Druppel digitale val (ddTRAP): aanpassing van de Telomere Herhaal versterking protocol aan druppel digitale polymerase kettingreactie

De ddTRAP-test biedt de mogelijkheid om een gevoelige, robuuste en zeer kwantitatieve meting van telomerase enzymatische activiteit in cellen te verkrijgen. De mogelijkheid om tot 96 samples per run te lopen in een medium-throughput mode biedt ons een groot voordeel. We kunnen de besturingselementen en repliceren uitvoeren voor een goede statistische analyse van de verzamelde gegevens.

Ontdooi onmiddellijk voor de cellysing een bevroren aliquot np-40 lysis buffer. Eenmaal ontdooid, plaats de lysis buffer op ijs. Voeg PMSF proteaseremmer toe aan de NP-40 lysis buffer om een uiteindelijke concentratie van 0,2 millimolar te bereiken.

Voeg vervolgens 40 microliter van de lysebuffer toe aan de buis met een celpellet om een celequivalentie van 25.000 cellen per microliter te bereiken. Voorzichtig pipette het lysate op en neer om de cellen open te breken. Probeer te voorkomen dat het maken van bubbels.

Laat de cellen 30 minuten op ijs lyse. Voorzichtig vortex de lysate om de 10 minuten om te voorkomen dat clusters van celpuin vormen. Bereid tijdens de cellyse een mastermix in een microcentrifugebuis voor de telomerase extensiereactie en bewaar op ijs.

Na de cellyse, pipet 48 microliters van extensie master mix in elke PCR buis. Voeg twee microliter verdund lysaat toe aan elke PCR-buis om een uiteindelijke celequivalentie van 50 cellen per microliter te bereiken en zet de telomerase extensiereactie volgens het manuscript voort. Bereid een master mix in een microcentrifuge buis voor de ddTRAP, en houd het op kamertemperatuur.

Pipette 19.8 microliters van ddPCR master mix in elke PCR buis. Voeg 2,2 microliter van de vorige uitbreidingsreactieoplossing toe aan elke buis, waardoor er een totaal volume van 22 microliters overblijft. Om de druppelgeneratiecartridge in te stellen, laadt u eerst 20 microliter van de voorbereide oplossing in het middelste monster goed in de cartridge.

Tik voorzichtig op de zijkant van de cartridge om eventuele bellen naar de bovenkant van de oplossing te verplaatsen. Alle putten van de cartridge moeten worden geladen met monster voorafgaand aan het laden van olie. Dan, laad 70 microliter van druppelgeneratie olie in de linker olie put.

Zet de pakking op zijn plaats door het aan de uiteinden van de cartridge tetheren en plaats de geladen en gemonteerde cartridge in de druppelgenerator. De generator toont een stevig groen licht om te informeren dat de cartridge goed is geplaatst. Na 60 tot 90 seconden, wanneer het generatorlampje stopt met knipperen, is de cyclus voltooid.

Verwijder nu de cartridge. Haal de pakking voorzichtig uit de cartridge. Gebruik een multichannel pipet om ongeveer 40 microliters van de nieuw gegenereerde druppels van rechts goed in een 96-well PCR-plaat te pipetteen.

Verwarm de plaat met aluminiumfolie PCR-plaatafdichtingen zodra alle monsters in de 96-putplaat zijn geladen om verdamping te voorkomen. Laad vervolgens de 96-put plaat in een thermocycler om de PCR-reactie uit te voeren. Om te beginnen laadt u de 96-putplaat in de druppellezer.

Oriënteer de plaat goed zodat het A1 monster overeenkomt met dat van de houder. Open de software die is gekoppeld aan de druppellezer. Dubbelklik op de eerste put, A01, om het voorbeeld goed editor scherm te openen.

Klik op Experimenteren en selecteer het type test dat moet worden gebruikt in het vervolgkeuzemenu. Selecteer QX200 ddPCR EvaGreen Supermix als de juiste detectiemethode. Klik rechtsonder op Toepassen in het scherm van de goededitor om de door de gebruiker gedefinieerde instellingen op te slaan in alle gemarkeerde putten.

Klik vervolgens op Doel in het scherm goededing en klik op de vervolgkeuzelijst Doel om onbekend, referentie- of no-templatebesturingselement te selecteren om het type voorbeeld te definiëren. Label in de sectie Voorbeeldnaam alle voorbeelden en klik op Toepassen. Klik op Uitvoeren om de plaat te lezen.

Selecteer kolommen of rijen in het scherm Uitvoeropties wanneer u wordt gevraagd te informeren over de afdrukstand waarin de plaat moet worden ingelezen. Bepaal het aantal geaccepteerde druppels voor elk voorbeeld door dubbel te klikken op de afzonderlijke putten of kolom- en rijkoppen om een tabel met informatie te verstrekken. Voor de ddTRAP zijn monsters met 10.000 of meer geaccepteerde druppels geldig voor verdere analyse.

Markeer de putten die voorbeeldrepliceert en NTC-monsters vertegenwoordigen. Stel handmatig de drempel voor de voorbeelden in door op het pictogram te klikken voor het instellen van drempels linksonder in het scherm. In dit protocol werd telomerase activiteit gemeten in een celpaneel bestaande uit negen cellijnen van longkanker en telomerase-negatieve fibroblasten.

Een drempel werd vastgesteld op ongeveer 2.000 fluorescentie amplitude voor alle drie de biologische replica's voor SHP77, H2887, en NTC. Positieve druppels hadden een fluorescentie intensiteit rond 6,000 fluorescentie amplitude, die een duidelijke populatie aan de top gevormd, en gescheiden van negatieve druppels rond 1, 100 fluorescentie amplitude. De totale telomerase extensie producten per cel equivalent tussen alle monsters werden geschat op basis van de gemeten concentratie van de nucleïnezuren, die de telomerase activiteit in longkanker lijnen vertegenwoordigt.

Elke RNase besmetting tijdens de lyse- of uitbreidingsreactiestappen zal de telomerase enzymatische activiteit vernietigen omdat het een ribonucleoproteïnecomplex is. ddTRAP kan worden opgevolgd met ddPCR op hTERT mRNA expressieniveaus in de cel. De twee datasets stellen ons in staat om expressie van hTERT te correleren met telomerase activiteit en dieper in te graven in potentiële telomerase regulerende mechanismen zoals alternatieve splicing.

We kunnen manipulaties onderzoeken naar specifieke splicing factoren en hun effecten op telomerase activiteit. Momenteel ontwerpen we oligonucleotide splicing modulators als potentiële geneesmiddelen gericht op telomerase activiteit.