Name: Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes met de druppeloverdrachtmethode. Deze techniek maakt directe observatie van bacteriegroei mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een toonaangevend initiatief voor uitstekende jonge onderzoekers (LEADER, No. 16812285) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT) van Japan, een subsidie-in-Aid voor onderzoek jonge wetenschappers (nr. 18K18157, 16K21034) van Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) tot M.M., en subsidie-in-Aid van MEXT naar K.K. (nr. 17H06417, 17H06413).

1. bereiding van Gv's die bacteriële cellen bevatten door middel van de overdrachtsmethode druppel
<ol><li>Bereid lipide stamoplossingen van 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-fosfocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) en 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-foshoethanolamine-N-[biotinyl (polyethyleenglycol)-2000] (Biotine-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in chloroform/ methanoloplossing (2/1, v/v) en bewaar de kolf bij-20 °C.</li>
	<li>Bereiding van een lipide-bevattende olie oplossing
	<ol>
<li>Giet 20 μL van de POPC-oplossing en 4 μL van de Biotine-PEG-DSPE-oplossing in een glazen buis (Figuur 1b (i)).</li>
		<li>Damp het organische oplosmiddel door de luchtstroom in om een lipide-film te vormen en plaats de film in een exsiccator voor 1 uur om het organische oplosmiddel volledig te verdampen (Figuur 1b (II)). Opmerking: Het is noodzakelijk om het organische oplosmiddel in een rook afzuigkap te verdampen.</li>
		<li>Voeg 200 μL minerale olie (0,84 g/mL, tabel met materialen) toe aan de glazen injectieflacon (Figuur 1b (III)).</li>
		<li>Wikkel het openings gedeelte van de glazen flacon met film en soniceren het in een ultrasoon bad (120 W) gedurende ten minste 1 uur (Figuur 1b (III)). De uiteindelijke concentraties van POPC en biotine-PEG-DSPE zijn respectievelijk 1 mM en 0,002 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Pre-cultuur van bacteriële cellen
	<ol>
<li>Inoculeren E. coli in 1x lb medium (1 g gistextract, 2 g bacto Tryptone en 2 g natriumchloride in 200 ml gedeïoniseerd water) van een lb-plaat en incuberen bij 37 °c gedurende 12 – 14 uur ('s nachts).</li>
		<li>Na incubatie, verzamel 20 μL van de cultuur oplossing en breng over naar 1,98 mL vers 1x LB medium, en kweek de cellen opnieuw voor 2 uur.</li>
		<li>Controleer de extinctie op 600 nm (OD600) waarde van de pre-cultuur oplossing (bereid in stap 1.3.2). Er moet een pre-cultuur oplossing van OD600 = 1,0 – 1.5 worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van de buitenste en binnenste waterige oplossingen van GVs
	<ol>
<li>Los glucose op in 1x LB medium om een buitenste waterige oplossing van GVs te bereiden. bereid 20 mL van een Stock glucoseoplossing (500 mM).</li>
		<li>Verdun de Stock glucoseoplossing met 1x LB medium tot 200 mM (tabel 1).</li>
		<li>Los sucrose op in 1x LB medium om een innerlijke waterige oplossing van GVs te bereiden. bereid 20 mL van een voorraad sacharoseoplossing (500 mM).</li>
		<li>Meng de pre-cultuur oplossing (OD600 = 1,0 – 1.5), sacharoseoplossing (500 mm) en 1x lb medium (tabel 1). De uiteindelijke OD600 waarde van de kweek oplossing moet 0,01 – 0.015 zijn en de uiteindelijke sacharose concentratie moet 200 mm bedragen. Opmerking: Wees voorzichtig om osmotische druk te vermijden. Het is noodzakelijk om de concentratie tussen de binnenste en buitenste waterige oplossing in evenwicht te brengen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van water-in-olie (W/O) druppeltjes met bacteriële cellen
	<ol>
<li>Voeg 2 μL van de binnenste waterige oplossing van GVs (bereid in stap 1.4.4) toe aan 50 μL van de olie oplossing met lipiden (minerale olie met POPC en biotine-PEG-DSPE) in een 0,6 mL hard plastic buis (Figuur 1b (IV)).</li>
		<li>Emulgeer de twee componenten in de plastic buis door de buis met de hand te tikken (Figuur 1b (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>Vorming van Gv's die bacteriële cellen bevatten
	<ol>
<li>Voeg 50 μL van de buitenste waterige oplossing van GVs (bereid in stap 1.4.2) toe in een 1,5 mL hard plastic buisje (Figuur 1b (VI)) en 150 laag de olie oplossing met lipiden (minerale olie met popc en BIOTINE-Peg-dspe) zachtjes op het oppervlak van de buitenste waterige oplossing (Figuur 1b (VII)). Incuberen dit monster bij kamertemperatuur (RT, 25 °C) gedurende 10 – 15 minuten. Controleer of de interface van de olie-en waterige oplossingen plat is.</li>
		<li>Voeg met behulp van een pipet (Figuur 1b (VIII)) 50 μL van de oplossing met een druppel (in stap 1.5.2 bereid) toe aan de interface van de olie-en waterige oplossing.</li>
		<li>Centrifugeer de 1,5 mL hard plastic buis (van stap 1.6.2) gedurende 10 min bij 1.600 x g bij RT in een desktop centrifuge (Figuur 1b (IX)). Na centrifugeren, zuig de olie (bovenste laag) uit de 1,5-mL hard plastic buis met behulp van een pipet, en het verzamelen van de GVs met bacteriële cellen (Figuur 1b (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. bereiding van een GV-observatiesysteem (bacterieel celkweek systeem)
<ol><li>
Bereiding van kleine blaasjes (Sv's) voor constructie ng a ondersteund dubbelmembraan
	<ol>
<li>Giet 20 μL van de POPC-oplossing en 4 μL van de Biotine-PEG-DSPE-oplossing in een glazen buis (met gebruikmaking van dezelfde lipidesamenstelling als gebruikt voor GV-voorbereiding in stap 1,1).</li>
		<li>Damp het organische oplosmiddel door de luchtstroom in om een lipide-film te vormen en plaats dit monster in een exsiccator voor 1 uur om het organische oplosmiddel volledig te verdampen.</li>
		<li>Voeg 200 μL 200 mM glucose toe in 1x LB medium (de buitenste waterige oplossing van GVs) op de glazen injectieflacon.</li>
		<li>Wikkel het openings gedeelte van de glazen flacon met film en soniceren het in een ultrasoon bad (120 W) gedurende ten minste 1 uur.</li>
		<li>Bereid SVs door de extrusiemethode21 met behulp van een mini-extruder en polycarbonaat membraan met 100 nm poriegrootte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van een handgemaakte kamer
	<ol>
<li>Boor een gat van 7 mm met een holle stoot op een dubbel-geconfronteerd zegel (10 mm x 10 mm x 1 mm).</li>
		<li>Plak de dubbel-geconfronteerd afdichting met het gat op een afdekglas (30 mm x 40 mm, dikte 0,25 – 0,35 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van een ondersteund dubbelmembraan op het afdekglas in het gat van de kamer
	<ol>
<li>Voeg 30 μL van de SV-oplossing toe aan het gat van de kamer (bereid in punt 2,2) en incuberen bij RT gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Was het gat voorzichtig tweemaal met 20 μL 1x LB medium met 200 mM glucose (de buitenste waterige oplossing van GVs) door pipetteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilisatie van Gv's op de ondersteund dubbelmembraan op het afdekglas in het gat van de kamer
	<ol>
<li>Introduceer 10 μL neutravidin met de buitenste waterige oplossing van GVs (1 mg/mL) in het gat en inincuberen bij RT gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Was het gat voorzichtig tweemaal met 20 μL 1x LB medium met 200 mM glucose (de buitenste waterige oplossing van GVs) door pipetteren.</li>
		<li>Voeg alle oplossing met GVs (bereid in stap 1.6.3) toe aan het gat van de kamer en sluit af met een afdekglas (18 mm x 18 mm, dikte 0,13 – 0.17 mm) (Figuur 2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopische observatie van bacteriële celgroei binnen GVs
	<ol>
<li>Stel een microscopisch verwarmingssysteem in met een omgekeerde Microscoop uitgerust met een 40x/0.6 numerieke diafragma (NA) objectief lens met een lange werkafstand (Figuur 2b).</li>
		<li>Plaats de kamer op het microscopische verwarmingssysteem (Figuur 2b). Inbroed de GVs met bacteriële cellen in de kamer in een statische toestand gedurende 6 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Vastleggen en opnemen van Microscoop beelden van bacteriële celgroei binnen GVs elke 30 min met behulp van een wetenschappelijke complementaire metaaloxide Semiconductor (sCMOS) camera.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
<li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).</li>
<li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+From+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li>
<li>Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesizing+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesizing life.</a> Nature. 409, 387-390 (2001).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells%2C+proteins%2C+and+microbeads+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li>
<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li>
<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li>
<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li>
<li>Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-mediated+incorporation+of+transmembrane+proteins+in+giant+unilamellar+vesicles+with+controlled+physiological+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).</li>
<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
<li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen GVs. Deze eenvoudige methode omvat het vormen van gv's met bacteriële cellen op het eencellige niveau door gebruik te maken van de druppel overdrachtsmethode. Vergeleken met andere benaderingen voor het verkrijgen van Gv's die bacteriële cellen bevatten, heeft deze methode twee voordelen: (i) het is gemakkelijk te ontwikkelen en (II) een klein volume (2 μL) van de monsteroplossing is nodig om de GVs te bereiden. De drupp...

De cultuur van bacteriële cellen op het eencellige niveau heeft steeds meer aandacht gekregen. Het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau in een besloten ruimte kan een verheldende werking van bacteriële functies zoals fenotypische variabiliteit1,2,3,4, Celgedrag5, 6 , 7 , 8 , 9, en antibioticaresistentie10,11. Door de recente ontwikkelingen in cultuur technieken kan de cultuur van enkele bacteriën worden bereikt in een besloten ruimte, zoals in een goed-chip4,7,8, gel druppel12,13 en water-in-olie (W/O) druppel5,11. Om het begrip of gebruik van enkele bacteriële cellen te bevorderen, zijn verdere technische ontwikkelingen van teelttechnieken nodig.
Blaasjes die de biologische celmembraan nabootsen zijn sferische compartimenten bestaande uit amfifiele moleculen en kunnen verschillende materialen vasthouden. Blaasjes zijn geclassificeerd op grootte en omvatten kleine blaasjes (SVs, diameter < 100 nm), grote blaasjes (LVs, < 1 μm), en reuzen blaasjes (GVs, > 1 μm). SVs of Lv's worden vaak gebruikt als medicijn dragers vanwege hun affiniteit met het biologische celmembraan14. Gv's zijn ook gebruikt als een reactor systeem voor de bouw van protocellen15 of kunstmatige cellen16. Inkaping van biologische cellen in GVS is gemeld17,18, en dus GVS tonen potentieel als een celkweek systeem in combinatie met het reactor systeem.
Hier beschrijven we samen met een video van experimentele procedures hoe Gv's kunnen worden gebruikt als nieuwe celkweek schepen19. Gv's met bacteriën werden gemaakt door de druppel overdrachtsmethode20 en werden vervolgens geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een afdekglas. We gebruikten dit systeem om bacteriële groei op het eencellige niveau binnen GVs in real-time te observeren.

<table><tbody><tr><td>Bactotryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas (18 &times; 18 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>C018181</td><td>dikte 0.13&ndash;0.17 mm</td></tr><tr><td>Dekglas (30 &times; 40 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>custom-order</td><td>dikte 0.25&ndash;0.35 mm</td></tr><tr><td>Bureaucentrifuge</td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>slinger rotor type</td></tr><tr><td>Dubbelzijdige afdichting (10 &times; 10 &times; 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Glazen flacon</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>Durham fermentatiebuis</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Microscopische verwarmingstrap</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Mineraalolie</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Objectieflens</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&times;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaatmembraan</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>porengrootte 100 nm</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoonbad</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL plasticbuis met deksel</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL plasticbuis met deksel</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-di-stearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleenglycol)-2000]</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129P</td><td>Biotin-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We ontwikkelden een methode voor het kweken van bacteriële cellen op het eencellige niveau binnen gigantische blaasjes (GVS). Bacteriële celcultuur is belangrijk voor het begrijpen van de functie van bacteriële cellen in de natuurlijke omgeving. Vanwege de technologische vooruitgang kunnen verschillende bacteriële celfuncties op het eencellige niveau in een besloten ruimte worden onthuld. Gv's zijn sferische micro-sized compartimenten samengesteld uit amfifiele lipide moleculen en kan verschillende materialen, met inbegrip van cellen houden. In deze studie werd een enkele bacteriële cel ingekapseld in 10 – 30 μm GVs door de druppel overdrachtmethode en werden de Gv's die bacteriële cellen bevatten geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat. Onze methode is nuttig voor het observeren van de real-time groei van enkele bacteriën binnen GVs. We gekweekte Escherichia coli (E. coli) cellen als een model binnen GVS, maar deze methode kan worden aangepast aan andere celtypen. Onze methode kan worden gebruikt in de wetenschap en industriële gebieden van microbiologie, biologie, biotechnologie, en synthetische biologie.

We presenteren een eenvoudige methode voor het genereren van GVs met enkele bacteriële cellen met behulp van de druppel methode (Figuur 1). Figuur 1a toont een schematisch beeld van de neerslag van GVS die bacteriën bevatten. W/O druppels met bacteriën worden overgebracht over de olie-water (lipide monolayer) interface door centrifugeren te vormen GVs. Het verschil in dichtheid tussen sucrose (binnenste waterige oplossing) en glu...

We demonstreren eencellige cultuur van bacteriën in gigantische blaasjes (GVS). Gv's met bacteriële cellen werden bereid door de druppel overdrachtsmethode en werden geïmmobiliseerd op een ondersteund membraan op een glas substraat voor directe observatie van bacteriële groei. Deze aanpak kan ook worden aangepast aan andere cellen.

Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Dit protocol biedt een middel voor het kweken van bacteriële cellen op eencellig niveau in gigantische vikjes. Het is gemakkelijk om de gigantische akeltjes te ontwikkelen, en slechts een zeer klein volume van monster oplossing is nodig om de vesikels voor te bereiden. Het aantonen van de procedure zal Yuri Ota zijn, een promovendus uit ons laboratorium.Begin met het toevoegen van 20 microliter vers bereide POPC-oplossing en vier microliter vers bereide biotine-PEG-DSPE-oplossing aan een glazen flacon. Verdamp het organische oplosmiddel door de luchtstroom tot een lipidefilm wordt gevormd. Plaats de film een uur in een desiccator om het organische oplosmiddel volledig te verdampen.Voeg vervolgens 200 microliter minerale olie toe aan de flacon. Bedek de opening van de flacon met plastic paraffinefilm en sonische de flacon inhoud in een ultrasoon bad op 120 watt voor ten minste een uur. Voor een kleine vesicle voorbereiding, maak een lipide film, zoals net aangetoond, en voeg 200 microliter van 200 millimeter glucose in LB medium aan de film.Vervolgens sonicate de film op 120 watt voor ten minste een uur, gevolgd door extrusie van de resulterende gigantische vikjes in kleine vikjes met behulp van een mini-extruder en een polycarbonaat membraan met een 100-nanometer porie grootte. Voor bacteriële cel pre-cultuur, inenting E.coli van een LB plaat in milliliters van LB medium voor een nachtelijke cultuur op 37 graden Celsius. De volgende ochtend, overdracht 20 microliters van de cultuur supernatant naar 1,98 milliliter verse LB medium voor een extra twee uur cultuur.Controleer aan het einde van de incubatie de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD 600-waarde, van de pre-cultuuroplossing op een spectrofotometer. Een pre-cultuur oplossing met een OD 600 van een tot 1,5 moet worden gebruikt. Meng vervolgens de pre-culture oplossing met vers bereide sacharoseoplossing en vers LB-medium, volgens tabel één.Voor gigantische vesiclevorming voegt u 50 microliter van een vers bereide buitenste waterige oplossing van reuzenluisjes toe aan een plastic buis van 1,5 milliliter deksel. Voorzichtig laag 150 microliters van de lipide-bevattende olie-oplossing over de buitenste waterige oplossing van gigantische vikjes. Broed de resulterende oplossing gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur uit, voordat u controleert of de interface van de olie en waterige oplossingen vlak is.Voor water en olie bacteriële cel met druppelvorming, voeg twee microliters van een vers voorbereide innerlijke waterige oplossing van gigantische vikjes tot 50 microliter van de sonicated lipide-bevattende olie-oplossing in een 0,6 milliliter deksel plastic buis. Tik vervolgens op de buis om de twee componenten te emulgeren. Gebruik vervolgens een pipet om 50 microliters water- en oliedruppeloplossing toe te voegen aan de interface van de olie en waterige oplossing, en sediment de bacteriële celbevattende reuzenvratten door centrifugatie.Dan aspirate de bovenste olielaag en het verzamelen van de gigantische ageletjes. Om een handgemaakte kamer voor te bereiden, boor een gat van zeven millimeter met een holle punch op een 10 bij 10 bij 10 bij een millimeter dubbel-faced afdichting, dan plak de dubbele-faced afdichting op een 30 bij 40 millimeter deksel glas. Om een ondersteund bi-layer membraan voor te bereiden, voeg 30 microliter van de kleine blaasoplossing toe aan het gat van de handgemaakte kamer.Broed de apen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aan het einde van de incubatie was het gat voorzichtig twee keer met 20 microliters LB-medium, aangevuld met 200 millimillerglucose. Om gigantische blaasjes op het bilaagse membraan te immobiliseren, introduceert u 10 microliters neutravidin in buitenste waterige reuzensysicleoplossing voor een 15 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, voorzichtig wassen het gat twee keer met 20 microliters van LB medium, aangevuld met 200 millimiller glucose, en voeg het hele volume van gigantische blaasoplossing aan het gat in de kamer. Sluit het gat vervolgens af met een afdekglas van 18 bij 18 millimeter. Om bacteriële groei binnen de reuzenluisjes te monitoren, selecteert u de 40X-doelstelling op een omgekeerde microscoop en plaatst u de kamer op het microscoopverwarmingsfasesysteem.Vervolgens broeden de bacteriële cel-bevattende gigantische vikjes in de kamer onder statische omstandigheden gedurende zes uur op 37 graden Celsius, het vastleggen en registreren van beelden van de bacteriële cel groei om de 30 minuten, met de wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleider camera. Giant vesicles met bacteriële cellen variëren meestal in grootte van 10 tot 30 micrometer. Voor beide maten reuzensyikles ondergaan de E.coli-cellen rek- en delingsprocessen, waarbij sommige E.coli-cellen gedurende de observatieperiode van zes uur tot een zeer groot aantal cellen groeien.De relatieve frequentie van reuzensikjes met een enkelcellig niveau is ongeveer 10% van de verkregen reuzensikjes, en de reuzenvezels die op het eencellige niveau zijn ingekapseld, zijn ongeveer 50% van de reuzenvikjes die bacteriële cellen bevatten. De stabiliteit van de olie-water interface is belangrijk voor het verkrijgen van gigantische akeltjes met bacteriële cellen. Zorg ervoor dat de olie voorzichtig aanzuigen voordat de gigantische blaascorrectie.Na het bekijken van deze video, moet je een goed begrip van hoe bacteriële cellen cultuur op het niveau van de eencellige binnen individuele reuzenvikjes. Onze bacteriële cultuur methode is een nieuw instrument in de microbiologie voor het kweken van onbekende milieubacteriën te verkrijgen of te analyseren hun metabole producten.

bacterial-cell-culture-at-the-single-cell-level-inside-giant-vesicles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Watson, D. C., et.al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the isolation and concentration of extracellular vesicles (EVs) derived from the outer membrane of genetically engineered bacteria. The process involves culturing the bacteria to release EVs, followed by sequential centrifugation and filtration steps to remove cells and debris. Finally, ultrafiltration is used to...

Isolation and Enrichment of Outer Membrane-Derived Extracellular Vesicles from Bacteria

Source: Morita, M., et al. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates a method for culturing and observing individual bacterial cells encapsulated inside giant vesicles anchored to a supported lipid bilayer. The system enables stable, long-term imaging of single-cell growth dynamics in a confined, physiologically relevant microenvironment.

Single-Cell Culture of Bacteria Within Giant Vesicles

Source: Cabeen, M. T., et al. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates the use of a microfluidic device to observe bacterial growth at the single-cell level. It showcases how non-motile bacterial cells, confined within micro-scale trenches, are continuously nourished and imaged under a fluorescence microscope. The setup enables real-time visualization of cell division and lineage tracking across multiple generations.

Tracking Bacterial Growth at Single-Cell Resolution in a Microfluidic System

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

Reusachtige blaasjes die micrometergrote componenten bevatten, zijn nuttige celmodellen. De centrifugatiemethode voor water-in-olie-emulsie is een eenvoudige, krachtige tool voor de bereiding van reusachtige blaasjes met ingekapselde materialen.

Bereiding van Giant blaasjes inkapselen Microbolletjes door centrifugeren van een water-in-olie emulsie

Presenteren we een methode voor de analyse van de microfluidic van afzonderlijke bacteriële cel lineages met behulp van Bacillus subtilis als voorbeeld. De methode overwint tekortkomingen van de traditionele analysemethoden in microbiologie doordat observatie van honderden cel generaties strak controleerbaar en uniforme groei omstandigheden.

Eencellige Microfluidic analyse van Bacillus subtilis

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Het huidige protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor isolatie, concentratie en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit cyanobacteriële culturen. Benaderingen voor het zuiveren van blaasjes uit culturen op verschillende schalen, afwegingen tussen methodologieën en overwegingen voor het werken met veldmonsters worden ook besproken.

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Dit protocol beschrijft de omgekeerde emulsiemethode die wordt gebruikt om een celvrije expressie (CFE) -systeem in te kapselen in een gigantisch unilamellair blaasje (GUV) voor het onderzoek naar de synthese en incorporatie van een modelmembraaneiwit in de lipidedubbellaag.

Reconstitutie van het bacteriële glutamaatreceptorkanaal door inkapseling van een celvrij expressiesysteem

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

Leer bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes met de druppeloverdrachtmethode. Deze techniek maakt directe observatie van bacteriegroei mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

Bacteriële celkweek op het eencellige niveau in gigantische blaasjes

Meer video's verkennen