Een nauwkeurig pathogeen lever-en Terugwinningssysteem voor Muriene modellen van secundaire bacteriële pneumonie

Het algemene doel van deze procedure is het verbeteren van secundaire bacteriële longontsteking studies door het verstrekken van een eenvoudige en niet-invasieve route van bacteriële inenting in de onderste luchtwegen, gevolgd door bacteriële herstel en zuivering van RNA voor transcript analyse. Dit zal worden bereikt door eerst diep verdovend een muis en het invoegen van een voorgeladen stompe gebogen naald in de luchtpijp van een muis die verticaal is opgehangen aan de maxillaire snijtanden. Ten tweede, na een succesvolle infectie, bacteriële kolonie-vormende eenheden worden hersteld door excisie en homogenisatie van de longen.

Het resulterende longhomogenaat wordt serieel verdund en verguld op voedingsagar om kolonievormende eenheden op te sommen. Ten slotte wordt RNA gezuiverd uit het longhomogenaat. Het voordeel van deze procedure is dat het een gecontroleerde levering direct in de onderste luchtwegen mogelijk maakt.

Dat stelt ons in staat om te kijken naar zowel de combinatorische als individuele bijdragen van de ziekteverwekker aan de uitkomst van de ziekte. Recente vooruitgang op dit gebied hebben aangetoond dat bacteriële genregulatie een grote rol kan spelen bij het bepalen van de uitkomst van infectie. Deze techniek profiteert van de mogelijkheid om zowel bacteriële CFUs en vervolgens RNA te herstellen.

Zodra het RNA is geïsoleerd, kunnen we de bijdragen van specifieke virulentiegenen naar de infectie beoordelen. Bovendien is deze techniek gebaat bij het niet-chirurgisch zijn. Hierdoor kan minimale belasting worden gelegd op dieren die binnen deze procedure worden gebruikt en kunnen ze onmiddellijk herstellen.

Deze procedure profiteert van het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur zonder het gebruik van elk type canules, geleidedraden of glasvezelkabels. Individuen die nieuw zijn op deze techniek kunnen worstelen op het eerste met de werkelijke installatie door de luchtpijp. Zodra deze techniek is geconceptualiseerd, wordt het een eenvoudige en effectieve procedure om secundaire bacteriële longontsteking te ondervragen binnen een murine host.

Bereid de werkruimte voor met de volgende benodigdheden: een intubatieplatform, een steriele spuit van één mL, steriele stompe tangen, steriele 21-meter botte naald en twee conische buizen om de spuit en tangen op te slaan. Begin de procedure met het voorbereiden van de pathogene entculums, zodat de gewenste uiteindelijke concentratie wordt verkregen in een volume van 50 microliter. Vervolgens, met behulp van steriele handschoenen bereiden een een tot 1,5 inch 21-gauge stompe naald door het buigen van het tot een hoek van ongeveer 35 graden.

Na het bevestigen van de naald aan de spuit, teken een 100 microliter luchtkussen, gevolgd door 50 microliter van het besmettelijke middel. Het 100 microliter luchtkussen zorgt voor volledige levering van de pathogene belasting zodra de spuit depressief is. Plaats de geladen naald en spuit op een plaats die gemakkelijk bereikbaar is met de dominante hand.

Verwijder en verdoof de muis uit de anesthesiekamer en hang de muis op het intubatieplatform van de maxillaire snijtanden. Met behulp van de stompe tangen, voorzichtig grijpen en uitstrekken van de tong. Breng de tong van de tang in de duim en wijsvinger van de niet-dominantie hand.

Blijf de tong in de niet-overspannende hand houden en pak de voorgeladen spuit. Richt het gebogen uiteinde van de naald uit de buurt van het lichaam. Steek de naald in de mondholte.

Aan de basis van de tong voorzichtig hoek van de pols om een lichte druk van de naald uit de buurt van het lichaam veroorzaken. Deze actie zorgt ervoor dat de naald in de luchtpijp wordt gestoken en niet in de slokdarm. Leid de naald langzaam naar beneden in de luchtpijp.

Vaak wordt een lichte teek gevoeld als de naald door de vocale vouw gaat. Geef de naald door de luchtpijp tot lichte weerstand wordt gevoeld als de naald de carina tegenkomt. Til de naald iets in de opwaartse richting op om de naald boven de carina op te hangen.

Dit maakt levering in de primaire bronchiën mogelijk. Druk de spuitzuiger volledig in om de besmettelijke belasting te leveren. Haal de naald uit de luchtpijp en gooi de naald weg.

Verwijder de muis van het intubatieplatform door de rubberen band te deprimeren, maar houd de muis rechtop. Hinder de neusroutes door een vinger direct over de nares te plaatsen. Houd deze positie gedurende ongeveer een minuut of totdat een aantal diepe ademhalingen worden waargenomen.

Deze laatste stap zorgt ervoor dat het totale entculumvolume in de onderste luchtwegen wordt geleverd. Breng het dier terug naar zijn kooi en zorg ervoor dat er een snel herstel van de anesthesie is. Op geselecteerde tijdstippen nainfectie kunnen de geïnfecteerde longen worden verwijderd om de bacteriële bijdragen aan de verhoogde morbiditeiten geassocieerd met secundaire bacteriële pneumonie te kwantificeren en te beoordelen.

Bereid een werkruimte voor met de volgende items: een schaal en steriele weegboot, ontledingsplatform, een dissectiekit met een schaar en tangen en steriel gaas. Voor de toepassing van deze demonstratie zal de excisie van de longen worden uitgevoerd op een bankje. Echter, om steriliteit te behouden tijdens deze procedure wordt aanbevolen dat de longexcisie worden uitgevoerd binnen een laminaire stroomkap.

Euthanaseer een besmette muis met CO2 of soortgelijke IACUC goedgekeurde methode van euthanasie. Plaats en beveilig de geïnfecteerde muis op het dissectieplatform. Spuit de muis met ethanol om steriliteit op de werkoppervlakken te behouden.

Begin bij de umbilicus, gebruik een paar tangen om de huid op te tillen en een incisie te maken naar het strottenhoofd. Grijpen de huid aan weerszijden van de eerste incisie, trek de huid uit de buurt van het lichaam en snijd door de weefselverbindingen. Het kan nuttig zijn om zijdelingse snijwonden over de huid te maken om meer van de thoracale regio te onthullen.

Vanaf de basis van het xiphoid-proces, maak een kleine incisie met de bedoeling om het middenrif te doorboren. Dit resulteert in een toename van de druk in de borstholte waardoor de longen zich terugtrekken. Met de ingetrokken longen, zet de incisie voort om het middenrif te bevrijden.

Verwijder de ribben door het maken van een incisie aan weerszijden. Dit zal de borstholte en de longen blootleggen. Om de longen uit te roeien pak de basis van het hart met de tangen en til omhoog.

Plaats de schaar achter de longen en beginnen met kleine insnijdingen te maken door het weefsel verbindingen, terwijl de voortzetting van het hart omhoog te tillen. Zodra de longen zijn uitgesneden, plaats ze op een steriel gaas en verwijder het hart door het uit de buurt van de longen en het snijden van de resterende weefselverbindingen. Breng de longen naar de voorgedekt weegboot en neem de massa op.

Nadat de longen zijn gewogen, breng de longen in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing en tijdelijk op te slaan op ijs. Nu de longen zijn weggesneden en gewogen, kunnen de bacteriën worden teruggewonnen om hun rol ten opzichte van pathogenese te bepalen. Ter voorbereiding op bacterieel herstel zijn de volgende benodigdheden nodig: een weefselmolen, steriele RNase-vrije PBS, buffer RLT aangevuld met bèta-mercaptoethanol en 1,5 mL RNase-vrije microcentrifugebuizen.

Begin met eerst één mL steriele RNase-vrije PBS toe te voegen aan de weefselmolen. Eenmaal gevuld, bewaar de weefselmolen op ijs. Bereid vervolgens een reeks steriele RNase-vrije seriële verdunningsbuizen voor om de bacteriële belasting die uit de geïnfecteerde longen wordt teruggewonnen, te kwantificeren.

Breng de longen in de voorbereide weefselmolen en grondig homogeniseren het weefsel door te drukken op het voetstuk tijdens het draaien. Open de weefselmolen en aliquot 100 microliter van het gehomogeniseerde monster in de eerste van de bereide seriële verdunningsbuizen. Verdun de monsters en plaat op voedingsagar in serie om de kolonievormende eenheden op te sommen.

CFI's kunnen worden geregistreerd als CFUS per mL of CFUs per mL, per milligram longweefsel. Nadat de 100 microliter aliquot is verwijderd, vervangt u het slijpslangstuk en centrifugeert u het monster bij 4.000 tpm gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Wanneer de centrifugatie is voltooid, verwijder de supernatant uit het pelleted monster.

De supernatant kan worden opgeslagen en opgeslagen bij min 80 graden Celsius voor verdere analyse op een later tijdstip. Schort de gehomogeniseerde weefselpellet opnieuw op in 700 microliter RLT beta-mercaptoethanol en breng het monster over naar een steriele RNase-vrije 1,5 mL centrifugebuis. Op dit punt kan het monster worden opgeslagen bij min 80 graden.

Het RNA kan worden gezuiverd uit de RLT longhomogenate drijfmest door het laden van het monster in een twee mL microcentrifuge buis met 1 millimeter silica kralen en verwerkt via een kraal klopper gedurende 20 seconden op zes meter per seconde. RNA wordt dan onmiddellijk gezuiverd met behulp van een aanpassing van de RNeasy-methode zoals gerapporteerd in Voyich, et al. Methoden in moleculaire biologie"2008, en beschreven in het manuscript bij deze video.

Na zuivering kan de RNA-opbrengst worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer. Eenmaal gekwantificeerd, is het gunstig om het resulterende RNA te verdunnen tot verschillende aliquots van 50 nanogram per microliter. Hierdoor kan het RNA uit het monster worden gebruikt voor meerdere analyses zonder dat het wordt onderworpen aan meerdere vriesdooicycli.

Het gebruik van deze techniek maakt de installatie van een gecontroleerde pathogene belasting direct in de onderste luchtwegen mogelijk. De efficiëntie van dit leveringssysteem kan worden aangetoond door de installatie van een 1%Coomassie briljante blauwe oplossing. De bovenste rij toont een paar niet-geïnfecteerde longen om te dienen als een controle, terwijl de onderste rij toont een paar longen die hebben ontvangen 50 microliters van de 1%Coomassie briljante blauwe kleurstof door middel van een intratracheale installatie.

Het gebruik van deze kleurstof laat zien hoe de intratracheale installatie zorgt voor een gelijkmatige verdeling van de pathogene belasting in en door de linker- en rechterlongen. Eenmaal geïnfecteerd, kan de pathogene belasting worden hersteld en geanalyseerd op verschillende tijdstippen post-intratracheale installatie door excisie en homogenisatie van het longweefsel. Om de efficiëntie van deze hersteltechniek aan te tonen werden twee groepen met drie muizen elk besmet met een lage en hoge dosis Staphylococcus aureus.

De bacteriële input werd verguld op voedingsagar om CFUs op te sommen. Een uur na de intratracheale installatie werden de muizen geëuthanaseerd, longen uitgesneden en gehomogeniseerd in een weefselmolen. Het gehomogeniseerde weefsel werd serieel verdund en verguld met voedingsagar om CFUS op te sommen.

Het RNA geïsoleerd van het gehomogeniseerde longweefsel kan worden onderzocht door omgekeerde transcriptase PCR en gebruikt om de relatieve transcriptie overvloed van doelgenen te kwantificeren. Om minimale DNA-besmetting op de achtergrond te garanderen, wordt aanbevolen dat een PCR-reactie, zonder toevoeging van omgekeerde transcriptase, naast eventuele qRT-PCR-reacties wordt uitgevoerd. Naast bacteriële belastingen, kan deze techniek worden uitgebreid tot de installatie en isolatie van virale belastingen.

Na homogenisatie van het longweefsel kan viraal RNA worden geïsoleerd en gebruikt om de transcriptieovervloed van virale genen te meten of een standaardcurve te construeren voor virale kwantificering. Het gebruik van dit systeem biedt een zeer efficiënt en reproduceerbaar systeem om secundaire bacteriële longontsteking te bestuderen. Eenmaal onder de knie, kan deze procedure worden gebruikt in grootschalige experimenten.

Werken in batches om muizen te euthanaseren, kan de intratracheale installatie optreden binnen 30 seconden per muis. Nadat dit is voltooid, overgaand tot de excisie van de longen, kan dit in ongeveer twee tot drie minuten per muis worden voltooid. Terwijl de hier besproken methoden waren binnen de context van een secundaire bacteriële infectie, kunnen ze worden uitgebreid naar elke procedure waar een gecontroleerde levering en herstel van een entmateriaal noodzakelijk is.

Naast de hier beschreven methoden kan deze procedure worden aangevuld met de toevoeging van een bronchoalveolaire lavage voorafgaand aan de excisie van de longen. Hoewel dit vaak resulteert in een verminderd herstel van de pathogene belasting, profiteert het van het verkrijgen van gegevens, zoals cytokine-analyse, lactaatdehydrogenaseactiviteit en de identificatie van verschillende cellulaire populaties. Om een vollediger begrip te krijgen van ziektepathogenese wordt het belangrijk om zowel gastheer als ziekteverwekker bijdragen aan de ziekte te ondervragen.

Het doel van deze video was om een eenvoudige en efficiënte methode voor het verkennen van secundaire bacteriële longontsteking binnen een murine host.