Name: Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Leer hoe u chemogenetisch gemanipuleerde corticale interneuron-progenitors transplanteert in vroege postnatale muizenhersenen. Deze methode maakt onderzoek naar de effecten van intrinsieke activiteit op de rijping van interneuron-voorlopers mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een ERC starter Grant (282047), een Wellcome Trust Investigator Award (095589/Z/11/Z), een KP7 EC DESIRE Grant en een Lister Institute Prize aan JB. Het werk in V.P. laboratorium wordt ondersteund door de BBSRC (BB/L022974/1), de Britse Medical Research Council (MRC) en het Francis Crick Institute (dat financiering ontvangt van het MRC, Cancer Research UK en het Wellcome Trust). Het onderzoek in M.D. lab werd mogelijk gemaakt door de subsidie van de Stavros Niarchos Foundation aan de B.S.R.C. "Alexander Fleming", als onderdeel van het initiatief van de Stichting ter ondersteuning van het Griekse onderzoek.

Dieren zijn gefokt en gehuisvest in overeenstemming met de wet op de dieren (wetenschappelijke procedures) van het Verenigd Koninkrijk (1986).
Opmerking: Voor de generatie van de pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP construct is een SalI-StuI fragment, dat de hM3D (GQ) sequentie bevat, geïsoleerd van plasmide 50463 (Addgene), en ingevoegd in de expressie vector pCAGGs-RFP (geschenk van F. Guillemot) verteerd met XhoI-EcoRV.
1. bereiding van de corticale schijfjes muis embryo
<ol><li>Steriliseren van labapparatuur (bijv. stereo microscopen) en oppervlakken (bijv. banken) met een geschikt detergens oplosmiddel en 70% ethanol (EtOH) oplossing in water (H2O).</li>
	<li>Gebruik dissectie gereedschappen die zijn geautoclaveerd en houd ze de hele tijd in 100% EtOH.</li>
	<li>Bereid 3 20 mL aliquots van 4% low-Gelling temperatuur agarose in 1x fosfaatbufferoplossing (PBS), in 50 mL buizen, en houd ze op 55 °C.</li>
	<li>Offeren zwangere muizen door cervicale dislocatie op 13,5 of 14,5 dagen van de dracht (embryonale dag E 13.5-E 14.5).</li>
	<li>Met een paar dissectie schaar, open de buik van de zwangere muizen, verwijder de baarmoeder hoorns (met de embryo's) en plaats ze in ijskoude Krebs-oplossing (tabel 1), in een 90 mm Petri schaaltje.</li>
	<li>Met een paar Straight student Fine Tang, open de amniotische zakjes, verwijder de embryo's en breng ze over in verse ijskoude Krebs-oplossing, in een nieuwe 90 mm Petri schaal. Dissect de muis embryo hersenen (forebrain, midbrain, hindbrain) van de rest van het embryo lichaam.</li>
	<li>Houd de ontleed hersenen van de achterhersenen, breng ze over in ijskoude Krebs-oplossing in een nieuwe 90 mm Petri schaaltje en bewaar ze op ijs.</li>
	<li>Met een waterdichte pen tekent u een rechte lijn aan het buitenoppervlak, midden in het onderste gedeelte van 6 35 mm Petri schalen.</li>
	<li>Plaats één 4% laaggegelende agarose/PBS 20 mL aliquot bij 37 °C gedurende 5 min. onmiddellijk daarna slecht 10 mL in 2 35 mm Petri schalen en insluiten de ontleed hersenen. Opmerking: De olfactorische bollen moeten naar beneden (onderkant van de Petri schaal) worden geconfronteerd. Embed 3-4 hersenen per Petri schaaltje, lijn ze uit in de eerder getekende rechte lijn. Laat 3 − 5 mm ruimte tussen elke twee hersenen.</li>
	<li>Herhaal de stappen 1,8 en 1,9 totdat alle ontleed hersenen zijn ingesloten.</li>
	<li>Plaats de ingesloten hersenen op 4 °C, om de agarose te stollen en snijd vervolgens de drie hersenen in een enkel blok met de juiste grootte en oriëntatie. Opmerking: Laat ongeveer 3 mm rond de randen van de hersen monsters. Verander de oriëntatie van de hersenen, met de olfactorische bollen bovenaan.</li>
	<li>Lijm het blok op het oppervlak van een microtoom basis en gebruik een chirurgisch mes dat helemaal door de bodem van het blok wordt gesneden, tussen elke twee hersenen, om 3 onafhankelijke blokken te maken (elk mini blok met één brein).</li>
	<li>Sectie de blokken, in ijskoude Krebs oplossing, in 250 μm dikke plakjes, met behulp van een vibrerende Blade microtoom.</li>
	<li>Met een gebogen platte micro-spatel verzamelen alleen de plakjes met de mediale of caudal ganglionaire eminences (MGE of CGE; Figuur 1) en individueel overbrengen naar filter membranen (13 μm diameter, 8,0 μm poriegrootte), zwevend op minimale essentiële medium (MEM, tabel 1) in polystyreen centrum-goed orgel cultuur gerechten (60 mm x 15 mm).</li>
	<li>Plaats de gerechten in een incubator van CO2 -weefselkweek, bij 37 °c, voor 1 uur, en bereid de focale elektroporation voor.</li>
</ol>2. acute hersen slice Electroporation
<ol><li>Voor het begin van de elektroporation procedure, bereid 50 mL van 1% agarose gel in een 100 mm Petri schaal. Laat de agarose-gel ongeveer 30 minuten stollen bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Bereid kleine agarose kolommen (1 mm diameter en 10 mm lengte), geperforeerd met een glazen pipet (225 mm lengte; 2 mL capaciteit) en breng ze over in ijskoude Krebs-oplossingen. Opmerking: Een rubberen druppelaar die geschikt is voor 2 mL pipetten is aan de pipet bevestigd en door erop te drukken kan de kolom van de glazen pipet worden losgelaten op de Krebs-oplossing.</li>
	<li>Met een chirurgische Blade, gesneden kleine agarose blokken van twee maten: een kleine die past op het oppervlak van de elektrode (zie hieronder) en een grotere, die zal worden gebruikt als basis voor het uitvoeren van de focal DNA-injecties in de hersenen segmenten. Breng ook de agarose-blokken in ijskoude Krebs-oplossing over.</li>
	<li>Bereid de set-up voor de focale injecties en de acute elektroporation (Figuur 2). Opmerking: Voor de injecties is de volgende apparatuur nodig: 1) een heldere veld dissectie stereo-microscoop, 2) een pneumatische Pico-Pump injector, 3) een micro manipulator, 4) een magnetische standaard, en 5) een stalen basisplaat. Voor de acute slice-elektroporation is de volgende apparatuur nodig: 1) een vierkante platina 10 mm Petri schaalelektrode, 2) een vierkante platina 10 mm afdek elektrode, 3) een micro manipulator, en 4) een elektroporator.</li>
	<li>
Focale DNA-injecties
	<ol>
<li>Bereid een DNA mengsel van expressie vectoren: pCAGGs-IRES-GFP (Control vector) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, bij een concentratie van 1 μg/μL voor elke vector en voeg snelle groene oplossing (voorraad 25 mg/mL) in een verdunning 1/10.</li>
		<li>Vul een getrokken glazen micropipet (0,5 mm binnendiameter en 1 mm buitendiameter) met 10 μL van het DNA-mengsel en Injecteer kleine hoeveelheden (op het 25-50 nL-bereik) in het geselecteerde gebied (MGE/CGE) van het segment (Figuur 1 en Figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Acute elektroporation Opmerking: De elektroporation moet onmiddellijk na de focale DNA-injectie worden uitgevoerd.<ol>
<li>Plaats het kleine agarose blok op de Petri schaalelektrode en bevestig de agarose-kolom aan de mobiele afdek elektrode met behulp van een platte micro spatel.</li>
		<li>Breng het segment met het ondersteunende membraan over op het agarose-blok en plaats de bovenste elektrode met de agarose-kolom bovenop het geselecteerde gebied (MGE/CGE) van het segment. Opmerking: laad spanningen van 125 V (twee pulsen van elk 5 MS, interval 500 MS) zullen een succesvolle elektroporation opleveren (Figuur 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na de elektroporation plaatst u het segment met het ondersteunende membraan in de schaal en zet u het gerecht over in een broedplaats van CO2 -weefselkweek, bij 37 °c.</li>
	<li>Wissel na 1 uur het MEM-medium in voor een basismedium dat geschikt is voor primaire neuronale culturen (neuron basismedium; Tabel 1) en incuberen de plakjes 's nachts, voor ongeveer 18-24 uur.</li>
</ol>3. bereiding van de cel-grafts
<ol><li>Controleer de efficiëntie van de elektroporation in alle segmenten. Selecteer alleen de segmenten waarin een aanvaardbaar aantal fluorescerende cellen wordt waargenomen (Figuur 3). Opmerking: Elektroporate ongeveer 30 segmenten/per experiment om het juiste aantal cellen voor enten te verwerven (zie hieronder).</li>
	<li>Ontleden de geselecteerde regio (MGE/CGE) uit elk segment en snijd het weefsel in kleine stukjes in ijskoude Krebs-oplossing, onder een fluorescerende dissectie-stereomicroscoop.</li>
	<li>Plaats ondertussen een tube van 1,5 mL met 900 μL neuron basismedium in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Breng de weefsel stukken met een P1000 micropipettor over in een buis van 1,5 mL met 500 μL L15/DNase medium, bereid door toevoeging van 100 μL 1 mg/mL DNase kolf in het medium DMEM/F12 in 900 μL L15 medium. Was de weefsel stukken door te tikken.</li>
	<li>Voeg 100 μL DNase (voorraad 1 mg/mL in het medium DMEM/F12) toe aan het neuron basismedium van 900 μL.</li>
	<li>Gooi het medium L15/DNase weg en regeer de weefsel stukken in 200 μL neuron Basic/DNase medium voorbereid in stap 3,5.</li>
	<li>Stel een P200 micropipettor in op 180 μL en verwijder mechanisch de weefsel stukken door ze zachtjes, 20-30 keer op en neer te pipetteren totdat er een gladde en "romige" suspensie wordt verkregen.</li>
	<li>Voeg 200 μL neuron Basic/DNase medium (eindtotaal volume 400 μL) toe en regenereren.</li>
	<li>Neem een hoeveelheid van 4 μL cellen, Verdun naar behoren en monteer op een hemocytometer.</li>
	<li>Onder een heldere veld Microscoop, Controleer de efficiëntie van de dissociatie en Tel het aantal cellen. Opmerking: Als de dissociatie succesvol is, zullen heldere (levend) enkelvoudige cellen en niet-celaggregaten worden nageleefd.</li>
	<li>Centrifugeer celsuspensie van stap 3,8, bij 1.000 rpm, bij RT, gedurende 5 minuten, en verwijder vervolgens het supernatant uit de buis en voeg het juiste L15/DNase-medium toe (meestal 5-7 μL), zodat de uiteindelijke concentratie van cellen 8 x 105-1,2 x 106 is cellen/μL. Opmerking: Tijdens de resuspensie is het uitermate belangrijk om luchtbellen te vermijden.</li>
	<li>Plaats de cel aliquot op ijs en hebben extra L15/DNase medium voor de injecties.</li>
</ol>4. intracraniële injecties
Opmerking: De volgende procedures vinden plaats in een procedure ruimte binnen de faciliteit voor huisdieren. Aangezien de cellen rechtstreeks aan de hersenen van pasgeboren pups worden geïnjecteerd zonder de hersenen bloot te stellen, worden aseptische condities aangehouden door de werkruimte te steriliseren met 70% EtOH-oplossing en geautoclaveerd glazen naalden te gebruiken. De volgende apparatuur is nodig voor de intracraniële injecties: 1) een heldere veld dissectie stereo-microscoop, 2) een micro-injector, en 3) een verwarmingspad voor muis herstel.
<ol><li>Maak een glazen naald door naalden aan te trekken volgens de aanbevelingen van de fabrikant. In dit protocol worden glazen naalden met een buitendiameter van 80 μm, een binnendiameter van 40 μm en een schuine kant van 30 ° gebruikt. Opmerking: Zoals hierboven vermeld, moeten naalden worden geautoclaveerd voor gebruik.</li>
	<li>Opvulling handmatig de naald met biologisch inerte olie met behulp van een 30 G, 2 inch naald en een spuit.</li>
	<li>Monteer en steek de naald in de injectoreenheid volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Bepaal de injectie-instellingen bij maximaal volume (69 nL) en een relatief langzame snelheid (23 nL/s).</li>
	<li>Maak de naald leeg totdat de zuiger volledig is verlengd.</li>
	<li>
Vul de naald.
	<ol>
<li>Snijd een klein stukje van een enten tape en plaats het onder een heldere veld dissectie stereo-microscoop. Met een P10 micro Pipet, Breng 5 μL van het monster (cel aliquot) op de tape, zodat een bolvormige druppel wordt gevormd.</li>
		<li>Plaats de punt van de naald in het monster en vul de naald (de zuiger trekt intrekken en tekent het monster ermee). Opmerking: Aangezien het monster vrij visceus moet zijn, vult u de naald in kleine stapjes, zodat het monster zal worden geëequilibreer en in een langzame snelheid waardoor bellen niet ontstaat. Het monster moet glad en homogeen zijn binnen de naald. Als het monster te visceus is en het niet mogelijk is om de naald te vullen, voeg dan zoveel L15/DNase medium toe als nodig is om de juiste viscositeit te verkrijgen. Niettemin, dit zal de concentratie van het monster te veranderen, en idealiter moet worden vermeden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdoving nieuwe geboren pups (postnatale dag 0-2 [P0-P2]) op ijs voor 2-5 min. Opmerking: Zorg ervoor dat het pup niet beweegt.</li>
	<li>Plaats het verdoofd pup onder het heldere veld dissectie stereo-microscoop.</li>
	<li>Voer 3-4 injecties van 69 nL per halfrond uit. Opmerking: De injectieplaatsen bevinden zich ongeveer 1 mm lateraal tot de middellijn en tussen 1 mm caudal tot bregma en 1 mm rostrale migratoire naar de interaurale lijn. De punt van de naald moet ongeveer 1 mm diep op het Piale oppervlak worden geplaatst. Na elke injectie wordt de naald ongeveer 30 sec. en in periodes teruggetrokken.</li>
	<li>Onmiddellijk na de injecties, plaats de pup op een verwarmingskussen met de verwarming in de laagste stand (37 ° c). Wanneer de pup herstelt overbrengen naar de kooi met zijn moeder. Opmerking: Verlaat nooit de moeder zonder pups in de kooi. De hele procedure (van het verwijderen van de pup van zijn littermates, totdat het wordt teruggegeven) moet minder dan 10 minuten duren.</li>
</ol>5. Clozapine-N-oxide injecties
<ol><li>Bereid de DREADD ligand, CNO Stock Solution door 1 mg CNO in 50 μL dimethylsulfoxide (DMSO) te verdunen totdat de oplossing doorschijnend is. Top-tot 10 mL met zoutoplossing zodat de uiteindelijke concentratie van CNO is 0,1 mg/mL. Opmerking: DMSO is giftig. Vermijd het gebruik ervan tot een concentratie hoger dan 0,1%. Gebruik als een controle een zoutoplossing met dezelfde DMSO-concentratie als de CNO bevattende oplossing.</li>
	<li>Vanaf postnatale dag 14 en voor 3 constitutief dagen (P14-P16), in elke muis voeren twee intraperitoneale (I.P.) injecties van CNO (CNO-concentratie: 1 mg/kg) of 0,05% DMSO in zoutoplossing, per dag, 12 h uit elkaar.</li>
	<li>Voer op de laatste dag (P17) een enkelvoudige injectie uit en offer muizen op cervicale dislocatie binnen een tijdsperiode van 30 min-1 uur.</li>
</ol>

<ol><li>Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+dysfunction+in+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interneuron dysfunction in psychiatric disorders.</a> Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).</li>
<li>Glausier, J. R., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+schizophrenia%3A+Where+we+stand+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Research%22%5BJournal%5D)">GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go.</a> Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).</li>
<li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%22where+the+wild+things+are%22%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are".</a> Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Wamsley, B., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+activity-dependent+mechanisms+underlying+interneuron+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity.</a> Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).</li>
<li>Denaxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation-promoting+activity+of+SATB1+in+MGE-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons.</a> Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proccedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344 (6180), 1240622(2014).</li>
<li>Vogt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-mediated+Labeling+and+Transplantation+of+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Cells+for+In+Vivo+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52740(2015).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li>
<li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+%28designer+receptors+exclusively+activated+by+designer+drugs%29%3A+chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).</li>
<li>Denaxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Apoptosis+Controls+Inhibitory+Interneuron+Number+in+the+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex.</a> Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).</li>
<li>Quatrocolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homochronic+Transplatation+of+Interneuron+Precursors+into+Early+Postnatal+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57723(2018).</li>
<li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+determined+cell+death+of+developning+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons.</a> Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een breed toegankelijke methodologie voor het genetisch wijzigen van de activiteit van CI-precursoren om de impact van intrinsieke activiteit op de CI-rijping te bestuderen, en/of het effect van gemoduleerde CIs op de assemblage/functie van de geïntegreerde corticale Circuits.
In het verleden hadden verschillende laboratoria, waaronder de onze, in utero-elektroporation experimenten gepresteerd om de projectie neuronen genetisch te wijzigen.6. Echter, in utero electroporatie in ganglionaire eminenties die CI-voorlopercellen omvatten is zeer moeilijk, als gevolg van elektrische geleiding pad problemen. Om dit probleem op te lossen, een klein aantal Labs uitvoeren echografie geleide injecties gevolgd door elektroporation, dat is een veeleisende techniek die dure apparatuur vereist. Dit protocol biedt een alternatief voor deze methodologieën die voor de meerderheid van de wetenschappelijke gemeenschap toegankelijk zijn.
Een van de meest uitdagende aspecten van dit protocol is het maximaliseren van het aantal cellen dat overleven in de host cortex tot volwassen stadia, wanneer fenotypische analyse wordt meestal uitgevoerd (zeer afhankelijk van het experiment ontwerp, maar meestal ouder dan P17). Er zijn drie belangrijke stappen die de onderzoeker moet letten: (1) de efficiëntie van de elektroporation. Dit kan gemaximaliseerd worden door de zuiverheid van DNA plasmiden te waarborgen. Voor deze procedure moeten alleen hoogwaardige DNA-plasmiden (een A260/a280 ratio van 1,9-2,0) worden gebruikt. We verkrijgen dergelijke hoogwaardige DNA-preparaten door het gebruik van cesium chloride-DNA-zuivering. Een andere cruciale factor is de promotor die de uitdrukking van het belang van het gen stimuleert. We ontdekten dat de pCAGGs vector, die bestaat uit de Chicken b-actin Promoter, extreem krachtig is en de elektroporation efficiency drastisch kan verhogen. 2. het aantal beginnende donor embryo's. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een groot aantal (12-16) embryo's van dezelfde fase worden geëvacueerd. Dit aantal kan worden verhoogd als meer experimenteurs embryo dissecties uitvoeren en samen snijden, omdat het belangrijk is dat embryonale corticale schijfjes zo snel mogelijk worden verkregen, geëvacueerd en naar de incubator worden overgebracht. (3) het is belangrijk om ervoor te zorgen dat een groot aantal cellen in elk pup wordt geïnjecteerd om een hoge kans op getransplanteerde celoverleving tot volwassen stadia te garanderen. Bovendien zal dit de kans op succesvolle transplantaties drastisch verbeteren, omdat celpreparaten met lage dichtheid resulteren in ongelijke menging van de cellen met het medium, wat significante variabiliteit zal opleveren in de getransplanteerde hersenen15 .
Het hier beschreven protocol was op maat gemaakt voor het onderzoeken van de rol van activiteit bij het reguleren van CI-overleving op een cel-autonome manier. De P14-P17 tijdvenster voor het uitvoeren van de CNO injecties werd specifiek gekozen volgens gepubliceerde gegevens, waaruit blijkt dat de piek van getransplanteerde CI progenitors celdood optreedt tijdens deze periode16. Daarom is dit tijdsbestek of de frequentie van CNO-injecties mogelijk niet van toepassing op andere celtypen of hersengebieden, en moet de onderzoeker deze parameters aanpassen volgens de specifieke experimentele doeleinden. Tot slot, de hier beschreven methodologie voor de intracraniële injecties van CIs is alleen haalbaar voor P0-P5 pups (afhankelijk van de achtergrond van de muis lijn). In principe, elke injecties over P5 zal vereisen dunner of verwijderen van de schedel15.
Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de mogelijkheid om nieuwe genetisch gecodeerde hulpmiddelen te gebruiken om de activiteit van CIs te visualiseren of te manipuleren tijdens verschillende fasen van differentiatie terwijl ze integreren in een ontwikkelend netwerk. Met het tempo van de ontdekking van nieuwe genetisch gecodeerde voltage-en calcium sensoren, evenals nieuwe chemogenetische en optogenetische hulpmiddelen, stelt dit protocol onderzoekers in staat om ze binnen enkele weken na de introductie in plasmide repositories te gebruiken, zoals Addgene.

De functie van neuronale netwerken berust op het bestaan van een evenwichtige aanvulling van excitatory projectie neuronen en remmende interneuronen. Hoewel corticale interneuronen (CIS) slechts 20% van alle neuronen in de zoogdier cortices vertegenwoordigen, worden tekorten in hun aantal of functie verondersteld een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van neuroontwikkelingsstoornissen1,2. De studie van CI-ontwikkeling is een uitdaging omdat CIs worden gegenereerd in voorbijgaande embryonale structuren die moeilijk toegankelijk zijn, en ze volgen een lange tangentiële migratie voordat ze het pallium bereiken en hun volwassen anatomische en fysiologische eigenschappen3. Zowel genetische als milieu mechanismen zijn gekend die CI-ontwikkeling4reguleren, maar het is moeilijk gebleken om de relatieve bijdrage van meerdere factoren te bestuderen.
Veel inzichten in CI-ontwikkeling werden verkregen met behulp van in vitro kweeksystemen na isolatie van voorlopercellen uit de ganglionische eminenties5,6. Een van de grote voordelen van deze methoden is het potentieel om de geïsoleerde voor ouders te labelen en genetisch te modificeren en hun differentiatie in detail te volgen, om celautonome veranderingen te detecteren. Echter, deze methoden zijn niet in staat om informatie te bieden over de interacties tussen het ontwikkelen van interneuronen en een actief netwerk. We hebben deze protocollen aangepast door transplantatie van de gemodificeerde precursoren in de vroege postnatale cortex. Interneuron voorlopercellen geïsoleerd van embryonale ganglionische eminenties kunnen overleven, dispergeren en integreren in het hostnetwerk bij transplantatie in de cortex7,8. Deze methode is gebruikt om de ernst van epileptische aanvallen in genetische Muismodellen te verminderen, en is voorgesteld als een mogelijke nieuwe therapie voor verschillende neuroontwikkelingsstoornissen9,10. Een eerder protocol beschrijft een procedure om deze precursoren te transfusie met virale vectoren voorafgaand aan transplantaties11. Het protocol dat we hier beschrijven, maakt ook de genetische modificatie van interneuronen mogelijk, maar vereist niet de creatie van een virale vector, die alleen een plasmide DNA nodig heeft, wat de flexibiliteit aanzienlijk vergroot. Sommige studies rapporteerden succes bij het gebruik in utero elektroporation voor het genetisch wijzigen van Interneuron voorlopercellen in de caudal ganglionaire eminences (CGE)12, maar deze methode heeft zeer moeilijk te reproduceren bewezen.
In de sectie representatieve resultaten illustreren we het gebruik van deze methode om Designer receptoren te uiten die uitsluitend worden geactiveerd door designer drugs (DREADDs13) in de getransplanteerde CIS, een methode die we gebruikten in een recente publicatie14. We uitgedrukt hM3D (GQ), een Engineered receptor op basis van de menselijke cholinerge receptor CHRM3, die geen invloed op de neuronale functie tenzij het bindt zijn specifieke ligand Clozapine-N-oxide (CNO). CNO Administration activeert selectief activering van hM3D (GQ) uitdrukken van cellen. We gebruikten deze methode om te laten zien dat cel autonome en voorbijgaande depolarisatie voldoende is om te voorkomen dat apoptosis van CIs tijdens de ontwikkeling14. In combinatie met verschillende genetisch gecodeerde gereedschappen, dit protocol heeft het potentieel om up-of down-reguleren van genexpressie, en visualiseren of manipuleren celactiviteit tijdens verschillende stadia van Interneuron differentiatie.

<table><tbody><tr><td>Medium/Supplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>175040-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>SIGMA</td><td>DN15-100MG</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>100x Glutamine</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha, GlutaMAX</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>21103-049</td><td>Neuron basismedium</td></tr><tr><td>100x P/S</td><td>GIBCO (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BTX</td><td>ECM 830 generator</td><td></td></tr><tr><td>Injector voor acute slice elektroporatie&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Microinjector</td><td></td></tr><tr><td>Injector voor celtransplantatie (I)</td><td>Visual Sonics</td><td>Vevo Injector System</td><td></td></tr><tr><td>Injector voor celtransplantatie (II)</td><td>WPI</td><td>NANOLITER2010</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische standaard</td><td>WPI</td><td>M10L Magnetic Stand</td><td></td></tr><tr><td>Kite Manual Micromanipulator</td><td>WPI</td><td>KITE-M3-R</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Electrode (I)</td><td>Protech International Inc.</td><td>CUY-700-1</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Electrode (II)</td><td>Protech International Inc.</td><td>CUY-700-2</td><td></td></tr><tr><td>Stalen basisplaat</td><td>WPI</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Ander materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillairen voor elektroporatie</td><td>VWR</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glazen capillairen voor celtransplantatie</td><td>Visual Sonics</td><td>geleverd door&nbsp; Visual Sonics</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore 8 &micro;m whatman membraan</td><td>SLS</td><td>110414</td><td></td></tr><tr><td>Organenweefsel kweekschalen</td><td>BD Biosciences (Falcon)</td><td>353037</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantatie van chemogenetisch gemanipuleerde corticale interneuron progenitors in vroege postnatale muizenhersenen

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronale ontwikkeling wordt gereguleerd door een complexe combinatie van omgevings-en genetische factoren. Beoordeling van de relatieve bijdrage van elk onderdeel is een gecompliceerde taak, die bijzonder moeilijk is met betrekking tot de ontwikkeling van γ-aminoboterzuur (GABA) erge corticale interneuronen (CIs). CIs zijn de belangrijkste remmende neuronen in de hersenschors, en ze spelen belangrijke rollen in neuronale netwerken, door het reguleren van zowel de activiteit van individuele piramidale neuronen, evenals de oscillatoire gedrag van neuronale ensembles. Ze worden gegenereerd in voorbijgaande embryonale structuren (mediale en caudale ganglionische eminences-MGE en CGE) die zeer moeilijk zijn om efficiënt te targeten met behulp van utero-elektroporatie benaderingen. Interneuron voorlopercellen migreren lange afstanden bij normale embryonale ontwikkeling, voordat ze in het corticale circuit integreren. Dit opmerkelijke vermogen om te dispergeren en te integreren in een ontwikkelend netwerk kan worden gekaapt door het transplanteren van embryonale Interneuron precursoren in vroege postnatale gastheer cortices. Hier presenteren we een protocol dat genetische modificatie van embryonale Interneuron voorlopercellen mogelijk maakt met focale ex vivo elektroporation. Deze engineered Interneuron precursoren worden vervolgens getransplanteerd in vroege postnatale gastheer cortices, waar ze zullen rijpen in gemakkelijk identificeerbare CIs. Dit protocol maakt het gebruik van meerdere genetisch gecodeerde hulpmiddelen mogelijk, of de mogelijkheid om de expressie van specifieke genen in Interneuron voorlopercellen te reguleren, om de impact van genetische of omgevingsvariabelen op de rijping te onderzoeken en integratie van CIs.

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, hebben we getest of het overleven van corticale interneuronen tijdens vroege postnatale stadia wordt gereguleerd door activiteit op een autonome manier van de cel. We voerden 3 hersen slice elektroporation experimenten uit (12-16 embryo's [E 14.5 embryo's] per experiment) met de pCAGGs-IRES-GFP (Control) en pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP-expressie vectoren, met een concentratie van 1 μg/μL voor elke constructie. In onze elektroporation experimenten, slechts een fractie (ongeveer 50%; Figuur 3) van de GFP+ neuronen, co-uitgedrukt HM3D (GQ) (RFP+) en daarom diende de GFP+RFP- populatie als een interne controle voor het effect van dreadd liganden. De corticale embryonale interneuronen werden mechanisch losgekoppeld en de resulterende celsuspensie (8 x 105 cellen/μL) geënt in de cortex van P0-P1 wild type muizen. We hadden 6 injecties per hersenen uitgevoerd. In elk experiment werden minimaal 6 nieuw geboren pups geïnjecteerd. De toediening van CNO heeft de activiteit van getransfunteerde RFP+ -cellen selectief verhoogd, zoals blijkt uit de uitdrukking van de activiteitsafhankelijke proteïne-cfo's (Figuur 4). CNO behandeling volgens het beschreven Protocol (beheer tweemaal daags P14-P17) resulteerde in een toename van het aandeel van GFP+RFP+ ten opzichte van GFP+RFP- cellen, in vergelijking met voertuig (0,5% DMSO in Saline) worden toegediend (Figuur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig1.jpg"> Figuur 1: representatieve telencephalische schijfjes die worden gebruikt voor acute elektroporation experimenten. (a-C) Telencephalic plakjes verkregen op drie verschillende sequentiële rostro-caudal niveaus, gekleurd met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI). LGE: laterale ganglionische eminentie; MGE: mediale ganglionische eminentie; CGE: caudal ganglionaire Eminence. Schaal staven = 200 μm. De gele sterretjes geven de elektroporation plaats in elk segment aan. De witte lijn markeert de rand van de ganglionische eminentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig2.jpg"> Figuur 2: schematische weergave van de experimentele workflow. A) muizen hersen schijfjes worden elektroporated met geschikte constructies, en (B) na 12 h gemodificeerde corticale Interneuron (CI) precursoren zijn geïsoleerd en (C) getransplanteerd in het pallium van pasgeboren muis pups (P0 − P2). Om de activiteit van onvolgroeide CIs te wijzigen, werden P14 pups die celtransplantaties hadden ontvangen, met CNO of Vehicle geïnjecteerd voor vier constitutieve dagen volgens het gepresenteerde protocol. (A ') Foto van de acute muis brain slice electroporatie set-up. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig3.jpg"> Figuur 3: Representatieve succesvolle acute slice electroporatie experiment. A) representatieve coronale sectie van een e 14.5 embryo hersen transfusie in het CGE met zowel PCAGGS-IRES-GFP (GFP) en Pcaggs-HM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmiden en gekweekt voor 12 uur. De sectie is immunogekleurd voor GFP (A, B, C) en RFP (A, B, D). Het boxed gebied in deelvenster A wordt vergroot om de uitdrukking van zowel fluorescerende verslaggevers (B), GFP (C) en RFP only (D) weer te geven. De witte lijn markeert de rand van de ganglionische eminentie. B-D: zelfde foto, verschillende kanalen of combinatie van de twee verschillende kanalen. Schaal staven = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Dit cijfer is gewijzigd van Denaxa et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig4.jpg"> Figuur 4: cel autonome toename van de activiteit van M3D (GQ)-het uitdrukken van getransplanteerde CIS bij toediening van CNO. (a-D) Representatieve confocale beelden van een coronale sectie van een P17 Mouse getransplanteerd op P1 met CI precursoren, getransffecteerd met zowel pcaggs-IRES-GFP (GFP) en pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmiden en behandeld met CNO. De sectie is immunogekleurd voor GFP (A), RFP (B) en CFOs (C). D) het gecombineerde beeld van A, B en C immunofluorescentie (Combo). Merk op dat alleen CIs die zowel plasmiden (witte pijlen in A-D) gezamenlijk uitdrukken, cFos+ zijn in vergelijking met CIS die alleen de Control-GFP plasmide (gele pijlen in a-d) uitdrukken. E) kwantificering van CFOs+RFP+ cellen gevonden in het pallium van P17 muizen getransplanteerd op P1 (genormaliseerd naar de totale RFP+ populatie) en behandeld met voertuig of CNO (N = 2). A-D: dezelfde foto, verschillende kanalen of een combinatie van de drie verschillende kanalen. Schaal staven = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59568/59568fig5.jpg"> Figuur 5: Cel autonome toename van de activiteit van CIS verbetert de overleving . (a-D) Representatieve confocale beelden van de Somatosensorische cortex coronale schijfjes van de P17 muizen die bij P0-P2 met CI-precursoren zijn getransplanteerd met zowel pcaggs-IRES-GFP (GFP) als pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmiden en behandeld met voertuig (A-B) (C-D). (E) kwantificering van RFP+ -cellen in het voor brein van de P17-muizen die bij P0-P2 zijn getransplanteerd (genormaliseerd naar de totale GFP+ -populatie). RFP+(voertuig) = 47% ± 3%, cno = 61% ± 3%, p = 0,01, student gekoppelde Sample t-test, n = 3 voertuig en 3 CNO, minimaal 150 cellen geteld per brein. A en B: zelfde foto, verschillende kanalen. C en D: zelfde foto, verschillende kanalen. Schaal staven = 50 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Denaxa et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59568/59568fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59568/59568table1.jpg"> Tabel 1: aanvullende informatie over de media die in dit protocol worden gebruikt.

Hier presenteren we een protocol, ontworpen om gebruik te maken van chemogenetische hulpmiddelen om de activiteit van corticale Interneuron voorlopercellen getransplanteerd in de cortex van vroege postnatale muizen te manipuleren.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

Met deze methode kunnen we de effecten van intrinsieke activiteit op de rijping van corticale interneuronvoorlopers bestuderen. Deze techniek biedt een efficiënte manier voor het richten en manipuleren van de cellulaire eigenschappen van corticale interneuron voorlopers die toegankelijk is voor de meerderheid van de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol omvat de zorgvuldige behandeling van monsters en apparatuur, en het kan het best worden gewaardeerd door visuele demonstratie.Met behulp van een waterdichte pen, trek een rechte lijn over het midden van het onderste deel van het onderste oppervlak van zes 35-millimeter petrischaaltjes. Voeg 10 milliliter vloeibare 4% lage geleling agarose in PBS in twee van de 35-millimeter petrischaaltjes en insluiten drie tot vier ontleed hersenen in de agarose met de reukbollen naar beneden per schotel over de rechte lijn, waardoor drie tot vijf millimeter ruimte tussen elk monster. Wanneer alle hersenen zijn ingebed, plaats de gerechten op vier graden Celsius om de agarose te stollen en snijden de drie hersenen in een enkel blok van agarose, waardoor ongeveer drie millimeter gel rond de randen van de monsters.Lijm het blok op het oppervlak van een microtome basis en gebruik een chirurgisch mes om helemaal door de bodem van het blok tussen elk weefselmonster te snijden om drie onafhankelijke blokken te verkrijgen. Gebruik vervolgens een trillende blade microtome om de blokken in ijskoude Krebs-oplossing te delen in 250-micrometer dikke plakjes, met behulp van een gebogen platte microspatula om alleen de plakjes met de mediale of caudale ganglionic eminenties te verzamelen. Plaats vervolgens elke sectie op individuele 13-micrometer diameter, acht-micrometer porie grootte filtermembranen drijvend op minimale essentiële medium in individuele polystyreen centrum goed orgaancultuur gerechten.Wanneer alle secties zijn verkregen, plaats de gerechten in een koolstofdioxide weefsel kweek incubator op 37 graden Celsius voor een uur. Vóór de brandpunts-DNA-injectie, plaats een millimeter diameter, 10-millimeter lange agarose kolommen geponst met een glas 225-millimeter lange, twee-milliliter capaciteit glazen pipet in ijskoude Krebs oplossing. Met behulp van een chirurgisch mes, snijd een kleiner stuk agarose te passen op het oppervlak van de elektroporatie elektrode en een groter stuk te gebruiken als basis voor de focale DNA-injecties.Plaats vervolgens de agarose blokken in ijskoude Krebs oplossing. Meng voor de injectie het expressie- en controlevector-DNA met een concentratie van één microgram per microliter voor elke vector en voeg een snelle groene voorraadoplossing toe bij een één tot tiende verdunning. Vul een getrokken 0,5-millimeter binnendiameter, een milliliter glazen micropipet met 10 microliter van het DNA-mengsel en laad de micropipet in een pneumatische PicoPump-injector.Plaats het grotere blok van agarose onder een stereomicroscoop en plaats het te injecteren plak op het stuk agarose. Injecteer vervolgens 25 tot 50 nanolitervolumes in de geselecteerde mediale ganglionic of caudal ganglionic eminence regio van de slice. Direct na de injectie plaatst u het kleine agaroseblok op de petrischaalelektrode en gebruikt u een platte microspatula om de agarosekolom aan de mobiele afdekkenelektrode te bevestigen.Breng het geïnjecteerde plak met het ondersteunende membraan over op het agaroseblok en plaats de bovenste elektrode met de agarosekolom bovenop het geselecteerde gebied van de slice. Vervolgens elektroporate de regio met twee vijf milliseconden pulsen van 125 volt, 500 milliseconden uit elkaar. Na de elektroporatie, plaats het plakje met zijn ondersteunende membraan terug in zijn holding schotel en breng de schotel terug naar de weefselkweek incubator.Na een uur, vervang het minimale essentiële medium met een basismedium geschikt voor primaire neuronale culturen en de plakjes 's nachts terug te brengen naar de incubator. In deze elektroporatie-experimenten, ongeveer 50% van de GFP positieve neuronen mede-uitgedrukt de RFP positieve geïnjecteerd eiwit en daarom, de GFP positieve RFP negatieve bevolking diende als een interne controle voor het effect van de geïnjecteerde DNA liganden. Clozapine en oxide toediening verhoogt selectief de activiteit van transfected RFP positieve cellen, zoals blijkt uit de expressie van het activiteitsafhankelijke eiwit, c-Fos, in deze pasgeboren coronale weefselsecties.Clozapine- en oxidebehandeling resulteert ook in een toename van het aandeel GFP-positieve RFP-positieve cellen ten opzichte van het aantal GFP-positieve RFP-negatieve cellen in vergelijking met door voertuigen toegediende nestgenoten. Deze procedure kan worden gebruikt om de effecten van activiteit-gemoduleerde geënte geïnterneerde geïnterneerde internurons op de plasticiteit van de bloedsomloop en de hersenfunctie van de gastheer te bestuderen.

transplantation-chemogenetically-engineered-cortical-interneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Weber, R. Z., et al. Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic transplantation of genetically modified human neural progenitor cells (NPCs) into the mouse brain. Researchers inject NPCs expressing luciferase and fluorescent proteins, enabling in vivo bioluminescence imaging and post-mortem fluorescence microscopy to study cell survival, migration, and...

Transplantation of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain

Source: Quattrocolo, G., et al. Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the transplantation of interneuron precursor cells into the neonatal mouse brain using either a homotopic or heterotopic approach. The procedure involves securing an anesthetized recipient pup, identifying the target brain region, and injecting a suspension of precursor cells derived from a donor pup at the same developmental stage.

Transplantation of Interneuron Precursor Cells into the Brain of a Mouse Pup

Source: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic injection of human-derived interneuron precursor cells into the hippocampus of a genetically modified mouse pup with reduced inhibitory interneurons, aiming to restore excitatory-inhibitory balance.

Transplantation of Human-Derived Interneuron Precursor Cells into the Mouse Pup Hippocampus

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Uitdagende jonge neuronen in nieuwe hersengebieden kan het onthullen van belangrijke inzichten in hoe het milieu neuronale lot en rijping beeldhouwt. Dit protocol beschrijft een procedure om de oogst interneuron precursoren van specifieke hersengebieden en verplant ze ofwel homotopically of heterotopically in de hersenen van postnatale pups.

Homochronic transplantatie van Interneuron precursoren in vroege postnatale muis hersenen

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Dit protocol demonstreert methodologieën voor een muismodel van open-schedel traumatisch hersenletsel en transplantatie van gekweekte menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cellen in de wond site. Gedrags-en histologische tests van uitkomsten van deze procedures worden ook in het kort beschreven.

Gecontroleerde corticale impact model van muis hersenletsel met therapeutische transplantatie van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neurale cellen

We beschrijven de intraparenchymale transplantatie van menselijke neurale voorlopercellen getransduceerd met een dual reporter vector die luciferase-groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen van muizen tot expressie brengt. Na transplantatie wordt het luciferasesignaal herhaaldelijk gemeten met behulp van in vivo bioluminescentie en GFP-tot expressie brengende getransplanteerde cellen geïdentificeerd in hersensecties met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Intracerebrale transplantatie en in vivo bioluminescentie tracking van menselijke neurale voorlopercellen in de hersenen van de muis

Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide GABAerge neuronen gegenereerd door neuronale programmering zou een potentiële behandelingsbenadering kunnen zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Dit protocol beschrijft de generatie en transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronale voorlopers in de hersenen van neonatale muizen, waardoor langdurig onderzoek van geënte neuronen en evaluatie van hun therapeutisch potentieel mogelijk is.

Transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronen in de vroege postnatale muis hippocampus om neurologische ontwikkelingsstoornissen te verminderen

Leer hoe u chemogenetisch gemanipuleerde corticale interneuron-progenitors transplanteert in vroege postnatale muizenhersenen. Deze methode maakt onderzoek naar de effecten van intrinsieke activiteit op de rijping van interneuron-voorlopers mogelijk.

Transplantatie van Chemogenetisch gemanipuleerde corticale Interneuron progenitors in vroege postnatale Muizenhersenen

Meer video's verkennen