Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Het algemene doel van dit experiment, ons achterpoot ischemiemodel is om het experiment een basis te geven voor een uitgebreide beoordeling van de functionele, histologische en moleculaire effecten van vermeende angiogene stoffen. Dit protocol bevat een standaard voor het testen van mogelijke angiogene therapieën in een klein diermodel met het potentieel voor toekomstige toepassingen in de klinische context. Aangezien revascularisatie niet geschikt is bij twintig tot dertig procent van de kritische ischemiepatiënten Therapeutische angiogenese is naar voren gekomen als een nieuwe strategie voor het verbeteren van de bloedefusie op de ischemische locatie.

Dit experimentele protocol zou een uitgebreid inzicht kunnen verschaffen in de mechanismen waarmee angiogene therapieën hun effecten uitoefenen in de mate van hun werkzaamheid bij elk van hun resultaten. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op teen knijpen in een 22 weken oude C57 zwarte zes vrouwelijke muis, scheer het haar van de rechter achterpot en zet het dier in de rug naar cubitus positie op een verwarmde pad. Plaats het dier onder een ontledenmicroscoop.

En gebruik een nummer elf chirurgische scalpel mes om een een centimeter huid incisie te maken over de dij van de rechter achterpoot. Stomp ontleed het onderhuidse vet om de neurovasculaire bundel bloot te leggen. En gebruik puntige tangen, veerschaar en een oogheelkundige naaldhouder om de membraanige ileofemorale schede te openen om de distale externe iliacale en dijbeenvaten bloot te stellen.

Na het ontleden en scheiden van de slagader en ader van de zenuw, gebruik maken van zeven O niet-apober polypropyleen hechtingen aan de distale dijbeen slagader en ader en distale externe iliacale slagader en ader ligate. De identificatie van de distale externe iliacale slagader en de ligatie en excisie van de distale externe iliacale en femorale slagader en aderen zijn van cruciaal belang voor het succes van de procedure. Gebruik de veerschaar om het segment van de iliofemorale slagader en aders tussen de distale en proximale knopen te transecteren.

En sluit de incisie af met een opneembare hechting. Vervolgens, inter-peritoneally leveren antisedatieve oplossing in het dier en de muis terug te keren naar zijn huis kooi met controle tot volledig herstel. Om de gastrocnemiusspieren te oogsten, verwijdert u de huid van beide achterpoten.

En gebruik het wattenstaafje om de huid te scheiden van de spieren. Houd de achillespees, gebruik de veerschaar om de spier te scheiden van het scheenbeen en kuitbeen tot aan het kniegewricht. En scheid de biceps femoris van de gastrocnemiusspier.

Gebruik de veerschaar om de invoegingen van de gastrocnemiusspier op het kniegewrichtsniveau te snijden. En gebruik 10% trigasanth om de geoogste spieren in een dwarse oriëntatie op een kleine kurkschijf te positioneren. Vervolgens, snap bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof gekoelde isopentane voor min 80 graden Celsius opslag.

Voor capillaire microdissection laser capture, na het verkrijgen van 12 micrometer secties van de spiermonsters, bevestig de weefsels aan de dia's in 50 milliliter gekoelde zuivere aceton gedurende vijf minuten bij min twintig graden Celsius. Na het drogen van de lucht en cirkel elk exemplaar met een hydrofobe pen. En hydrateer de monsters met twee molaire natriumchloride in PBS op vier graden Celsius.

Aan het einde van de re-hydratatie, etiketteren van de monsters met de juiste primaire antilichaam van belang op vier graden Celsius 's nachts. Gevolgd door twee drie minuten wasbeurten in verse twee molaire natriumchloride in PBS per wasbeurt. Na de tweede was, etiketteren de secties met een geschikte secundaire antilichaam gedurende dertig minuten op vier graden Celsius, gevolgd door twee wasbeurten in natriumchloride in PBS zoals aangetoond.

Label vervolgens de monsters met avidin geconjugeerd peroxidasecomplex gedurende dertig minuten bij vier graden Celsius. Gevolgd door een wasbeurt en vijf minuten etikettering met DAB peroxidase substraat. Aan het einde van de incubatie, dehydrateren de weefsels in sequentiële ijskoud 90%ethanol en 100% ethanol emersions.

Gebruik vervolgens een later microdisseissysteem, uitgerust met een puls om 355 nanometer laser te laten effenen om 10.000 haarvaten per muis te ontleden en de ontleden haarvaten te katapulteren tot een lijmdop voor microfugebuis. Zoals geïllustreerd, wordt een volledig verlies van hindlimb perfusie waargenomen onmiddellijk na hindlimb ischemie inductie. Kwantitatieve evaluatie van de bloedstroom, uitgedrukt als een verhouding van ISC tot NISC ledemaat, toonde aanzienlijk verbeterde bloedperfusie van ledematen bij muizen blootgesteld aan de pro-angiogene stimulus op dagen 15 en 45 post-HLI.

De kwantificering van CD31 positieve haarvaten in histologische secties van gastrocnemius spierweefselsecties toont aan dat de capillaire dichtheid groter is in de ischemische versus de niet-ischemische ledemaat. Zoals verwacht. Maar dit effect wordt verder versterkt na behandeling met het pro-angiogene middel.

De dichtheid van het bijkomende vat neemt ook consequent toe in de ischemische ledemaat en deze toename is aanzienlijk hoger na blootstelling met de pro-angiogene stimulus. Omgekeerde transcriptase polymerase kettingreactie analyse van pro-angiogene genexpressie in CD31 positieve endotheelcellen toont een duidelijke variatie in genexpressie tussen muizen blootgesteld of niet aan de pro-angiogene agent. Het is belangrijk om een oogheelkundige naald ouder te gebruiken om de membraan iliofemorale schede te openen om scheuren van de slagader en ader tijdens de ontleding van het vat te voorkomen.

Het vat reageert op achterpoot ischemie in de gemakkelijk geëvalueerd door laser doppler gebaseerde perfusie metingen en de histologische kwantificering van de capillaire dichtheid van het vat stelt ons in staat om de angiogenese te evalueren.