Targeting Alfa Synuclein aggregaten in cutane perifere zenuwvezels door Free-floating immunofluorescentie assay

De diagnose van de ziekte van Parkinson is nog steeds afhankelijk van klinische tekenen van motorische betrokkenheid die later verschijnen in de loop van de ziekte, wanneer de meeste neuronen van de substantia nigra al verloren zijn gegaan. Dit protocol maakt het mogelijk de huidzenuwen analyse door huidbiopsie, dat een potentiële nieuwe biomarker van de ziekte vertegenwoordigt, te worden gebruikt in klinische proeven. Huidbiopsie is een gemakkelijk te beoordelen, niet-invasieve procedure die de analyse van perifeer zenuwweefsel dat gevoelig is voor de pathologie mogelijk maakt.

Alpha synuclein aggregaten detectie door huidbiopsie kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden, eventueel in vroege fasen, wanneer potentiële genezing het meest effectief is. Follow-up huidbiopten bij dezelfde patiënt zorgen voor een tijd en speciale cursusanalyse van alfasynuclein aggregaat verspreiding in het menselijk cutane zenuwstelsel. Deze kunnen licht werpen op de pathogenese van de ziekte.

Als u deze procedure wilt starten, stelt u een nieuwe PLP-fixatieve oplossing voor, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Onmiddellijk na het verzamelen van huidbiopsie, dompel het onder in een buis met 10 milliliter van de fixatieve oplossing. Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.

De volgende dag, in een rookkap, verwijder de PLP fixatief voorzichtig. In dezelfde buis, was de biopsie drie keer gedurende vijf minuten per stuk, met behulp van vijf milliliter van 0,1 molar Sorensen's oplossing voor elke wasbeurt. Gooi de oplossing van de Sorensen weg en voeg vijf milliliter cryoprotectantoplossing toe.

Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Bewaar de biopsie de volgende dag op vier graden Celsius als de snede met een cryotoom binnen een week moet worden uitgevoerd. Stel eerst de cryotome op min 20 graden Celsius.

Neem een cryomold en vul het met cryo-inbedding medium. Met behulp van een pincet, dompel de biopsie in de cryo-inbedding medium, met de longitudinale as parallel aan de onderkant van de cryomold. Bevries het monster met vloeibare stikstof, om een stevige kubus van cryo-inbedding medium met de biopsie in de juiste oriëntatie te verkrijgen.

Doe het monster in de cryostat en wacht 30 minuten om de biopsie te laten acclimatiseren. Bevestig vervolgens het monster op de cryostat en snijd in secties van 50 micrometer. Breng met behulp van een kleine borstel de cryo-secties over op een 96-putplaat met 200 microliter antivriesoplossing in elke put.

Bewaar hierna de plaat op min 20 graden Celsius. Vul om te beginnen enkele van de putten van een verse 96-put plaat met 100 microliter wasoplossing. Breng de te analyseren secties over van de opbergplaat naar de die met de wasoplossing.

Laat de secties in de wasoplossing gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Breng vervolgens elke sectie over in een lege put met dezelfde wasoplossing en herhaal de was. Voeg vervolgens een wasoplossing toe aan de secties en breng ze over naar nieuwe putten met 100 microliter blokkeeroplossing.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 90 minuten, en een maximum van vier uur. Verdun de primaire antilichamen, anti-PGP9.5 en anti-5G4, in de werkoplossing. Breng de secties over in nieuwe putten met 100 microliter van de werkoplossing van de primaire antilichamen en broed 's nachts uit bij kamertemperatuur.

De volgende dag, was de secties in putten met wasoplossing zoals eerder beschreven. Verdun de secundaire antilichamen, Goat anti-Rabbit om PGP9.5 te detecteren, en Goat anti-Mouse om 5G4 te detecteren, in de werkoplossing. Breng de gewassen secties over in nieuwe putten met 100 microliter van de werkoplossing van de secundaire antilichamen.

Bedek de plaat met aluminiumfolie om te voorkomen dat fluorofofoër geconjugeerd met secundaire antilichamen, en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Daarna was je de secties twee keer in de wasoplossing zoals eerder beschreven. Breng de gewassen secties in nieuwe putten met 100 microliters van DAPI gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.

Was de secties twee keer in wasoplossing zoals eerder beschreven. Monteer vervolgens de secties op een dia in de juiste positie, waardoor verkeerd worden gevouwen. Voeg een paar druppels montagemedium toe aan de dia en bedek de sectie met een afdeksel.

Laat de glijbanen 's nachts drogen. De volgende dag, bewaar de dia's in een geschikte doos op vier graden Celsius, zorg ervoor dat blootstelling aan licht te voorkomen. Met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop of een confocale microscoop, bekijk de secties.

Verkrijg de beelden door een camera aangesloten op de microscoop. Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop om positieve signalen in secties te analyseren in termen van ruimtelijke verdeling en intensiteit van het signaal zoals beschreven in het tekstprotocol. Volgens de beschreven methode worden alfasynucleinaggregaten met 5G4-antilichaam gedetecteerd in huidzenuw fascicles innervating autonome structuren van PD-patiënten.

De morfologie van alfa synuclein deposito's verschijnt als een gestippeld signaal langs de axonen van dermale zenuwen. Representatief gebruik van dit protocol bij 19 PD-patiënten en 17 controles in huidbiopten op drie anatomische locaties toont aan dat 5G4 een gevoeligheid heeft van 81% en een specificiteit van 86%in vergelijking met gezonde controles. Fosforylated alpha synuclein heeft een gevoeligheid van 56%en een specificiteit van 100%5G4 en fosforylated alpha synuclein-positieve afzettingen zijn voornamelijk te vinden rond zweetklieren, maar zijn ook te vinden in spierarrector pili, kleine bloedvaten, en subepidermale en dermale plexus, maar nooit in intraepmalider zenuwvezels.

Over het algemeen is het in het zweetklieren lumen mogelijk om een niet-specifiek signaal waar te nemen dat verkeerd kan worden geïnterpreteerd als 5G4 of fosforylated alpha synuclein positiviteit. Dit type signaal is gestippeld, bolvormig, en het is waarschijnlijk te wijten aan intraluminale autofluorescentie materiaal zoals aangetoond in technische controles zonder primaire en secundaire antilichamen. Colocalisatie met PGP9.5 die de zenuwvezels markeert, die morfologisch filamenteus en langwerpig zijn, helpt om het juiste signaal te identificeren.

Daarom wordt de specificiteit van 5G4-signaal sterk verhoogd door een dubbele immunostaining met een axonale marker. Een nauwkeurige fixatie van de biopsie is noodzakelijk voor het produceren van een hoogwaardige immunofluorescente kleuring en voor de betrouwbare interpretatie van de tl-signalen. Als de fixatieve niet correct is voorbereid, of als een over-fixatie heeft plaatsgevonden, zal het resultaat een hoge autofluorescentie die het signaal van zenuwvezels het oversteken van de huid-epidermale kruising zal maskeren, of innervate de belangrijkste huidstructuren.

De meest kritieke stap van deze procedure is weefselfixatie. Besteed aandacht aan de pH van PLP fixatieve oplossing, en de timing van de incubatie, om autofluorescentie en een specifiek signaal te voorkomen.