Röntgendiffractie van intact Murine skeletspieren als een instrument voor het bestuderen van de structurele basis van spierziekte
18 juli 2019
We presenteren gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van Small-angle röntgendiffractie experimenten met behulp van intact muis skeletspieren. Met de brede beschikbaarheid van transgene muismodellen voor menselijke ziekten, kan dit experimentele platform een nuttig testbed vormen om de structurele basis van genetische spierziekten te verhelderend
Fysiologisch intacte muis skeletspier kan produceren hoge kwaliteit X-ray diffractie patronen met veel structurele informatie die inzicht kan geven in fysiologische processen. Röntgendiffractie is de enige techniek die het mogelijk maakt structurele informatie met hoge resolutie uit levend spierweefsel onder echte fysiologische omstandigheden in echte fysiologische tijd te verkrijgen. Veel spierziekten worden geërfd.
Met een verhoogde beschikbaarheid om de meeste modellen van myopathieën genetisch te wijzigen, kan de röntgendiffractie structurele inzichten bieden in ziektemechanismen en therapeutische strategieën aangeven. De meeste extensor digitorum longus en soleus spieren zijn bijzonder handig voor dit doel. Maar veel andere spieren bij kleine dieren kunnen intact worden ontleed en op een vergelijkbare manier worden behandeld.
Schakel voor het begin van de procedure de gecombineerde motorkrachttransducer, de motorkrachttransducercontroller met een hoog vermogen bifasische stroomstimulator en een controlesysteem voor computercontrolegegevenscontrole in. Vervolgens, spray de huid op de achterste ledemaat van de muis met koude Ringer's oplossing en gebruik fijne dissectie schaar om de huid te snijden rond de dij. Met behulp van nummer vijf tangen, snel trek de huid naar beneden om de spieren bloot te stellen en amputeren de achterste ledemaat.
Plaats de ledemaat in een met elastomeer bedekte ontleedschotel met zuurstofhoudende Ringer's oplossing en plaats de schotel onder een verrekijker ontleden microscoop. Om de soleusspier te oogsten, speld de achterste ledemaat met de gastrocnemiusspier naar boven gericht. Gebruik fijne schaar om de distale pees van de gastrocnemius/soleus spiergroep te snijden.
Snijd de fascia aan weerszijden van de gastrocnemiusspier weg om de spieren zachtjes en langzaam van het bot te laten wegtillen. Bevrijd vervolgens de proximale pees van de soleusspier. Pin de spiergroep met de gastrocnemius spier en de distale pees in de schotel.
Til de soleusspier voorzichtig op via de proximale pees om deze te scheiden van de gastrocnemiusspier, waardoor zoveel mogelijk van de zool distale pees intact blijft. Om de extensor digitorum longus of EDL spier te oogsten, speld de achterste ledemaat in de schotel met de tibialis voorste spier naar boven gericht en snijd de fascia langs de tibialis voorste spier. Gebruik tangen om de fascia duidelijk te trekken en snijd de distale pees van de tibialis voorste spier.
Til de tibialis voorste spier en snijd het zorgvuldig uit zonder te trekken op de EDL spier, en snijd de zijkant van de knie open om de twee pezen bloot te leggen. Snijd de proximale pees, waardoor we een groot deel van de pees mogelijk nog steeds bevestigd aan de spier en voorzichtig trek op de pees om de EDL spier op te heffen. Snijd vervolgens de distale pees zodra deze wordt blootgesteld.
Om de geoogste spier te monteren, pin de spier via de pezen en trim zo veel van het extra vet, fascia en pees mogelijk. Steek een pees in een vooraf gebonden knoop en gebruik hechting bindkrachten om de hechting stevig vast te binden. Bind de tweede knoop rond de metalen haak en herhaal de procedure aan de andere kant van de pees.
Bevestig vervolgens de korte haak aan de onderkant van de experimentele kamer, en de lange haak op de dual-mode kracht transducer motor. Bel de oplossing in de experimentele kamer met 100% zuurstof. Om het stimulatieprotocol en de spierlengte te optimaliseren, passen de micromanipulators die aan de transducermotor zijn bevestigd aan om een basislijnspanning te genereren tussen 15 tot 20 millinewtons om de beste stimulusparameters te vinden om de spier te strekken.
Stel de stimulatiespanning in op 40 volt. De stimulatie stroom zal systematisch worden verhoogd totdat er geen extra toename van twitch kracht. Om de optimale lengte te vinden, verhoog de spierlengte en activeer de spier met een enkele twitch totdat de actieve kracht stopt met toenemen.
Voer een tetanische contractie van een seconde uit om de montage te testen en de spier zo nodig terug te rekken naar de optimale basiskracht. Neem vervolgens de spierlengte in millimeters op met een digitale remklauw. Om de positie van de bundel te bepalen, gebruikt u een stuk röntgengevoelig papier dat een donkere vlek produceert in reactie op röntgenfoto's en een videokruishargenerator om een crosshair te maken dat is uitgelijnd met het brandmerk op het papier.
Met behulp van de door BioCAT geleverde grafische gebruikersinterface naar de monsterpositioner, centreert u de spier op de bundelpositie en verplaatst u de monsterfase om de monsterkamer te oscilleren met 10 tot 20 millimeter per seconde om de röntgendosis tijdens de blootstelling over de hele spier te verspreiden. Let op het monster als het beweegt om grote gebieden van fascia die collageen bevatten te voorkomen en om ervoor te zorgen dat het blijft verlicht tijdens het hele pad van zijn reis. Bewapen de detector en wacht op de trigger van het data-acquisitiesysteem.
Activeer vervolgens tegelijkertijd de mechanische en röntgengegevens om ze te synchroniseren. De röntgenpatronen worden continu verzameld in het hele protocol met een belichtingstijd van 10 milliseconden en een belichtingsperiode van 50 milliseconden. In deze representatieve isometrische tetanische contractie werd de EDL spier 0,5 seconden in rust gehouden voordat deze een seconde werd geactiveerd, gevolgd door een ontspanning van 1,5 seconden.
De spier X-ray diffractie patroon kan geven nanometer resolutie structurele informatie uit structuren in de sarcomere. Myosine-gebaseerde laaglijnen met dikke filamenten zijn sterk en scherp in patronen van rustspieren, terwijl op actin gebaseerde laaglijnen met dunne filamenten prominenter zijn in patronen van aanbestedende spieren. Verschil patronen verkregen door het aftrekken van het rustpatroon van de aanbestedende patroon kan licht werpen op structurele veranderingen tijdens de ontwikkeling van kracht in gezonde en zieke spier.
Door het volgen van deze structurele veranderingen op de milliseconde tijdschaal van de moleculaire gebeurtenissen tijdens spiercontractie en ontspanning, de X-ray diffractie patronen kunnen onthullen aanzienlijke structurele informatie. In deze representatieve equatoriale reflecties analyse met behulp van de Equator routine in de open source MuscleX pakket, de equatoriale intensiteit verhouding geeft de nabijheid van myosine te actin in rustspier en is nauw gecorreleerd aan het aantal aangesloten bruggen in het contracteren murine skeletspier. De afstand tussen de twee 1, 0 reflectie is omgekeerd gerelateerd aan de interfilament afstand.
Een schone dissectie is de sleutel voor een succesvolle intacte spier X-ray experiment, dus probeer mechanische schade te voorkomen tijdens de spiervoorbereiding. Elk standaard fysiologisch protocol met hele spieren kan worden geïmplementeerd in deze experimenten en kan worden gebruikt om spieractivering, ontspanning en cross-bridge gedrag te bestuderen tijdens snelle mechanische vergankelijkheid. Genetische manipulatie van muizen wordt steeds geavanceerder.
Nieuwe transgene muismodellen zullen het mogelijk maken meer specifieke en inzichtelijke experimenten te ontwerpen om nieuwe therapeutische richtingen voor menselijke myopathieën aan te geven.
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het uitvoeren van kleinhoek-röntgendiffractie-experimenten op intacte skeletspieren van muizen. De methode biedt inzicht in de structurele basis van genetische spierziekten, gebruikmakend van de beschikbaarheid van transgene muismodellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Spiersfysiologie
Achtergrond
- Röntgendiffractie biedt structurele informatie met een hoge resolutie van levend spierweefsel.
- Het begrip van spierziekten kan profiteren van inzichten verkregen via structurele analyse.
- Transgene muismodellen zijn steeds vaker beschikbaar voor het bestuderen van myopathieën.
- Specifieke spieren zoals de musculus extensor digitorum longus en de musculus soleus zijn geschikt voor deze experimenten.
Doel van de studie
- Om de structurele veranderingen in spieren tijdens contractie en relaxatie te verduidelijken.
- Om een platform te bieden voor het bestuderen van de mechanismen van erfelijke spierziekten.
- Om potentiële therapeutische strategieën aan te geven op basis van structurele inzichten.
Gebruikte methoden
- Het winnen van intacte skeletspieren bij muizen.
- Het opzetten van röntgendiffractie-experimenten onder fysiologische omstandigheden.
- Het gebruik van een dual-mode krachttransducer voor spierstimulatie.
- Het verzamelen van röntgenpatronen om structurele veranderingen op nanometerschaal te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Röntgen diffractiepatronen onthullen structurele informatie over sarcomeren.
- Verschillen in patronen tussen rustende en samentrekkende spieren bieden inzicht in de krachtontwikkeling.
- Structurele veranderingen kunnen op millisecondenschaal worden gevolgd tijdens spieractiviteit.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de spierfunctie en ziektemechanismen.
Conclusies
- De studie demonstreert het nut van röntgendiffractie in spieronderzoek.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische benaderingen voor spierziekten informeren.
- Deze methode vergroot ons begrip van de spierfysiologie en pathologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Röntgen diffractie van intacte skeletspier van muizen maakt structurele analyse op nanometerschaal onder fysiologische omstandigheden mogelijk, waardoor een directe koppeling wordt gelegd tussen genotype en functioneel fenotype in spierziektemodellen. Deze benadering ondersteunt de validatie van targets door sarcomeerstructurele veranderingen tijdens krachtontwikkeling bloot te leggen, wat mechanistische risicoreductie biedt voor therapeutische strategieën bij erfelijke myopathieën. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door de afstand tussen filamenten en de cross-bridge-dynamiek op millisecondenschaal te kwantificeren.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door genetische modificaties te koppelen aan sarcomere structurele veranderingen in intacte spieren.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk via real-time structurele read-outs van myosin-actine-interacties tijdens contractie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt voorspellende betrouwbaarheid door het kwantificeren van structurele correlaten van cross-bridge-hechting en interfilamentaire afstand.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door de natuurlijke spierarchitectuur en fysiologie te behouden.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via gecontroleerde stimulatieprotocollen en gesynchroniseerde röntgendata-verzameling.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de geschiktheid voor screening via kwantitatieve structurele outputs, zoals equatoriale intensiteitsverhoudingen en layer line-analyses.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie van de ziekte door structurele veranderingen in transgene modellen te koppelen aan mechanismen van menselijke myopathie.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale structurele monitoring mogelijk te maken.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door structurele biomarkers van ziekteprogressie te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot preklinische validatie door structurele fenotypering van de spierfunctie onder fysiologische omstandigheden te bieden.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt via structurele analyse van sarcomere dynamiek.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve outputs via gesynchroniseerde mechanische en röntgendata-acquisitie.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische outputs die teams helpen bij het vergelijken van condities, waaronder equatoriale intensiteitsverhoudingen en reflectiespacing.
- Translationaal Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming door structurele veranderingen in ziektemodellen te volgen.
- Enterprise Reuse: Kaderen de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek door middel van gestandaardiseerde montage- en stimuleringsprotocollen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risicogebaseerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in spierfysiologie, röntgendiffractie en het werken met transgene modellen.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder synchrotron-beamlines, dual-mode krachttransducers en gesynchroniseerde systemen voor gegevensverwerving.
- Vereisten voor standaardisatie tussen teams voor protocollen betreffende spierdissectie, montage en stimulatie over verschillende laboratoria heen.
- Overwegingen voor adaptatie over modelsystemen, in het bijzonder voor verschillende muisspieren en ziektemodellen.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal, waaronder de noodzaak van een schone dissectie om contaminatie door fascia te voorkomen en de integriteit van het monster tijdens de belichting te behouden.
