Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay
7 mei 2019
Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.
Zoals we al weten, de tumor micro-omgeving is een essentieel onderdeel van de groei van kanker en invasie. Om de progressie van carcinoom na te bootsen, hebben we een biologisch relevante menselijke tumormatrix nodig. Dit is de enige menselijke tumor matrix gebaseerd in vitro invasie test.
Vergeleken met de klassieke sferoïde test, deze methode is niet als temperatuurgevoelig en vereist geen sferoïde overdracht. Deze techniek is geschikt voor patiënt-afgeleide vaste kanker monsters zoals hoofd en nek carcinoom en kan uitgebreid naar gepersonaliseerde geneeskunde, waaronder chemoradiatie therapieën. Deze menselijke tumor-gebaseerde matrix is al gebruikt voor verschillende toepassingen, waaronder high-throughput drug testen, live-cel analyse, wondgenezing, en overdracht testen.
De meest technisch gevoelige stap is de behandeling van de fibrinogen wordt toegevoegd, dus misschien wilt u deze stap eerst oefenen met lege putten. Het is belangrijk om de juiste behandeling van de matrix te laten zien en het is gemakkelijk te analyseren door de methode visueel weer te geven. Voor meercellige tumor sferoïde generatie, een keer 10 uitdelen aan de derde cellen van de cel lijn van belang in 50 microliters van compleet medium in elke put van een 96-well ultra-lage bevestiging ronde bodemplaat.
Plaats de plaat vervolgens in een 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxidecelcultuur incubator voor vier dagen voordat visueel bevestigen tumor sferoïde vorming met een omgekeerde microscoop. Om een driedimensionale sferoïde invasietest op te zetten, ontdooi je menselijke myoma-afgeleide matrix op ijs en ontdooi fibrinogen voorraadoplossing in een 37 graden Celsius waterbad. Wanneer de reagentia zijn opgewarmd, meng de juiste volumes van volledige medium, menselijke myoma-afgeleide matrix, trombine, aprotinine, en fibrinogen, het toevoegen van de fibrinogen net voor het verstrekken van de matrix mengsel in de cellen.
Voeg onmiddellijk 50 microliters van de resulterende gel toe in elke put van de sferoïde kweekplaat, die de punt naar de binnenwand van elke put leidt en pipetting vertraagt zonder de sferoïde uit het midden van de put te bewegen. Aangezien de fibrinogen begint te gelen na een paar minuten, het vereist een robuuste maar nauwkeurige omgekeerde pipetting en de behandeling van slechts een paar putten tegelijk. Breng de plaat 30 minuten terug naar de couveuse van de celkweek om de menselijke myoma-afgeleide matrixfibringel te laten stollen voordat u voorzichtig 100 microliters van volledig medium aan de bovenkant van elke gel toevoegt.
Beeld dan dagelijks de sferoïde invasie in. Open voor beeldsegmentatie met ilastik de open-source beeldclassificatie- en segmentatiesoftware en selecteer Pixelclassificatieworkflow. Sla het ilastik-project op de computer op.
De pixels worden ingedeeld op basis van annotaties gemaakt door de gebruiker. Klik op Invoergegevens en Nieuw toevoegen om afbeeldingen voor de analyse te selecteren. Klik voor functieselectie op Functieselectie en Selecteer Onderdelen.
Klik op de juiste vakken om de kenmerken van belang te selecteren. De geselecteerde vakken worden groen. Klik voor een training op Trainen.
In de sectie Training moeten er twee labels zijn: Label 1 en Label 2. Markeer de achtergrond met een van de labels en markeer de cellen met het andere label. Wanneer alle cellen en achtergronden in de eerste afbeelding zijn gelabeld, selecteert u de volgende afbeelding in de huidige weergave om de cellen en achtergrond te blijven markeren totdat 10% van de afbeeldingen is gemarkeerd.
Selecteer vervolgens Live Update om alle afbeeldingen te analyseren. Wanneer de training is voltooid en ilastik alle afbeeldingen heeft geanalyseerd, klikt u op Voorspelling exporteren en selecteert u Eenvoudige segmentatie van bron. Selecteer vervolgens de gewenste uitvoerbestandsindeling in De afbeeldingsinstellingen exporteren kiezen en klik op Alles exporteren om de resultaten van de etikettering te exporteren.
De bestanden worden geëxporteerd naar dezelfde map met de oorspronkelijke afbeeldingen. Open voor gebiedsanalyse eerst de oorspronkelijke afbeelding met een schaalbalk in Fiji ImageJ, waarbij u ervoor zorgt dat de afbeelding dezelfde grootte en dimensie heeft als de geanalyseerde afbeeldingen. Gebruik het gereedschap Lijnselectie om een lijn van een bekende lengte te tekenen en klik op Schaal analyseren en instellen.
Stel vervolgens de bekende afstand in in het veld Bekende afstand. Stel de juiste eenheid in en klik op Globaal. Als u de ilastik-plug-in wilt installeren, klikt u op Help en bijwerken en klikt u op Updatesites beheren in het imagej-updatevenster.
Klik naast ilastik, Sluiten en Wijzigingen toepassen. Na enkele minuten verschijnt er een informatievenster waarin wordt vermeld dat het is bijgewerkt. Klik op OK en start ImageJ opnieuw.
Klik vervolgens op Plug-ins, macro's en installeren en selecteer de teller. ijm-bestand. Klik vervolgens op Openen.
Als u de gebiedsanalyse wilt voltooien, klikt u op Plug-ins en scrolt u om ilastik te selecteren. Selecteer HDF5 importeren en selecteer het bestand met de h5-indeling. Klik op Tabel Openen en laden en opzoekt.
Klik vervolgens op de A-knop op het toetsenbord en het gebied wordt weergegeven in het overzichtsvenster als het totale gebied. In dit representatieve experiment, vier dagen na gemetastaseerde laryngeale plaveiselcelcarcinoom cellijn zaaien, matrix werd toegevoegd aan de gevormde sferoïden zoals aangetoond en de invasie werd dagelijks gecontroleerd op een omgekeerde microscoop. Eenmaal ingebed, cellen in de menselijke myoma-afgeleide fibrine matrix begon snel binnen te vallen na een dag en uitgebreid in de matrix in de komende twee dagen.
Cellen in de muis sarcoom-afgeleide matrix niet binnen te dringen in de omringende matrix, in plaats daarvan vormen een asymmetrische structuur. Cellen in het collageen vielen iets binnen, maar door matrixkrimp werd de analyse moeilijk. In sommige putten verdwenen de sferoïden zelfs na drie dagen.
Hier wordt kwantificering van de invasie van een primaire en een gemetastaseerde laryngeale plaveiselcelcarcinoomcel in menselijke myoma-afgeleide fibrinematrix getoond. Live-cel analyse van menselijke myoma-afgeleide fibrine matrix sferoïde invasie onthult celbeweging in strengen in de matrix die wordt gevolgd door andere cellen in de tijd. Vergeet niet om voorzichtig te zijn niet te bewegen de sferoïde van het centrum positie bij het toevoegen van de matrix aan de putten.
Deze procedure kan worden gebruikt om te bestuderen hoe bestraling en specifieke moleculen zoals kankermedicijnen invasie beïnvloeden. De cellen kunnen worden vastgesteld en gekleurd voor latere studies. In het klassieke muis sarcoom model vermenigvuldigen de cellen zich voornamelijk en is het invasieaspect minimaal.
Deze menselijke tumor-gebaseerde matrix induceert invasie, waardoor de remming studies efficiënter.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe in vitro driedimensionale sferoïde-invasie-assay die gebruikmaakt van een matrix afgeleid van een menselijk leiomyoom, waardoor de nabootsing van carcinoomprogressie wordt verbeterd. De methode maakt een verbeterde analyse van tumorcelinvasie mogelijk en is toepasbaar op solide kankerstalen van patiënten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Kankerbiologie
- Tumormicro-omgeving
- In vitro-assays
Achtergrond
- De tumoromgeving speelt een cruciale rol bij de groei en invasie van kanker.
- Een biologisch relevante menselijke tumormatrix is essentieel voor een nauwkeurige modellering van de progressie van carcinomen.
- Deze methode is minder temperatuurgevoelig in vergelijking met klassieke sferoïde-assays.
- Het is geschikt voor toepassingen in de gepersonaliseerde geneeskunde, waaronder chemoradiatietherapieën.
Doel van de studie
- Om een op een menselijke tumormatrix gebaseerde assay te ontwikkelen voor het bestuderen van cancer-celinvasie.
- Om een protocol te bieden dat de technische uitdagingen die gepaard gaan met traditionele methoden minimaliseert.
- Om high-throughput drug testing en live-cell analyse mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Generatie van multicellulaire tumorsferoïden in platen met ultra-lage hechting.
- Bereiding van een uit menselijk myoom afgeleide matrix en fibrinogeen voor de invasie-assay.
- Dagelijkse beeldvorming van de invasie van sfroïden met behulp van een omgekeerde microscoop.
- Beeldanalyse met ilastik voor segmentatie en kwantificering van het oppervlak.
Belangrijkste resultaten
- Cellen in de matrix afgeleid van menselijk myoom infiltreerden snel, wat een effectieve modellering van het tumorgedrag aantoont.
- Vergelijking met andere matrices toonde duidelijke invasiepatronen, wat de voordelen van de menselijke matrix benadrukt.
- Live-cell analyse onthulde dynamische celbeweging en invasie gedurende de tijd.
- De methode kan worden aangepast om de effecten van verschillende behandelingen op tumorinvasie te bestuderen.
Conclusies
- De uit menselijk myoom afgeleide matrix biedt een robuust platform voor het bestuderen van de invasie van kankercellen.
- Deze assay kan onderzoek naar therapeutische interventies voor kanker faciliteren.
- Juiste hantering en methodologie zijn cruciaal voor een succesvolle implementatie van de assay.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Deze assay vult een kritieke leemte in preklinisch kankeronderzoek door een matrix te bieden die is afgeleid van menselijke tumoren, welke de in vivo micro-omgeving beter nabootst dan alternatieven afgeleid van dieren. Hiermee is een meer voorspellende modellering van carcinoominvasie mogelijk, wat doelwitvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Het platform is geschikt voor screeningstoepassingen en translationele continuïteit, in het bijzonder voor hoof- en halscarcinomen en patiëntafgeleide monsters.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door functionele validatie van targets mogelijk te maken in een context van een mens-relevante extracellulaire matrix.
- Operationele waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door directe observatie van invasie-fenotypes in een biologisch pertinent systeem.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen te identificeren die invasie moduleren in een model dat voorspellend is voor het gedrag van menselijke tumoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar 3D-systeem voor de kwantitatieve beoordeling van de effecten van verbindingen op celinvasie.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput drug-testing mogelijk met minimale technische variabiliteit dankzij een verminderde temperatuurgevoeligheid en het feit dat er geen overdracht van sferoïden nodig is.
- Schaalbaarheid: Compatibel met 96-well ultra-low attachment plates, wat miniaturisering van de assay en screening van meerdere condities ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt gebruik van matrix afgeleid van menselijk leiomyoom om ontdekkingsbevindingen te koppelen aan preklinische validatie in een ziekterelevant systeem.
- Afstemming van biomarkers: Faciliteert live-cell analyse van invasiedynamiek, waardoor correlatie met moleculaire signaturen of behandelingsresponsen mogelijk wordt.
- Risico-geoptimaliseerde voortgang: Ondersteunt go/no-go beslissingen door de inhibitie van invasie te kwantificeren, een cruciaal fenotypisch eindpunt bij de preventie van metastase.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische werkzaamheidstests, in het bijzonder voor programma's die gericht zijn op metastase.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van invasiedrivers en pathway-modifiers in de context van een menselijke tumormicro-omgeving.
- Screening: Levert kwantitatieve, op imaging gebaseerde readouts die geschikt zijn voor geautomatiseerde analyse en compound-profilering.
- Analytics: Genereert metingen van het invasiegebied via ilastik en ImageJ, waardoor statistische vergelijking tussen condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door een cruciale stap in metastasering te modelleren met behulp van een matrix van menselijke herkomst.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform dat toepasbaar is op diverse solide kankertypen en therapeutische modaliteiten, inclusief chemoradiatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door de afhankelijkheid van niet-menselijke matrices die het menselijke tumorstroma slecht nabootsen, te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door een gedefinieerd protocol voor matrixbereiding en een imaging-workflow.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door de vroege voorspelling van klinische translatabiliteit te verbeteren, waardoor fouten in een laat stadium door gebrekkige metastase-modellering worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van leads mogelijk op basis van de potentie voor invasieremming in een menselijk relevant systeem.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in 3D-celkweek, matrixhandling en steriele technieken voor de bereiding van fibrinogel.
- Afhankelijk van toegang tot omgekeerde microscopen, ilastik en Fiji ImageJ voor beeldvorming en analyse.
- Vereist cross-team standaardisatie van sferoïdvorming en matrixdistributie om positionele artefacten te voorkomen.
- Aanpassing aan andere modelsystemen vereist validatie van de matrixcompatibiliteit en invasiekinetiek.
- Praktische beperking: Fibrinogeen initieert een snelle gelering, wat nauwkeurig gepipetteerde timing vereist om de integriteit van de sferoïden te behouden.
