Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Met deze methode kunnen we de effecten van intrinsieke activiteit op de rijping van corticale interneuronvoorlopers bestuderen. Deze techniek biedt een efficiënte manier voor het richten en manipuleren van de cellulaire eigenschappen van corticale interneuron voorlopers die toegankelijk is voor de meerderheid van de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol omvat de zorgvuldige behandeling van monsters en apparatuur, en het kan het best worden gewaardeerd door visuele demonstratie.

Met behulp van een waterdichte pen, trek een rechte lijn over het midden van het onderste deel van het onderste oppervlak van zes 35-millimeter petrischaaltjes. Voeg 10 milliliter vloeibare 4% lage geleling agarose in PBS in twee van de 35-millimeter petrischaaltjes en insluiten drie tot vier ontleed hersenen in de agarose met de reukbollen naar beneden per schotel over de rechte lijn, waardoor drie tot vijf millimeter ruimte tussen elk monster. Wanneer alle hersenen zijn ingebed, plaats de gerechten op vier graden Celsius om de agarose te stollen en snijden de drie hersenen in een enkel blok van agarose, waardoor ongeveer drie millimeter gel rond de randen van de monsters.

Lijm het blok op het oppervlak van een microtome basis en gebruik een chirurgisch mes om helemaal door de bodem van het blok tussen elk weefselmonster te snijden om drie onafhankelijke blokken te verkrijgen. Gebruik vervolgens een trillende blade microtome om de blokken in ijskoude Krebs-oplossing te delen in 250-micrometer dikke plakjes, met behulp van een gebogen platte microspatula om alleen de plakjes met de mediale of caudale ganglionic eminenties te verzamelen. Plaats vervolgens elke sectie op individuele 13-micrometer diameter, acht-micrometer porie grootte filtermembranen drijvend op minimale essentiële medium in individuele polystyreen centrum goed orgaancultuur gerechten.

Wanneer alle secties zijn verkregen, plaats de gerechten in een koolstofdioxide weefsel kweek incubator op 37 graden Celsius voor een uur. Vóór de brandpunts-DNA-injectie, plaats een millimeter diameter, 10-millimeter lange agarose kolommen geponst met een glas 225-millimeter lange, twee-milliliter capaciteit glazen pipet in ijskoude Krebs oplossing. Met behulp van een chirurgisch mes, snijd een kleiner stuk agarose te passen op het oppervlak van de elektroporatie elektrode en een groter stuk te gebruiken als basis voor de focale DNA-injecties.

Plaats vervolgens de agarose blokken in ijskoude Krebs oplossing. Meng voor de injectie het expressie- en controlevector-DNA met een concentratie van één microgram per microliter voor elke vector en voeg een snelle groene voorraadoplossing toe bij een één tot tiende verdunning. Vul een getrokken 0,5-millimeter binnendiameter, een milliliter glazen micropipet met 10 microliter van het DNA-mengsel en laad de micropipet in een pneumatische PicoPump-injector.

Plaats het grotere blok van agarose onder een stereomicroscoop en plaats het te injecteren plak op het stuk agarose. Injecteer vervolgens 25 tot 50 nanolitervolumes in de geselecteerde mediale ganglionic of caudal ganglionic eminence regio van de slice. Direct na de injectie plaatst u het kleine agaroseblok op de petrischaalelektrode en gebruikt u een platte microspatula om de agarosekolom aan de mobiele afdekkenelektrode te bevestigen.

Breng het geïnjecteerde plak met het ondersteunende membraan over op het agaroseblok en plaats de bovenste elektrode met de agarosekolom bovenop het geselecteerde gebied van de slice. Vervolgens elektroporate de regio met twee vijf milliseconden pulsen van 125 volt, 500 milliseconden uit elkaar. Na de elektroporatie, plaats het plakje met zijn ondersteunende membraan terug in zijn holding schotel en breng de schotel terug naar de weefselkweek incubator.

Na een uur, vervang het minimale essentiële medium met een basismedium geschikt voor primaire neuronale culturen en de plakjes 's nachts terug te brengen naar de incubator. In deze elektroporatie-experimenten, ongeveer 50% van de GFP positieve neuronen mede-uitgedrukt de RFP positieve geïnjecteerd eiwit en daarom, de GFP positieve RFP negatieve bevolking diende als een interne controle voor het effect van de geïnjecteerde DNA liganden. Clozapine en oxide toediening verhoogt selectief de activiteit van transfected RFP positieve cellen, zoals blijkt uit de expressie van het activiteitsafhankelijke eiwit, c-Fos, in deze pasgeboren coronale weefselsecties.

Clozapine- en oxidebehandeling resulteert ook in een toename van het aandeel GFP-positieve RFP-positieve cellen ten opzichte van het aantal GFP-positieve RFP-negatieve cellen in vergelijking met door voertuigen toegediende nestgenoten. Deze procedure kan worden gebruikt om de effecten van activiteit-gemoduleerde geënte geïnterneerde geïnterneerde internurons op de plasticiteit van de bloedsomloop en de hersenfunctie van de gastheer te bestuderen.