Name: Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Leer hoe je lipoproteïne deeltjes verrijkt met microRNA en de celopname snelheid bepaalt. Deze methode gebruikt delipidering en reconstitutie voor kwantitatieve analyse van transportdeeltjes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Oostenrijkse wetenschaps Fonds project P29110-B21, het "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft" project H-3065/2011, het Europeesfonds voor regionale ontwikkeling (EFRE, IWB2020), de federale staat van Upper Oostenrijk, en de "land OÖ Basisfinanzierung".

<ol><li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nature Cell Biology. 13 (4), 423-435 (2011).</li>
<li>Tabet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-transferred+microRNA-223+regulates+ICAM-1+expression+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Wahid, F., Shehzad, A., Khan, T., Kim, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+Synthesis%2C+mechanism%2C+function%2C+and+recent+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: Synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1803 (11), 1231-1243 (2010).</li>
<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+Translation+and+Stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs.</a> Annual Review of Biochemistry. 79 (1), 351-379 (2010).</li>
<li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs%3A+Are+the+answers+in+sight%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: Are the answers in sight?</a> Nature Reviews Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li>
<li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+High-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of High-Density Lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. , 553-582 (1986).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+AFM+and+Applications+to+Biomolecular+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">High-Speed AFM and Applications to Biomolecular Systems.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 393-414 (2013).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Patsch, J. R., Patsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Zonal ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 129 (1966), 3-26 (1986).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Yamamoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Techniques+for+Observing+Dynamic+Biomolecular+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Techniques for Observing Dynamic Biomolecular Processes.</a> Methods in Enzymology. 475, 541-564 (2010).</li>
<li>Stangl, H., Cao, G., Wyne, K. L., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scavenger+receptor%2C+class+B%2C+type+I-dependent+stimulation+of+cholesterol+esterification+by+high+density+lipoproteins%2C+low+density+lipoproteins%2C+and+nonlipoprotein+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Scavenger receptor, class B, type I-dependent stimulation of cholesterol esterification by high density lipoproteins, low density lipoproteins, and nonlipoprotein cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (47), 31002-31008 (1998).</li>
<li>Hochberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+a+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: a Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biology. 10 (6), (2009).</li>
<li>Schumaker, V. N., Puppione, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%5D+Sequential+Flotation+Ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">6] Sequential Flotation Ultracentrifugation.</a> Methods in Enzymology. 128 (C), 155-170 (1986).</li>
<li>Wagner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+levels+and+cellular+transfer+of+circulating+lipoprotein-bound+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1392-1400 (2013).</li>
<li>Meier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chronic+kidney+disease+on+macrophage+cholesterol+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of chronic kidney disease on macrophage cholesterol efflux.</a> Life Sciences. 136, 1-6 (2015).</li>
<li>Axmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+Lipoprotein+Particle+miRNA+Profile+in+Uremia+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Serum and Lipoprotein Particle miRNA Profile in Uremia Patients.</a> Genes. 9 (11), 533(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt stap voor stap beschreven wat de isolatie is van lipoprotein deeltjes van menselijk bloed en de bepaling van hun individuele miRNA-inhoud. Het is cruciaal om te werken in een ASE-vrije omgeving, terwijl de behandeling van geïsoleerde en gesynthetiseerde miRNA-deeltje-embedded miRNA is uiteraard beschut tegen enzymatische degradatie. Aangezien de miRNA/deeltjes verhouding van inheemse lipoprotein deeltjes vrij laag is, is de kunstmatige verrijking met miRNA vereist om de holo deeltjes opname van cellen te bestuderen. Daardoor wordt de reconstitutie van HDL-deeltjes zoals eerder beschreven7 gewijzigd om Mirna strengen op te nemen. Bovendien, de scheiding van de lipide en eiwitfractie tijdens deze procedure kunnen wetenschappers te onderzoeken lipide-en eiwit-geassocieerde componenten van de lipoprotein deeltje19. Op een gelijkaardige manier, wordt de het etiketteren procedure van LDL deeltjes aangepast. Interessant, de toevoeging van spermidinespermine-een natuurlijke stabilisator van nucleotiden-heeft geen invloed op de miRNA/particle ratio. Er zij op gewezen dat in principe de methode toelaat de invouwing van andere stoffen dan miRNA binnen een lipoprotein deeltje. Natuurlijk, is er een grens met betrekking tot de fysieke grootte van de substantie die op de totale grootte van HDL wordt gebaseerd (diameter: 5-12 nm) en LDL deeltjes (diameter: 18-25 nm).
Met betrekking tot de kwaliteitscontrole van hervormde/gelabelde lipoprotein deeltjes, HS-AFM is een van toepassing zijnde methode om HDL/LDL deeltjes te karakteriseren op het enige particle niveau. In vergelijking met EM, het zorgt voor kortere voorbereiding tijden en bijna-fysiologische omstandigheden (natte, kamertemperatuur).
Door zijn inherente gevoeligheid en versterking, qPCR is de methode van de keuze om lage miRNA concentraties op te sporen. Als alternatief is een enkelvoudige molecuul gevoelige fluorescentie microscopie, die in staat is om zelfs individuele moleculen te detecteren, niet geschikt vanwege de lage concentraties van bijvoorbeeld fluorescerende gelabelde miRNA strengen per deeltje. Aldus, is de verhouding van de bundels van miRNA per inheems lipoprotein deeltje gevonden om 10-8te zijn. Kunstmatige verrijking verhoogt de ratio met een factor van 10.000, die de schatting van de cellulaire lipoprotein opnamesnelheid vergemakkelijkt (geen significant verschil wordt gedetecteerd met behulp van native lipoprotein deeltjes 19). De hoge gevoeligheid van qPCR maakt het mogelijk om deze opnamesnelheid te bepalen door het aantal miRNA strengen na de incubatietijd en de miRNA/particle ratio te meten. Opgemerkt moet worden dat de berekende waarde negeert cellulaire degradatie en vrijlating van miRNA en, dus, vertegenwoordigt ten minste een lagere limiet voor de lipoprotein deeltjes opname ratio.
In de toekomst kan de methode worden aangepast aan de overdracht van farmaceutische stoffen (met name ook lipophilic Ones) in cellen en correleren hun biologische effect op de intracellulaire concentratie (bepaald via de opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes).

Lipoprotein deeltjes zijn samengesteld uit een monolayer van amphiphilic lipiden en cholesterol die een kern van cholesteryl esters en triglyceride vetten insluiten. Het gehele deeltje wordt gestabiliseerd door membraan-ingebedde apolipoproteins, die de biologische functionaliteit van het deeltje bepalen. Lipoprotein deeltjes kunnen worden onderscheiden volgens hun respectieve toenemende dichtheid en, dus, afnemende grootte, namelijk als zeer lage dichtheid lipoprotein (VLDL), intermediaire-density lipoprotein (IDL), LDL, en HDL-deeltjes. Ondanks het vervoer van water-onoplosbare componenten in de bloedbaan, is aangetoond dat HDL-deeltjes dragen niet-codering strengen van Mirna1,2. Micro-ASE is een klasse van korte (gewoonlijk twee dozijn nucleotiden) de bundels van RNA, die intracellulair complementaire mRNA bundels afbreken en, daardoor, het uitdrukkings Profiel van bepaalde proteïnen3,4,5veranderen, 6. Bovendien zijn de veranderingen van het profiel van miRNA gevonden in een verscheidenheid van ziekten en, dus, is het profiel toepasselijk als biomarker voor diagnose en prognose. De extracellulaire transport van miRNAs tussen cellen via lipoprotein deeltjes kan dienen als een extra mechanisme voor intercellulaire mRNA niveau modulatie. Om het biologisch effect kwantitatief te schatten, is kennis over het absolute en relatieve miRNA gehalte van lipoprotein deeltjes nodig.
Kwantitatieve PCR in real time is een geschikte en vrij snelle methode om deze informatie te bereiken. Vandaar, kan de relatieve kwantificatie (ov) waarde worden berekend, en de relatieve verschillen tussen verschillende steekproeven en lipoprotein fracties zijn ramen. Multigoed microfluidic array kaarten zijn een snelle en makkelijk te gebruiken methode om de relatieve aanwezigheid te bepalen (komt overeen met de OV-waarde) van miRNAs in een sample. Multiwell-microfluidic array kaarten bestaan uit 96 of 384 individuele reactie kamers voor individuele qPCR reacties ingebed in een microvloeiend apparaat. Elke kamer bevat de vereiste hydrolyse sonde en specifieke qPCR primers voor een individuele miRNA. De voordelen zijn een korte verwerkingstijd als gevolg van standaardisatie, een eenvoudige workflow en een beperkt aantal pipetten stappen. Bovendien wordt het vereiste sample volume geminimaliseerd. In tegenstelling tot de relatieve kwantificering vereist het absolute miRNA-gehalte een vergelijking van qPCR steekproefresultaten met standaard krommen van bekende absolute nummers van miRNA strengen. Opgemerkt moet worden dat, vanwege hun relatief lage miRNA inhoud, standaard en bovendien zelfs single-molecule gevoelige beeldvormende technieken niet haalbaar zijn-de kunstmatige verrijking van lipoprotein deeltjes met miRNA is onvermijdelijk om cellulaire studie lipoprotein deeltjes interactie en miRNA Transfer. Ten aanzien van deze, delipidatie van het HDL-deeltje gevolgd met latere relipidation7 maakt de integratie van en, dus, verrijking met Mirna strengen. De gelijkaardige verrijking van LDL deeltjes met miRNA is niet haalbaar toe te schrijven aan de hydrophobicity van apoB-100 proteïne, die het belangrijkste bestanddeel van het deeltjes LDL is. Echter, door toevoeging van het polaire oplosmiddel dimethyl sulfoxide (DMSO), die in staat is te penetreren lipide membranen, LDL-deeltjes kunnen kunstmatig worden geladen met miRNA strengen ook.
High-Speed Atomic Force microscopie (HS-AFM) is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van biologische specimens met subnano meter ruimtelijke en subsecond temporele resolutie8. Vandaar, is het een goed-geschikte techniek voor de kwaliteitsbeheersing van gewijzigde lipoprotein deeltjes als inheems/opnieuw samengesteld/geëtiketteerde lipoprotein deeltjes kunnen onder een dichtbijgelegen-fysiologisch milieu worden afgebeeld.
Hier wordt een qPCR-gebaseerd protocol gepresenteerd stap voor stap om de absolute/relatieve miRNA inhoud van lipoprotein deeltjes en cel monsters te bepalen, die een schatting van de cellulaire lipoprotein deeltjes opnamesnelheid mogelijk maakt. Bovendien wordt een methode voor de verrijking van lipoprotein deeltjes met miRNA aangetoond. Deze methode kan worden aangepast voor de algemene manipulatie van lipoprotein inhoud en, vandaar, demonstreert de toepasselijkheid van lipoprotein deeltjes als doelstellingen voor druglevering.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Vacutainer (EDTA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Kaliumbromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuizen</td><td>Beckman</td><td>342414</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuis sealer</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>Dialysebuizen, MWCO 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>Lipoproteïne isolatie</td></tr><tr><td>synthetisch miRNA</td><td>microSynth</td><td>-</td><td>synthetisch miRNA</td></tr><tr><td>TRIS buffer pH 7</td><td>Ambion</td><td>AM9850G</td><td>synthetisch miRNA</td></tr><tr><td>TRIS buffer pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>synthetisch miRNA</td></tr><tr><td>steriele buizen</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>synthetisch miRNA</td></tr><tr><td>Fotometer</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Biophotometer</td><td>Bradford assay</td></tr><tr><td>Cuvet</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Bradford assay</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Stain</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Bradford assay</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analytical</td><td>03690-100ML</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>TRIS buffer pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>AustrAlco</td><td>Ethanol Absolut 99.9%</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Fosfatidylcholine</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Cholesterol oleate</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>glasbuizen</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Natrium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Magnetische roerbar</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>100&micro;L micropipettes</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>Amberlite XAD-2 korrels</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer cassette (cut-off 20 kDa)</td><td>Thermo Scientific</td><td>66003</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>Spuitnaald</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>Labeling of LDL particles</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>life technologies</td><td>D12345</td><td>Labeling of LDL particles</td></tr><tr><td>Atomic Force Microscope</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>Muscovite Mica (V-1 Grade)</td><td>Christine Gr&ouml;pl</td><td>G250-1/V1</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>AFM Cantilever</td><td>Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>Czech Metrology Institute</td><td>http://gwyddion.net</td><td>Quality control of reconstituted/labeled lipoprotein particles</td></tr><tr><td>Chamber slides, Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Celteller</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td>miRNA extraction</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>miRNA extraction</td></tr><tr><td>20G naald</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miRNA extraction</td></tr><tr><td>5ml spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>miRNA extraction</td></tr><tr><td>PCR cabinet</td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>Rnase-vrije water</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>0.2 ml buizen</td><td>Brand</td><td>781305</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Microcentrifuge AL</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>TaqMan Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>iTaq Universal probe supermix</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Corbett</td><td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399966</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399933</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Advanced miRNA Human A Cards</td><td>Applied Biosystems</td><td>A31805</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>MgCl2 (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4

verrijking van native lipoprotein deeltjes met microrna en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microrna inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Lipoprotein deeltjes zijn overwegend vervoerders van lipiden en cholesterol in de bloedbaan. Bovendien bevatten ze kleine hoeveelheden van niet-codering microRNA (miRNA). In het algemeen, verandert miRNA het eiwit uitdrukkings profiel toe te schrijven aan interactie met boodschapper-RNA (mRNA). Zo is kennis van het relatieve en absolute miRNA gehalte van lipoprotein deeltjes essentieel om het biologische effect van cellulaire deeltjes opname te schatten. Hier, een kwantitatieve real-time polymerase chain reaction (qPCR)-gebaseerde protocol wordt gepresenteerd aan de absolute miRNA inhoud van lipoprotein deeltjes te bepalen-geïllustreerd getoond voor native en miRNA-verrijkte lipoprotein deeltjes. Het relatieve miRNA-gehalte wordt gekwantificeerd met behulp van multigoed microfluidic array kaarten. Bovendien, dit protocol kunnen wetenschappers de raming van de cellulaire miRNA en, dus, de lipoprotein deeltjes opnamesnelheid. Een significante toename van de cellulaire miRNA niveau is waarneembaar bij het gebruik van high-density lipoprotein (HDL) deeltjes kunstmatig geladen met miRNA, overwegende dat incubatie met inheemse HDL-deeltjes levert geen significant effect als gevolg van hun vrij lage miRNA inhoud. In tegenstelling, de cellulaire opname van lage dichtheid lipoprotein (LDL) deeltjes-noch met native miRNA, noch kunstmatig geladen met het-heeft geen invloed op de cellulaire miRNA niveau.

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Lipoprotein deeltjes zijn inheemse transportvoertuigen. De verrijking van vreemde stoffen vergemakkelijkt het gebruik ervan als spoorvervoerder. Specifieke etikettering van moleculen of hele deeltjes maakt het mogelijk om de cellulaire opname te meten.De twee verrijkingsmethoden zijn snel en gebruiksvriendelijk en kunnen worden aangepast voor een breed scala aan stoffen. Het aantonen van de procedure zal Markus Axmann en Andreas Karner, twee postdocs van mijn lab. Om te beginnen met delipidatie in een rookkap, meng een tot twee milliliter bereide HDL-oplossing met vijf milligram HDL-deeltjes met 50 milliliter vooraf gekoelde drie-tot-twee mengsel van ethanol diethylether in een conische centrifugatiebuis.Incubeer gedurende twee uur bij negatieve 20 graden Celsius. Centrifuge op 2500 keer g gedurende 10 minuten bij negatieve 10 graden Celsius. Gooi de supernatant, resuspend de pellet in 50 milliliter van voorgekoelde ethanol diethylether mengsel, en vortex kort.Broeden een tweede keer voor twee uur bij negatieve 20 graden Celsius. Centrifuge opnieuw op 2500 keer g gedurende 10 minuten bij negatieve 10 graden Celsius. Dan invoegen buizen leveren stikstof gas stroom om de pellet te drogen.En resuspend het in 250 microliters van buffer A.Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford eiwittest of een andere geschikte. Het is van cruciaal belang om restanten van het ethanoldiëtheremenamengsel te verwijderen, omdat deze oplosmiddelen de betrouwbaarheid van apolipoproteïnen zouden remmen. Vervolgens verdunnen tot een laatste concentratie van een milligram eiwit per 250 microliter buffer A.Insert een slang leveren inert gas in de oplossing deel in de buis.Bewaar de oplossing indien nodig 's nachts op vier graden Celsius onder de inerte gasatmosfeer. Om te beginnen met de reconstructie, in een schone glazen buis, meng 100 microliter CO, 13,5 microliter van C, en 500 microliters van pc. Draai vervolgens de glazen buis terwijl u stikstofgas in de buis spoelt om het mengsel te drogen om een homogene oppervlaktelaag op te leveren. In een 0,5-milliliter reactiebuis, bereid een verse 30-millimolar spermine oplossing in buffer A.Then Meng 100 microliter van 10-micromolar synthetische microRNA met 100 microliter van spermine oplossing in een twee-milliliter reactiebuis.En 30 minuten uitbroeden bij 30 graden Celsius. Breng vervolgens de geïncubeerde 200-microliteroplossing over in de glazen buis om de voorbereide PC-CO-C mastermix-oppervlaktelaag te rehydrateren. En voeg dan 50 microliter van een 30 milligram per milliliter natriumdeoxycholaat oplossing.Roer twee uur lang op vier graden Celsius. Voeg daarna 250 microliter van de gedelipde HDL-oplossing toe aan de glazen buis. En roer op vier graden Celsius 's nachts.Om te beginnen dialyse, voeg eerst 50 gram adsorberde kralen tot 800 milliliter dubbel gedestilleerd water. En gebruik een magnetische roerder om te roeren voor een minuut. Wacht 15 minuten tot de kralen zich vestigen en decanteer de supernatant.Herhaal de procedure met vooraf gekoelde PBS. Voorwett dialysecassettes in PBS. Gebruik een spuit om het eerder bereide mengsel in de cassettes toe te voegen volgens de instructies van de fabrikant.Voeg de met PBS behandelde adsorberende kralen toe aan drie liter PBS en plaats de cassettes in de PBS om te dialyseren bij vier graden Celsius. De kralen houden de dichtheidsgradiënt langs het dialysemembraan constant. Verander de buffer en de kralen na een uur en twee uur.Haal na 24 uur met een spuit de oplossing uit de cassette in een 1,5 milliliter reactiebuis om de gereconstitueerde HDL-deeltjesoplossing terug te krijgen. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test. Lever inert gas aan de reactiebuis, verzegel het en bewaar de gereconstitueerde HDL-deeltjesoplossing onder inerte gasatmosfeer bij vier graden Celsius.Bereid eerst een verse spermaoplossing van 30 millimolar voor in RNAse-vrij water. Meng 100 microliter van 10 micromolar synthetisch microRNA met 100 microliter spermaoplossing in een twee milliliter reactiebuis. En 30 minuten uitbroeden bij 30 graden Celsius.Voeg vervolgens 100 microliter DMSO en 1,2 milliliter 1X LDL-buffer toe aan de bereide microRNA-zaadoplossing. Verdun eerder geprepareerde LDL-deeltjesoplossing met PBS tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer vier milligram per milliliter. Trek vervolgens 450 microliter van de verdunde oplossing in een reactiebuis van 1,5 milliliter en meng met 50 microliter 10X LDL-buffer.Broed het 10 minuten op ijs. Combineer na incubatie de LDL-deeltjesoplossing van 500 microliter en de 1,5 milliliter microRNA-spermine-DMSO-oplossing en ontcubeer deze gedurende twee uur bij 40 graden Celsius. Voer dialyse vergelijkbaar uit zoals eerder beschreven en bewaar de gelabelde LDL-deeltjesoplossing onder inerte gasatmosfeer op vier graden Celsius.Verdun de HDL- of LDL-deeltjesoplossing in PBS tussen één-op-100 en één-op-1,000. Kleef mica door plakband tegen het mica-substraat te drukken en de tape eraf te trekken om de bovenste micalagen te verwijderen. Gebruik een pipet om twee microliters te deponeren op vers gespleten mica om vijf minuten in te broeden.Lipoprotein deeltjes hebben de neiging om continue binding membranen vormen op oppervlakken. Daarom is het belangrijk om de deeltjesconcentratie op het micaoppervlak aan te passen om individuele te krijgen. Na incubatie het monster spoelen met PBS.Vul de snelle AFM-vloeistofcel met PBS en monteer de mica-dragende scanner op het snelle AFM-podium. In de besturingssoftware start u het benaderproces van de cantilever naar het mica-oppervlak. Gebruik scanformaten van minder dan één vierkante micrometer en houd de beeldkrachten zo laag mogelijk.Afbeelding van het voorbeeld in de tikmodus. Laad de gegevens in de Gwyddion en detecteer de deeltjes via de merkkorrels per drempelfunctie. Pas de hoogtedrempelwaarde aan om de afzonderlijke deeltjes te maskeren.Meestal is een niveau rond de 50%een goed uitgangspunt. Verwijder polynomiale achtergrond om de afbeelding af te vlakken en activeer de optie Gemaskerd gebied uitsluiten. Exporteer de maximale hoogtewaarden van de gedetecteerde deeltjes met behulp van de verdeling van de functie Verschillende korrelkenmerken en herhaal deze stappen voor alle opgenomen beelden.In dit experiment werd de reconstructie van HDL-deeltjes uitgevoerd door delipidatie van HDL-deeltjes, gevolgd door relipidatie en dialyse. Een opbrengst van 50% van de gereconstitueerde HDL-deeltjes kan worden bereikt. Dezelfde etikettering met microRNA was echter niet haalbaar voor de etikettering van LDL-deeltjes, vanwege de hydrofobeiteit van het apolipoproteïne B100-eiwit.Zo werd DMSO gebruikt voor de penetratie van de lipidemonolaag van de LDL-deeltjes, met een opbrengst van bijna 100%Tijdens de kwaliteitscontrole is de verdunning cruciaal voor analyse. Het bovenste beeld toont een te hoge deeltjesdichtheid. Het onderste beeld is geschikt voor analyse.De functies van de waarschijnlijkheidsdichtheid van deeltjeshoogten werden berekend voor vergelijking van groottedistributies van de inheemse, gelabelde, en gelabelde controlelipoproteindeeltjes. De relatieve verandering voor en na de etiketteringsprocedure is verwaarloosbaar. Bij het hanteren van RNA oligonucleotiden, werken RNAse-vrij.Gebruik verse wegwerp plastic verbruiksartikelen, en draag altijd handschoenen. Gebruik alleen nuclease-vrije oplossingen. High-speed AFM is slechts een methode om de algemene vorm van lipoproteïnen te bepalen.Een alternatieve methode zou elektronenmicroscopie zijn. Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een rookkap tijdens het hanteren van diethylether.

enrichment-native-lipoprotein-particles-with-microrna-subsequent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Dit verslag beschrijft een protocol voor het meten van de absolute niveaus van plasma miRNA, kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie PCR gebruiken met of zonder voorafgaande versterking. Dit protocol biedt een beter begrip van de hoeveelheid plasma miRNAs en laat de kwalitatieve beoordeling van de bijbehorende gegevens uit verschillende studies of laboratoria.

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol dat in vitro beoordeling van de overvloed aan fluorescerend gelabelde microRNA's mogelijk maakt om de dynamiek van microRNA-verpakking en export naar extracellulaire vesikels (EV's) te bestuderen.

Volgen van miRNA-afgifte in extracellulaire blaasjes met behulp van flowcytometrie

Leer hoe je lipoproteïne deeltjes verrijkt met microRNA en de celopname snelheid bepaalt. Deze methode gebruikt delipidering en reconstitutie voor kwantitatieve analyse van transportdeeltjes.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid (Video) | JoVE Journal

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Meer video's verkennen