies wordt beperkt door de beperkte beschikbaarheid van preklinische modellen. Bovendien, eerdere studies gericht op cholangiopathies gegroepeerd: lever, intra- en EHBDs. Echter, intra- en EHBDs hebben een aparte embryonale oorsprong en, dus, moet worden beschouwd als afzonderlijke moleculaire pathologie. Intrahepatische galwegen ontwikkelen van de Intrahepatische ductaal platen en de craniale deel van hepatische diverticulum, de ontwikkeling van de hele EHBDs van de staartzijde van het hepatische diverticulum2. Zij vertrouwen ook op verschillende progenitor cel compartimenten voor volwassen homeostase, met inbegrip van grachten van Hering in Intrahepatische galwegen en peribiliary klieren in EHBDs2,3. Gebruik van diermodellen voor preklinische studies wordt beperkt door de kosten en moet worden geminimaliseerd om ethische redenen. Daarom zijn reductionistische, reproduceerbaar, tijd en kosten-efficiënte in-vitro modellen zeer wenselijk.
Meeste voorafgaande studies van cholangiopathies gebruikt normale muis of rat kanker modellen, of menselijke cholangiocarcinoma cellijnen afgeleid van intra- en EHBDs4,,5,,6,7. Echter, deze zijn modellen van getransformeerde cellen en doen niet recapituleren normale cholangiocyte biologie op homeostase of in een gezonde staat. Recente vooruitgang in de ontwikkeling van organotypic cultuur modellen heeft toegestaan de ontwikkeling van 3-dimensionale structuren van de verschillende weefselsoorten, met inbegrip van hepatobiliaire weefsels, hoewel niet normale muis EHBDs8,9, 10. Deze structuren "orgel-achtige" gericht op het nabootsen van primaire weefsel en worden geteeld in een kunstmatige niche ondersteuning zelf-vernieuwing van de orgel-specifieke stam/voorlopercellen cellen11.
"Organoid" is een brede term die de meeste vaak beschrijft 3-dimensionale weefsel modellen afgeleid van stamcellen. Organoids kan worden gegenereerd vanuit geherprogrammeerde pluripotente stamcellen vertegenwoordigd door embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Ze kunnen ook worden gegenereerd vanuit orgel-specifieke adulte stamcellen12. Sommige cholangiocyte organoid modellen zijn voorgesteld in vorige onderzoeken. Dus, organoids afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen zijn gerapporteerde7,9,13 en bieden een waardevolle, tijd efficiënt hulpmiddel waarmee voor gelijktijdige opwekking van verschillende celtypes. Echter komen deze pluripotente stamcel afkomstige organoids niet volledig overeen met de structuur en de functionaliteit van primaire volwassen EHBD cholangiocytes.
Organoids afgeleid van adulte stamcellen van het menselijke9 en katachtige10 lever werden ook voorgesteld. Katachtige modellen zijn niet overal verkrijgbaar en hebben beperkte hulpprogramma arsenaal voor studiedoeleinden. Deze lever afkomstige volwassen stamcel afkomstige organoids doen bovendien niet extrahepatic cholangiocytes maar eerder Intrahepatische cholangiocytes model.
EHBD organoid generatie werd gemeld uit menselijke normale EHBDs14 en muis EHBD cholangiocarcinoma15. Echter toegang tot menselijke weefsels EHBD is zeer beperkt, en organoids afgeleid van een genetische lymfkliertest model van cholangiocarcinoma15 vertegenwoordigen niet gezond cholangiocyte biologie aan homeostase en zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde cellen.
Om de beperkingen van pluripotente stamcel - en lever-afgeleide cholangiocyte organoid modellen en de beperkte toegang tot menselijke weefsels, in preklinische modellen nodig, ontwikkelden we een lymfkliertest EHBD organoid model (figuur 1A). Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een techniek voor muis EHBD afkomstige organoids uit volwassen weefsel. Deze EHBD organoids genaamd EHBDOs zal een belangrijk in vitro instrument zijn voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de EHBDs cholangiocyte homeostase en ziekte processen, zoals cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td>L-WRN celcultuurmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Fetal bovien serum (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Wasbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer met zoutoplossing (PBS)</td><td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amphotericin B&nbsp;</td><td>6,25 &micro;g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td>Organoïdecultuurmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN geconditioneerd medium&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-Glutamine</td><td>10 &micro;l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethansulfonzuur, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &micro;l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &micro;l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td>Organoïde-zaaimedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Organoïdecultuurmedium&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Fibroblastengroeifactor-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratine 19 (CK19) antilichaam, konijn</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Sex-bepalend gebied Y-Box 9 (SOX9) antilichaam, konijn</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Pancreatische duodenale homeobox 1 (PDX1) antilichaam, konijn</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>E-cadherine antilichaam, geit</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Acetylerd &alpha;-tubuline antilichaam, muis</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>Tweede antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 gelabeld anti-konijn, ezel IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 gelabeld anti-geit, ezel IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 gelabeld anti-muis, geit IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt-reportertest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TopFlash HEK293-cellijn</td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr><td>Luciferase-testkit</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0,4% Trypanblauw-oplossing</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Aanvullende materialen en reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basal membraanmatrix, fenolvrij Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Dissociatiebuffer, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Celcultuur-vriesmedium, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Celzeven (70 &micro;m, gesteriliseerd)</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanaat-fenol RNA-extractie, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Specimenverwerkingsgel, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Universele mycoplasmadetectiekit</td><td></td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr><td>1,5 mL microcentrifugebuis</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr><td>24-wellplaat</td><td></td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>50 mL kegelvormige centrifugeerbuis</td><td></td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E800</td></tr><tr><td>Omgekeerde microscoop</td><td></td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>Nekrotarief</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>13-814-61</td></tr></tbody></table>

generatie van organoids van muis extrahepatic galwegen

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, die gevolgen hebben voor extrahepatic galwegen (EHBDs), bevatten biliaire atresie, acute primaire scleroserende cholangitis en cholangiocarcinoma. Ze hebben geen effectieve therapeutische opties. Hulpmiddelen om te studeren EHBD zijn zeer beperkt. Ons doel was het ontwikkelen van een orgel-specifieke, veelzijdig, volwassen stamcel-afgeleid, preklinische cholangiocyte model dat gemakkelijk kan worden gegenereerd vanuit wild type en genetisch gemodificeerde muizen. Dus rapporteren wij over de nieuwe techniek van de ontwikkeling van een EHBD organoid (EHBDO) cultuur systeem van volwassen muis EHBDs. Het model is kostenefficiënt, kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd, en heeft meerdere downstream toepassingen. Specifiek, beschrijven we de methodologie van muis EHBD isolatie en eencellige dissociatie, organoid cultuur initiatie, voortplanting, en op lange termijn onderhoud en opslag. Dit manuscript wordt ook beschreven EHBDO verwerking voor immunohistochemistry, fluorescent microscopie en mRNA overvloed kwantificatie door real-time kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR). Dit protocol heeft belangrijke voordelen naast EHBD-specifieke organoids produceren. Het gebruik van een geconditioneerde medium uit L-WRN cellen aanzienlijk vermindert de kosten van dit model. Het gebruik van de muis EHBDs biedt bijna onbeperkte weefsel voor cultuur generatie, in tegenstelling tot menselijk weefsel. Gegenereerde muis EHBDOs bevatten een zuivere bevolking van epitheliale cellen met markeringen van endodermal voorlopercellen en gedifferentieerde biliaire cellen. Gekweekte organoids handhaven van homogene morfologie door meerdere passages en kunnen worden hersteld na een langdurige opslagperiode in vloeibare stikstof. Het model staat voor de studie van biliaire progenitor celproliferatie, farmacologisch kan worden gemanipuleerd en kan worden gegenereerd op basis van genetisch gemodificeerde muizen. Toekomstige studies zijn nodig om het optimaliseren van de kweekomstandigheden om efficiëntie van de beplating, evalueren functionele cel volwassenheid, en directe celdifferentiatie. Ontwikkeling van co cultuur modellen en een meer biologisch neutraal extracellulaire matrix zijn ook wenselijk.

Ons protocol beschrijft de generatie van muis EHBD organoids die weefsel-specifieke en volwassen stamcel-afgeleide. Nadat de organoids worden gekweekt, kan een cystic Structuurformatie zo spoedig 1 dag na de EHBD-isolatie worden waargenomen. Besmetting met fibroblasten meestal niet wordt nageleefd tijdens het genereren van de cultuur. EHBDO plating efficiëntie is ongeveer 2% wanneer geïsoleerd van neonatale of volwassen (ouder dan 2 maanden) muizen (figuur 2B...

Dit protocol beschrijft de productie van een muis extrahepatic gal 3-dimensionale organoid kanaalsysteem. Deze biliaire organoids kan worden gehandhaafd in cultuur te bestuderen van cholangiocyte biologie. Biliaire organoids express markers van voorlopercellen zowel biliaire cellen en zijn samengesteld uit gepolariseerde epitheliale cellen.

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Dit murine extrahepatische galkanaal organoïde systeem kan de beperkte toegang tot preklinische cholangiopathieën modellen en de beperkingen van pluripotente stamcel en lever-afgeleide cholangiocyte organoïde modellen aan te pakken. Ons model is specificeerbaar, reductionistisch, reproduceerbaar en tijd- en kostenefficiënt. Het zal van bijzonder nut zijn voor laboratoria die geen toegang hebben tot menselijke weefsels.Onze techniek maakt het mogelijk om een bijna onbeperkt aantal extrahepatische galbuizencholangiocyten te kweken om weefselregeneratie en cel-naar-cel interacties te bestuderen. Het aantonen van de procedure zal Junya Shiota zijn, een post-doc uit mijn laboratorium. Voor intrahepatische galkanaalisolatie plaatst u de volwassen muis in een supinepositie en opent u de buikholte langs de middellijn.Trek de lever in om op het middenrif te rusten en gebruik een hemostat om voorzichtig de proximale twaalfvingerige darm te trekken om het gemeenschappelijke galkanaal direct onder het levergevest te onthullen. Gebruik een scalpel om de extrahepatische galbuis te scheiden van de omliggende weefsels. Houd het proximale uiteinde van de gemeenschappelijke galbuis met tangen, ontle

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een techniek om cholangiocyten isoleren van de extrahepatische galwegen van neonatale muizen wordt beschreven. De kanalen zijn zorgvuldig ontleed en vervolgens cellen worden geïsoleerd door uitgroei in dikke collageen gels. Deze methode biedt een nuttig instrument voor het bestuderen van extrahepatische galwegen ontwikkeling en pathologie.

Isolatie van Neonatale Extrahepatisch cholangiocyten

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

We presenteren een vrij eenvoudige en gevoelige methode voor nauwkeurige kwantificering van de dichtheid van de gal duct in de lever van de muis. Deze methode kan helpen bij het bepalen van de effecten van genetische en omgevings modificatoren en de effectiviteit van mogelijke therapieën in muizen modellen van galziekten.

Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Driedimensionale (3D) cellulaire systemen zijn relevante modellen voor het onderzoeken van organogenese. Een hydrogel-gebaseerde methode voor biliaire cysten productie en hun karakterisering wordt voorgesteld. Dit protocol ontrafelt de barrières van 3D-karakterisering, met een eenvoudige en betrouwbare methode om de efficiëntie, maten en grootte van cystevorming te beoordelen en hun functionaliteit te testen.

Generatie en kwantitatieve karakterisering van functionele en gepolariseerde galeelcyten

Een langdurig ex vitro 3D-organoïde kweeksysteem werd opgezet uit muizenhepatocyten. Deze organoïden kunnen worden gepasseerd en genetisch gemanipuleerd door lentivirusinfectie van shRNA / ectopische constructie, siRNA-transfectie en CRISPR-Cas9-engineering.

Vaststelling en genetische manipulatie van Murine Hepatocyte Organoïden

Voor de observatie van muizennenatale galwegaandoeningen zijn een intact galkanaal en een efficiënte voorbereiding vereist. Daarom werd met succes een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het isoleren van het gehele extrahepatische galkanaalsysteem bij muizenne neonaten met behoud van de integriteit van het galkanaal.

Extrahepatische galwegen en galblaasdissectie bij negen dagen oude muisverwijders

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

Organoïden die worden gegenereerd uit tumoren van patiënten worden orthotopisch in de lever van de muis geïnjecteerd. De resectie van niet-tumorachtig leverweefsel leidt tot een regeneratieve omgeving in het leverweefsel waar de tumor zich bevindt.

Een van patiënten afgeleide organoïde xenotransplantaatmodel voor hepatocellulaire kanker om de impact van leverregeneratie op tumorgroei te onderzoeken

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde tweestaps collagenase-leverperfusietechniek in een rattenmodel en toont het gebruik van geïsoleerde hepatocyten voor in vitro langdurige kweek van 3D-organoïden.

Perfusie van rattenlever en isolatie van primaire hepatocyten: een oude procedure die cruciaal is voor geavanceerde 3D-organoïdencultuur

Leer organoïden genereren van muis extrahepatische galwegen voor cholangiocytbiologie. Deze methode biedt een reproduceerbaar, kostenefficiënt model om weefselregeneratie en celinteracties te bestuderen.

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Meer video's verkennen