High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

De NanoDispenser gebaseerde transfectie protocol op ontwikkeld om te beschrijven in deze video vertegenwoordigt de eerste gebruiksvriendelijke, high-throughput transfection methode waardoor zelfs beginners in het veld om succesvol te zijn. Dit is gemakkelijk op high-throughput techniek maakt transfectie van de cel met 384 onafhankelijke conditie. Vanaf nu, de methode is lage kosten als gevolg van de nano volume van reagens nodig.

Om de beste transfectieparameters voor het hele celtype te definiëren, raden we aan de bron-DNA-concentratie constant te houden en verschillende hoeveelheden transfected DNA, transfectiereagens en het aantal cellen te gebruiken. Voor het afgeven van de 40 microliter celsuspensie, monteer een 10 microliter cassette op de peristaltische vloeistof handler apparaat, en bereiden een geschikt programma. Ten eerste, pas de flow rate parameter aan laag om cellen af te zien met een lage snelheid om te voorkomen dat het bevorderen van potentiële schade aan de cellen door pure stress en hoge impact op de bodem van de putten.

Stel vervolgens de dispensatiehoogte aan op 11,43 millimeter. De hoogte moet hoog genoeg zijn om de celimpact op de bodem van de putten tijdens het doseerproces te verlagen, maar laag genoeg om het vasthouden van de druppels op de doseerkop te voorkomen. Stel vervolgens de duidelijke hoogte van de plaat aan op 16 millimeter om vrije verplaatsing van de doseerkop over de plaat mogelijk te maken na het uitdelen van elke rij.

Controleer visueel de juiste instellingen van de peristaltische vloeistofgeleider hoofdhoogte. Zorg ervoor dat er tijdens het uitdelen geen druppels op de doseerpunten worden bewaard. Controleer ook of het hoofd hoog genoeg is om verplaatsing van het hoofd na het uitdelen van elke rij mogelijk te maken.

Om picklists te genereren om de ADE-dispensatie aan te drijven, werd een gebruiksvriendelijke spreadsheetmacro ontwikkeld om DNA-bedragen te beheren en tot vier plasmiden te mengen in een 384 putplaatformaat. Optimale volumes worden vooraf ingevuld in sommige cellen van de spreadsheet, maar kunnen worden gewijzigd. In de roze velden, de transfectie reagens, of TR mengsel waarde, is ingesteld op 500 nanoliter.

De minimale volumewaarde in de bronplaatputten is ingesteld op vier microliters en het maximale volume in de bronplaatputten op 11,25 microliter. Voer 100 nanogram per microliter DNA-startconcentraties in de blauwe velden die overeenkomen met het onderliggende DNA. Voer vervolgens de gewenste DNA-hoeveelheid in de grijze en groene velden die overeenkomen met de 384 putten van de plaat.

Voer de hoeveelheden en plasmidnamen in en zorg ervoor dat dezelfde spelling wordt gebruikt als dezelfde plasmide in verschillende putten moet worden doorgetransfecteerd. Klik op picklists genereren om de ingevoerde waarden te verifiëren en corrigeer de op oranje gevulde cellen desgevraagd fouten of volumes die niet door de NanoDispenser kunnen worden verwerkt. Als er geen wordt gedetecteerd, genereert de macro de 384 putdoserende handleiding, het DNA-picklistbestand en het TR-picklistbestand uit gegevens die op de bijbehorende bladen zijn verzameld.

Druk de sjabloon af vanaf het bronplaatblad om de te vullen putten te visualiseren voordat u deze uitdeelt. Plasmid namen en minimale vulvolumes worden aangegeven. Transfectie reagens mengsel volumes die zullen worden gevuld in de volgende putten, worden aangegeven als TR en gemarkeerd in het groen.

Om de DNA-bronplaat voor te bereiden, verdun de opgeslagen DNA-plasmid tot 100 nanogram per microliter met gedestilleerd water. Kalibreer nu het 384 putrooster naar de plaatafmetingen. Open de 384 Well Pipetting Guide Application op een tablet.

Plaats de bronplaats op het raster op het onderste scherm. Klik in het kalibratiemenu linksboven op plus of min om de grootte van het raster en de putten te verbeteren of te verkleinen om de groene putten aan te passen aan de vier hoekputten van de plaat. Monteer met dubbelzijdige tape de 3D-geprinte plaatadapter op het scherm om bewegingen van de bronplaat te voorkomen tijdens het uitdelen.

Verplaats indien nodig het gekalibreerde raster met behulp van de rotatiepijlen en omhoog, omlaag, rechts, linkerknoppen om het raster aan te passen aan de plaatpositie. Zodra het rooster en de putmaten goed zijn gekalibreerd en geplaatst, tikt u de vergrendelingskalibratiebox aan. Klik op het bestand en open de 384-Wells-Pipetting-Guide.

csv-bestand. Volg de scherminstructies om het aangegeven volume plasmide bij de opgegeven concentratie handmatig af te geven in de wit die goed is gemarkeerd en die overeenkomt met de juiste doelbestemming van de verwachte plaat. Gebruik min of meer pijlen om terug te gaan of verder in het DNA-doseerproces.

Stop met het afgeven bij het bereiken van de eerste transfection reagensoplossing om te laden. Zodra de DNA-dispensaties klaar zijn, verwijdert u de bronplaat van de adapter. Als er meerdere bronplaten moeten worden gevuld, plaatst u een nieuwe bronplaat op de adapter en volgt u de doseerinstructies.

Centrifugeren de MET DNA gevulde bronplaten om een goede vloeistofniveleer te garanderen en bellen te verwijderen die leiden tot onnauwkeurigheid in de ADE-basisoverdrachten. Voer nu een enquête uit om de handmatig afgegeven volumes te beheren. Voer op de NanoDispenser PC het NanoDispenser-programma uit.

Ga naar het diagnosetabblad, vink de bronplaat uitbox aan, laad de bronplaat op de plaathouder en vink aan om de plaat in te voeren. Selecteer desgevraagd 384LDV_AQ_B2 om de NanoDispenser in te stellen op de waterige bufferdisspensatiemodus en druk op OK. Selecteer enquête in het diverse menu. En klik op de lancering.

Selecteer de vooraf gevulde putten om te analyseren en klik op de knop Gaan. Controleer of de gemeten volumes overeenkomen met de verwachte en zorg ervoor dat er geen putten zijn geladen met volumes van meer dan 12 microliter. Prime de slang met serum vrij medium door het vullen van een nieuw steriel vat met 10 milliliter voorverwarmd serum vrij medium en onderdompeling van de buis organisator in.

Druk ongeveer 10 seconden op de priemknop van de peristaltische vloeistofgeleider. Zorg ervoor dat de tip niet verstopt is door de stroom van de doseerkop visueel te inspecteren. Plaats een steriele 384 put cultuur plaat op de peristaltische vloeistof handler plaat drager, en verwijder het deksel.

Voer de pre-gekalibreerde programma om een microliter af te geven in elke put van de 384 put plaat. De doseertijd bedraagt ongeveer acht seconden. Vervang dan het deksel van de 384 putplaat.

Voer de picklistsoftware uit om ADE-gedreven DNA-uitdelen in te stellen. Stel de 384 putten afkomstig naar 384LDV. Stel het apparaat in op de waterige bufferdoseringsmodus door 384LDV_AQ_B2 te selecteren.

En de soorten bestemmingsplaat Greiner_384PS_781096. Geoptimaliseerde overdrachtdoorvoer ongedaan maken. Selecteer het tabblad Lijst selecteren.

Klik op importeren. En selecteer het DNA_Picklist_CSV bestand. Klik vervolgens op afspelen en sla het protocol op.

Klik op simuleren om een simulatie van de programmasedaties uit te voeren om ervoor te zorgen dat de picklist overeenkomt met het verwachte experimentele ontwerp. Klik op de run-knop en start het doseerprogramma. Voeg desgevraagd de gevraagde bronplaat in.

En dan de bestemmingsplaat in de NanoDispenser. Voor het opzetten van de transfectie reagent dispensatie, werken in een biosafety kabinet te verdunnen lipopolyplex transfectie reagens in serum vrij medium tot een een x laatste concentratie en vortex de buis. Onmiddellijk afzien van de TR mix volgens de vooraf gedefinieerde bronplaat verwaardigd door de macro en met behulp van de pre-gekalibreerde 384 goed pipetting gids applicatie.

Na de TR-afgifte voert u een enquête uit om de geladen TR-volumes te controleren zoals eerder gedaan voor het geladen DNA. Selecteer de voorgevulde putten voorgevulde putten om te analyseren. En klik op de go-knop.

Controleer of de gemeten volumes overeenkomen met de verwachte volumes. En zorg ervoor dat er geen putten zijn geladen met volumes van meer dan 12 microliter. Voer nu een reset van de DNA picklist uit in de picklist software.

Controleer of de apparaatparameters nog steeds zijn ingesteld op waterige buffers. Voer de juiste bron- en doelplaattypen in. Klik op het tabblad keuzelijst op opnieuw instellen om de voorbeeldlijst te wissen.

Klik vervolgens op importeren en kies de TR_Picklist. CSV-bestand. Klik op spelen.

Sla het protocol op als dit wordt gevraagd en voer een simulatie uit van de transfectiereageagemengselsdosaties van het programma om een goed ontwerp te garanderen door op de knop simuleren te klikken. Zoals eerder gedaan, na het klikken op de run-knop en het starten van het doseerprogramma plaats de bronplaat en vervolgens de bestemmingsplaat in de NanoDipsenser zoals gevraagd. Om de cellen af te geven, vul een nieuw steriel vat met de voorbereide celsuspensie en roer het om sedimentatie te voorkomen die leidt tot onnauwkeurigheid en celdichtheid.

Plaats de buisorganisator in de oplossing. Druk vervolgens op de prime-knop totdat de celopening begint te spoelen van de doseerkop. Zorg ervoor dat de tip niet verstopt is door de stroom van de doseerkop visueel te inspecteren tijdens het spoelen en zorg ervoor dat elke buis wordt geladen met celsuspensie.

Laad nu het DNA en TR gevuld 384 goed bestemming plaat op de peristaltische vloeistof handler plaat drager en verwijder het deksel. Voer het voorgekalibreerde programma uit om 40 microliter van de celsuspensie af te geven op de volledige 384 putplaat. De doseertijd is ongeveer 45 seconden.

Tot slot, vervang het deksel van de 384 put plaat. De transfectie van HeLa cellen met behulp van lipopolyplex reagens was succesvol. DNA-bedragen variërend van vijf tot 30 nanogram toonden dezelfde efficiëntie en tot 90% celtransfectie bij één microliter verdunningsvolume.

Hogere bedragen resulteerden daarentegen in een abrupte afname van het percentage transfected cellen. Verschillende verdunningsvolumes variërend van 15 nanoliter tot vier microliter werden getest en één microliter werd geïdentificeerd als de beste conditie. Om de doorvoer van dit protocol verder te verbeteren werden twee efficiënte DNA-opslagmethoden getest, namelijk het droog opslaan van de plaat of bevroren opslag.

Beide opslagmethoden leidden niet tot significant andere resultaten dan vers afgegeven DNA-oplossing die tot zeven dagen is opgeslagen. Aangezien plasmatransfectie meestal ten minste twee verschillende plasmiden gebruikt, werd het DNA-multiplexing vermogen van dit protocol onderzocht met behulp van de best geïdentificeerde omstandigheden. De eerder gebruikte tdTomato rode fluorescerende eiwit uitdrukken plasmid werd gewijzigd om mVenus een heldere gele fluorescerende eiwit uit te drukken en beide werden vervolgens gebruikt in cotransfectie pogingen.

Rode of groene fluorescerende positieve celanalyse toonde aan dat de transfectie-efficiëntie ongeveer 80% bedroeg, Maar bijna 100% van de rode cellen werden ook gecotransfecteerd met de mVenus die plasmide uitdrukt, zoals te zien is in de representatieve softwaregebaseerde beeldanalyse. Zodra DNAs zijn afgegeven in de bronplaat. Voer een enquête uit om ervoor te zorgen dat de verwachte volumes zijn geladen en niet meer dan 12 microliter.

Probeer tijdens het afgeven van het transfectiereagens in de bronplaat bellen te vermijden, omdat het centrifugeren van subplaten zal resulteren in een volledig verlies van transfectiewerkzaamheid. Deze methode kan worden toegepast op biologisch experiment, misdaden en transfectie en is geschikt voor meestal dat kan worden uitgevoerd in een 384 put plaat formaat. Een volledig bewijsdichte transfectie maakt de weg vrij voor nieuwe toepassingen zoals plasmide die bekend staan om scherpere gegoten niet-screeningbenaderingen die het mogelijk maken de monitoring van intermitterende affecten mogelijk te maken die momenteel niet in slechte strategieën kunnen worden gesorteerd.