Name: Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer een protocol voor het evalueren van opslagstabiliteit van extracellulaire blaasjes met glucuronidase als marker. AF4-purificatie minimaliseert schuifspanning en maakt vergelijking tussen verschillende celtypen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het NanoMatFutur Junior research programma van het Federaal Ministerie van onderwijs en onderzoek, Duitsland (Grant Number 13XP5029A) steunde dit werk. Maximilian Richter werd gesteund door Studienstiftung des deutschen Volkes (Duitse academische beurs Stichting) door middel van een Ph.D. Fellowship.

1. de cultuur van de cel en de productie van cel-geconditioneerd middel
<ol><li>In het algemeen, cultiveren cellen onder de individuele voorwaarden die nodig zijn voor de desbetreffende cel lijn.</li>
	<li>Kweek de cellen voor 24-72 h in serum vrije voorwaarden of in medium met EV-verarmd foetale boviene serum (FBS). Opmerking: als EV-uitgeput FBS wordt gebruikt, gebruik maken van een methode bewezen om efficiënt afbreken van het serum, om verontreiniging te voorkomen met runderen serum-afgeleide EVs26.</li>
	<li>Verzamel het medium uit de kolven. Centrifugeer bij 300 x g voor 10 min om de cellen te pelleten. Verzamel zorgvuldig het cel-geconditioneerde middel (CCM), zonder de gekorrelde cellen te storen. Bij voorkeur, gebruik dan de CCM direct, of op te slaan 's nachts bij 4 ° c. Nota: het is altijd verkieslijk om vers geproduceerde CCM te gebruiken. Indien opslag voor langere perioden niet kan worden omzeild, moeten alle relevante parameters worden geregistreerd in overeenstemming met MISEV2018 richtlijnen26, en de potentiële vooroordelen van de verkregen resultaten moeten in aanmerking worden genomen.</li>
	<li>Voorbeeld protocol voor HUVECs<ol>
<li>Cultiveren HUVEC cellen voor 120 h in BAVA-2 medium met FBS en andere supplementen.</li>
		<li>Cultiveren HUVEC cellen voor 48 h in EBM-2 basale medium vrij van eventuele extra supplementen.</li>
		<li>Verzamel het medium uit de kolven en voer de Centrifugeer stap uit zoals hierboven aangegeven (stap 1,3). Gebruik meestal 100 mL medium voor één EV-isolatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ultracentrifugation van CCM
<ol><li>Onmiddellijk vóór ultracentrifugation (UC), centrifugeer CCM 15 min bij 3.000 x g en 4 °c om cel puin en grote agglomeraten te verwijderen.</li>
	<li>Breng de bovendrijvende voorzichtig over naar de UC-buizen. Bij gebruik van een vaste hoek rotor, Markeer de oriëntatie van de buizen in de centrifuge om het ophalen van de EV pellet te vergemakkelijken na de UC. Centrifugeer voor 2 h bij 120.000 x g, met een k-factor van 259,4.</li>
	<li>Na UC, voorzichtig ontdoen van de bovendrijvende met behulp van een serologische Pipet, om de verstoring van de pellets EVs te voorkomen. Opmerking: de pellet kan onzichtbaar zijn.</li>
	<li>Voeg 200 µ L van 0,2 µm-gefiltreerd fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de eerste buis toe en gebruik PBS en het resterende bovendrijvende om de korrel opnieuw op te schorten door op en neer te pipetteren. Breng de resulterende EV schorsing naar de volgende buis van het desbetreffende monster en gebruik het voor de hersuspensie. Ga op deze manier om alle EVs van het monster opnieuw op te schorten in een laatste volume van ongeveer 300-350 µ L.</li>
	<li>Na herschorsing, bevestig de aanwezigheid van deeltjes door nanodeeltjes Tracking Analysis (transatlantische). Gebruik de instellingen geoptimaliseerd voor de gegeven EV type, zoals de onderstaande instellingen (stap 2.5.1). Opmerking: de kranten van Gardiner et al.27 en vestad et al.28 bevatten waardevolle informatie over hoe de parameters voor het meten van EVS te optimaliseren.<ol>
<li>Om de hieronder beschreven resultaten te reproduceren, gebruik instrumenten (bijv. NanoSight LM14) uitgerust met een groene laser. Neem drie Video's van 30 s met een het scherm aanwinst van 1,0 en een camera niveau van 13 op. Voor analyse, gebruik een het scherm aanwinst van 1,0 en een opsporings drempel van 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik de pellet onmiddellijk, indien mogelijk; anders, bewaar het bij 4 °C 's nachts.</li>
</ol>3. glucuronidase inkapseling in EVs
<ol><li>Aan de opnieuw gesuspendeerde pellet, voeg bèta-glucuronidase (10 mg/mL in PBS) toe aan een eindconcentratie van 1,5 mg/mL en saponine (10 mg/mL in H2O) tot een eindconcentratie van 0,1 mg/ml. Meng goed door vortexen voor 3 s.</li>
	<li>Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met vermenging door zachtjes flicking de buis. Na incubatie, direct zuiveren door grootte-uitsluiting chromatografie (SEC) (zie punt 5). Opmerking: niet opnieuw bevriezen glucuronidase monsters eenmaal ontdooid, om te voorkomen dat enzym degradatie als gevolg van bevriezing.</li>
</ol>4. liposoom productie
<ol><li>Om liposomen voor te bereiden voor vergelijking met EVs, los 1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-FOSFOCHOLINE (DMPC) en 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC) op in een 2:3 maal rantsoen in chloroform tot een eindconcentratie van 5 mm. Bereid 1 mL hoeveelheid in hoge prestaties vloeibare chromatografie (HPLC) flacons en laat ze drogen 's nachts om een lipide film te vormen. Let op: chloroform is giftig en vermoedelijk kankerverwekkende. Neem de juiste voorzorgsmaatregelen bij het hanteren.</li>
	<li>Rehydrateer de lipide-film met 1 mL PBS met 1,5 mg/mL glucuronidase. Verhit het tot 42 ° c en Vortex voor 1 min. Verhit de extruder assemblage tot 42 ° c en extruderen de lipide suspensie 11x door middel van een 200 nm polycarbonaat membraan. Zuiver door SEC (zie hoofdstuk 5).</li>
</ol>5. reiniging door SEC
<ol><li>Bereid de SEC kolom met behulp van de volgende protocol.<ol>
<li>Gebruik alleen vers gezuiverd water en vers bereide buffers. Filter alle buffers door middel van een 0,2 µm membraanfilter en Degas hen om de vorming van luchtbellen in de kolom te voorkomen.</li>
		<li>Voor de voorbereiding van een kolom SEC, gebruik agarose gel filtratie-gebaseerde matrix (bijv., Sepharose cl-2b) of een andere SEC medium geschikt om EVs en liposomen scheiden van eiwit onzuiverheden en overtollige enzym. Eerste, verwijder de 20% EtOH oplossing het medium is opgeslagen in, om luchtbellen vorming in de kolom te voorkomen. Voor dit doel, centrifugeer de SEC medium op 3.000 x g voor 10 min, verwijder de EtOH, en vervang deze met ontgassd water.</li>
		<li>Vul een glazen kolom (met een inwendige diameter van 10 mm) met de SEC medium tot de 15 mL merk. Nota: de volumes zullen voor kolommen met verschillende afmetingen verschillen. Zorg ervoor dat de gel te laten regelen volledig.</li>
		<li>Voordat een punt wordt uitgevoerd, equilibrate de kolom met ten minste twee kolom volumes van PBS. Voor het opslaan van de kolom, eerst wassen met een kolom volume van het water, gevolgd door ten minste twee kolom volumes van 20% EtOH. Na opslag, was eerst de kolom met één kolom volume van water vóór equilibrating met PBS.</li>
		<li>Gebruik tot 400 µ L van EV of liposoom suspensie in een scheiding. Verzamel fracties van 1 mL. Na SEC slaat u de gezuiverde EVs op (zie sectie 7) of onderwerpt u deze aan een glucuronidase assay (zie punt 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bevestig de scheiding van EVs en liposomen van besmet proteïnen en vrije glucuronidase. Te dit doel, correleren de deeltjes concentraties van de verzamelde fracties met de eiwitconcentratie en de glucuronidase activiteit.<ol>
<li>Evalueer de deeltjesconcentratie door de transatlantische (zie 2,5)</li>
		<li>Evalueer het eiwitgehalte door bicinchoninic acid (de) assay of een andere geschikte eiwit kwantificatie assay. Voer de test uit volgens het Protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Evalueer de glucuronidase activiteit door glucuronidase assay (zie hoofdstuk 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optioneel, beoordelen van de EV morfologie door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en scanning elektronenmicroscopie (SEM).<ol>
<li>Voor de bereiding van TEM monsters, voeg 10 µ L van EV schorsing aan een TEM grid, incubeer voor 10 min, en dan Blot weg overtollige vloeistof met behulp van een filtreerpapier. Voer de fixatie voor 10 min met 10 µ L van 4% Paraformaldehyde en Blot weg een overmaat. Was 3x met water. Vlek de blaasjes door 20 s incubatie met 30 µ L van 1% fosfor-tungstic zuur hydraat. Na het wegvloeien van het overtollige, droog de blaasjes 's nachts. Visualiseer door TEM. Let op: Phospho-tungstic zuur is zeer bijtend; Bescherm dus de huid en de ogen.</li>
		<li>Voor SEM, bevestig de eerder geprepareerde TEM monsters op Carbon schijven en sputter ze met een 50 nm dikke gouden laag. Visualiseer door SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. glucuronidase assay
<ol><li>Om een vergelijking tussen verschillende monsters en opslagomstandigheden mogelijk te maken door het aantal deeltjes en de enzymactiviteit te correleren, meet eerst de deeltjesconcentratie van het monster door de transatlantische (zie stap 2,5).</li>
	<li>Bereid een werkende oplossing van fluoresceïne di-β-D-glucuronide door 1 µ L van de verbinding (10 mg/mL in H2O) aan 199 µ l van PBS toe te voegen. Voeg 25 µ L van deze oplossing aan 125 µ L van gezuiverd EVs toe om een definitieve concentratie van 8,3 µ g/mL te krijgen. Pipet het monster in een zwarte 96-well plaat. Meettijd punt 0 h met een plaat lezer, gebruikend 480 nm als opwinding en 516 nm als emissie golflengte.</li>
	<li>Bedek de plaat stevig (bijv., met transparante plastic folie gebruikt voor PCR-platen) om de verdamping te minimaliseren en incubeer in het donker voor 18 uur bij 37 ° c. Meet de fluoresceïne productie met behulp van de plaat lezer parameters vermeld in stap 6,2.</li>
</ol>7. opslag van EVs en liposomen
Opmerking: voor alle opslag doeleinden, is het raadzaam om lage-bindende buizen te gebruiken om EV verlies als gevolg van adsorptie te verminderen.
<ol><li>Volg de parameters in dit gedeelte om de representatieve resultaten hieronder weer te geven. Gebruik monsters bestaande uit 400 µ L van EV schorsing.<ol>
<li>Store bij 4 °C of-80 °C of ga verder met onderstaande stappen.</li>
		<li>Lyophilize de EVs.<ol>
<li>Voeg trehalose (40 mg/mL in H2O) toe tot een eindconcentratie van 4 mg/ml op het gezuiverde EVS. Bevriezen van de monsters bij-80 °C voor ten minste 1 uur.</li>
			<li>Lyophilize de monsters met behulp van de volgende parameters. Voor het hoofd drogen, stel de plank temperatuur tot 15 ° c en de druk tot 0,180 mbar en laat de monsters te drogen voor 46 h. Voor de laatste droging, zet de plank temperatuur tot 25 ° c en de druk tot 0,0035 mbar en laat de monsters te drogen voor 2 h. Bewaar de gelyofiliseerde monsters bij 4 °C.</li>
			<li>Om de monsters te hydrateren, voeg H2O, gelijk aan het bedrag van EV schorsing aanwezig in het begin (typisch, 400 µ l). Gebruik geen buffer voor rehydratie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. analyse na opslag
<ol><li>Om de enzymactiviteit te beoordelen, Verwijder eerst de vrije glucuronidase, die uit het EVs tijdens opslag kunnen gelekt hebben. Dit te bereiken door een extra stap van zuivering die wordt uitgevoerd, hetzij door SEC (zie stap 5) of asymmetrische flow veld-flow fractionering (AF4) (zie stap 8.1.2). Opmerking: Houd er rekening mee dat beide methoden leiden tot een verdunning van het EV-monster; Dus, gebruik voldoende EV concentraties voor opslag om te voorkomen dat zich onder de transatlantische kwantificering te beperken. Verwacht een 1:10 verdunning van de deeltjes als gevolg van SEC of AF4.<ol>
<li>Voor SEC-zuivering volgt u het hierboven beschreven Protocol (zie paragraaf 5).</li>
		<li>Voer AF4 zuivering uit.<ol>
<li>Stel het instrument in met behulp van een klein kanaal met een 350 µm spacer en een 30 kD molecuulgewicht cut-off cellulose membraan. Plaats een 0,1 µm poriegrootte filter tussen de HPLC pomp en het AF4 kanaal. Gebruik vers bereide 0,1 µm-gefiltreerde PBS als mobiele fase om de deeltjes lading en het lawaai in de licht-verstrooiende detectors te verminderen.</li>
			<li>Detecteren eiwitten met behulp van een UV-detector ingesteld op 280 nm. Voor het detecteren van deeltjes, het gebruik Multiangle lichtverstrooiing met de laser ingesteld op 658 nm.</li>
			<li>Gebruik de volgende methode van de looppas. Pre-focus voor 1 min met een focus stroom van 1 mL/min; dan, injecteren 300 µ L van het monster met een snelheid van 0,2 mL/min en houden de focus stroom voor 10 min. Na de injectie, elueer de steekproef bij 1 mL/min terwijl het toepassen van een dwarsstroom die van 2 mL/min tot 0,1 mL/min in de loop van 8 min. Elueer voor nog eens 10 min zonder dwarsstroom vermindert. Verzamel fracties van 1 mL, beginnend na 12,5 min en verder tot 27 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voer de glucuronidase assay uit zoals hierboven beschreven (zie paragraaf 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om de grootte en concentratie te beoordelen, gebruik de hierboven beschreven transatlantische (zie stap 2,5).</li>
	<li>Optioneel, uitvoeren TEM en SEM om de morfologie van de EVs na opslag te beoordelen (zie 5,3).</li>
</ol>

<ol><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).</li>
<li>Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+vesicles+for+drug+therapy+and+diagnostics%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges.</a> Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Goes, A., Fuhrmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenic+and+Biomimetic+Carriers+as+Versatile+Transporters+To+Treat+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections.</a> ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).</li>
<li>György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Applications+of+Extracellular+Vesicles%3A+Clinical+Promise+and+Open+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).</li>
<li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+bacteria-derived+vesicles+show+inherent+antimicrobial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity.</a> Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).</li>
<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+extracellular+vesicles+from+breast+cancer+cells+activates+VEGF+receptors+and+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis.</a> Nature Communications. 8, 14450(2017).</li>
<li>Bewicke-Copley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+released+following+heat+stress+induce+bystander+effect+in+unstressed+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+transfer+antigens+to+dendritic+cells+by+releasing+exosomes+containing+dead-cell-associated+antigens+partially+through+a+ceramide-dependent+pathway+to+enhance+CD4%28%2B%29+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses.</a> Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).</li>
<li>Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).</li>
<li>Rajappa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+Astrocytic+Tumor+Progression+Potentiated+by+JAK-mediated+Recruitment+of+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%3A+An+Official+Journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).</li>
<li>Umezu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+miR-135b+shed+from+hypoxic+multiple+myeloma+cells+enhances+angiogenesis+by+targeting+factor-inhibiting+HIF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1.</a> Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in coronary artery disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+HEK293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles for drug delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).</li>
<li>Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+things+come+in+small+packages%3A+Overcoming+challenges+to+harness+extracellular+vesicles+for+therapeutic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery.</a> Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).</li>
<li>Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+Human+Extracellular+Vesicle-Based+Therapeutics+for+Clinical+Use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).</li>
<li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+Storage+Stability+of+Extracellular+Vesicles+for+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).</li>
<li>Lőrincz, ÁM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+physical+and+functional+properties+of+extracellular+vesicles+derived+from+neutrophilic+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).</li>
<li>Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+protect+glucuronidase+model+enzymes+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).</li>
<li>Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+exosomes+at+room+temperature+using+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).</li>
<li>Kusuma, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Protect+and+to+Preserve%3A+Novel+Preservation+Strategies+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+loading+into+extracellular+vesicles+significantly+improves+the+cellular+uptake+and+photodynamic+effect+of+porphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins.</a> Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).</li>
<li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis%3A+a+variation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit manuscript presenteren we een uitgebreid protocol om de stabiliteit van EVs onder verschillende opslagomstandigheden te bestuderen. Met de combinatie van ingekapseld glucuronidase als een functionele uitlezing en de evaluatie van de fysisch-chemische parameters van het EVs, het protocol zorgt voor een eenvoudige opslag stabiliteit evaluatie van EVs en de vergelijking van EVs uit verschillende cel Lijnen. SEM en TEM als complementaire methoden maken een inzicht in de veranderingen van de EVs op de single-particle n...

EVs zijn membraan gebonden nanodeeltjes geproduceerd door bijna alle soorten cellen. Voor zoogdiercellen kan EVS worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen met verschillende productie trajecten1,2. Membraan blaasjes, met een grootte variëren van ongeveer 100-1000 nm, worden geproduceerd door directe ontluikende uit het celmembraan. Exosomes, sized 30-200 nm, zijn afgeleid van multivesiculaire lichamen gevormd door innerlijke ontluiken in endosomes die vervolgens fuseren met de celmembraan om meerdere Exosomes in een keer vrij te geven. De belangrijkste functie van deze blaasjes is het vervoer van informatie tussen cellen3. Voor dit doel, worden de ladingen zoals RNA, DNA, en proteïnen actief gesorteerd in hen. EVs kan brengen een verscheidenheid van effecten op hun doelstellingen, met implicaties voor zowel gezondheid en ziekte staat. Aan de ene kant, ze bemiddelen positieve effecten, zoals weefselregeneratie, antigeen presentatie, of antibiotica-effecten, waardoor ze veelbelovende doelen voor hun ontwikkeling als therapeutische4,5. Aan de andere kant, EVs kan bevorderen tumor vascularisatie6, omstanders effecten induceren in stressreacties7, en kan een rol spelen bij auto-immuunziekten8 en inflammatoire ziekten9. Aldus, zouden zij een zeer belangrijke component aan een beter begrip van vele pathologische gevolgen kunnen zijn. Echter, de aanwezigheid van veranderde EVS in diverse ziekten, zoals kanker10,11,12 en cardiovasculaire aandoeningen13, en hun gemakkelijke bereikbaarheid in bloed en urine maakt ze ideaal Biomarkers. Ten slotte, hun goede biocompatibiliteit14 en hun inherente targeting vermogen maken EVS ook interessant voor drug delivery15. In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de evaluatie van de opslag stabiliteit van EVs afkomstig van zoogdiercellen, een belangrijke eigenschap die nog weinig wordt onderzocht.
Voor de klinische ontwikkeling van EVs, zijn er nog vele hindernissen om16te overwinnen, met inbegrip van de evaluatie van hun therapeutische gevolgen, productie, reiniging, en opslag17. Terwijl-80 °C op grote schaal wordt gezien als de gouden standaard voor EV opslag18, de vereiste diepvriezers zijn duur, en het handhaven van de vereiste koude keten van de productie naar de patiënt kan worden uitdagend. Bovendien, sommige rapporten geven aan dat de opslag bij-80 °c nog steeds niet optimaal EVS behoudt en induceert een verlies in EV functionaliteit19,20. Andere methoden, zoals vriesdrogen21,22 of spray-droging23, zijn voorgesteld als mogelijke alternatieven voor de bevroren opslag van EVS.
De optimale manier om de opslag stabiliteit te beoordelen zou zijn om de EVs te testen in functionele assays of door de evaluatie van een specifieke marker, bijvoorbeeld, hun antibacteriële activiteit19. Dit is mogelijk wanneer het gewenste effect van de blaasjes bekend is en wanneer een afzonderlijke groep van EVs moet worden bestudeerd. Als EVs uit verschillende cel bronnen moet worden vergeleken (bijv. voor drug inkapseling) of als er geen bekende functionele uitlezing is, is het niet langer mogelijk om wijzigingen als gevolg van opslag op een directe manier te beoordelen.
Aan de andere kant, gewoon de evaluatie van veranderingen in hun fysisch-chemische parameters, zoals grootte, deeltjes herstel, en eiwitconcentratie, niet altijd voorspellen veranderingen in EV activiteit, zoals is aangetoond in een recent patent20.
Hier bieden wij een gemakkelijk toepasbare protocol voor het meten van de opslag stabiliteit van EVs door de beoordeling van hun fysisch-chemische parameters in combinatie met de activiteit van een ingekapseld Beta-glucuronidase enzym als een surrogaat voor de lading van de EVs. De lading van het enzym wordt gedaan door saponine incubatie, een milde methode die met EVS van verschillende bronnen21,24,25wordt gevestigd. Saponine vormen voorbijgaande poriën in de EV membraan, die het mogelijk maakt enzym opname in de blaasje. Als enzymen zijn geneigd om hun activiteit te verliezen als onderworpen aan ongunstige opslagomstandigheden, ze zijn een ideale surrogaat voor de evaluatie van het behoud van functionele ladingen van de EVs.
We hebben aangetoond dat de toepassing van dit protocol op EVs afgeleid van menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs), menselijke navelstreng endothelial cellen (HUVECs), en de menselijke adenocarcinoom alveolaire epitheelcellen (A549) inderdaad resulteren in grote verschillen in de stabiliteit van de opslag tussen verschillende cel lijnen, die in overweging zouden moeten worden genomen wanneer het kiezen van EV bron21.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; cell culture flasks</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>Gebruikt met 25 ml medium</td></tr><tr><td>30 kDa regenerated cellulose membrane</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 &micro;m spacer</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated fraction collector</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-glucuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher scientific</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Column oven</td><td>Hitachi High-Technologies Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 &micro;m, 47 mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>Gebruikt voor de bereiding van buffers voor AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3156</td><td>Endothelial Cell Growth basaal medium, gebruikt voor de serumvrije kweek van HUVEC-cellen</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>Endothelial Cell Growth medium, gebruikt voor de normale kweek van HUVEC-cellen</td></tr><tr><td>ELISA Plate Sealers</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY992</td><td>gebruikt voor het verzegelen van 96-well platen voor de glucuronidase assay</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher scientific</td><td>E/0665DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Extruder Set With Holder/Heating Block</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Filter support</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>gebruikt voor liposoombereiding</td></tr><tr><td>Fluorescein di-&beta;-D-glucoronide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH &amp; Co.KG</td><td></td><td>Gebruikt voor het pelleten van cellen bij 300 g</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH &amp; Co.KG</td><td></td><td>Gebruikt voor het pelleten van groter puin bij 3000 g</td></tr><tr><td>HUVEC cells</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>de buizen gebruikt voor alle EV-verwerking, werden gunstiger bevonden dan vergelijkbare producten van andere leveranciers met betrekking tot deeltjesherstel</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 uitgerust met een groene laser</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-software versie 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonaatmembranen</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>gebruikt voor liposoombereiding</td></tr><tr><td>PEEK Inline filter holder</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat flessen voor ultracentrifugering</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA Assay Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM koperroosters met koolstoffilm</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Small AF4 channel</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter-coater Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti ultracentrifugering rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex autosampler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex isocratische pomp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionex online vacuüm degasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV detector</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro;m pore size mixed cellulose filter</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>Gebruikt voor de filtratie van alle buffers die worden gebruikt met de EV's en in SEC</td></tr></tbody></table>

evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn veelbelovende doelen in het huidige onderzoek, om te worden gebruikt als drugs, drug-carriers, en biomarkers. Voor hun klinische ontwikkeling, niet alleen hun farmaceutische activiteit is belangrijk, maar ook hun productie moet worden geëvalueerd. In dit verband richt het onderzoek zich op het isoleren van EVs, hun karakterisering en hun opslag. Het huidige manuscript beoogt een gemakkelijke procedure te bieden voor de beoordeling van het effect van verschillende opslagomstandigheden op EVs, zonder genetische manipulatie of specifieke functionele analyses. Dit maakt het mogelijk om snel een eerste indruk van de stabiliteit van EVs te krijgen onder een bepaalde opslag conditie, en EVs afgeleid van verschillende bronnen van de cel kan gemakkelijk worden vergeleken. De stabiliteits meting is gebaseerd op de fysisch-chemische parameters van de EVs (grootte, DEELTJESCONCENTRATIE en morfologie) en het behoud van de activiteit van hun lading. De laatste wordt beoordeeld door de saponine-gemedieerde inkapseling van het enzym Beta-glucuronidase in de EVs. Glucuronidase fungeert als een surrogaat en zorgt voor een eenvoudige kwantificering via de splitsing van een fluorescerende reporter molecuul. Het huidige protocol kan een hulpmiddel voor onderzoekers in het zoeken naar opslagomstandigheden die optimaal te behouden EV eigenschappen om EV onderzoek naar klinische toepassing vooraf.

Figuur 1 toont de opslag karakteristieken van EVS geïsoleerd van HUVECs. EVs werden geïsoleerd door UC, glucuronidase werd ingekapseld, en na SEC, de gezuiverde EVs werden geëvalueerd voor hun fysisch-chemische eigenschappen door de transatlantische. Een steekproef van de blaasjes werd later onderworpen aan AF4 reiniging en de glucuronidase activiteit werd gemeten.
De blaasjes werden dan opgeslagen voor 7 d bij 4 °C of-80 °C en bij 4 °C in gelyofiliseerde vorm, in het laatstge...

Hier presenteren we een gemakkelijk toepasbare protocol om de opslag stabiliteit van de extracellulaire blaasjes te beoordelen, een groep van nature voorkomende nanodeeltjes geproduceerd door cellen. De blaasjes worden geladen met glucuronidase als model enzym en in verschillende omstandigheden opgeslagen. Na opslag worden de fysisch-chemische parameters en de activiteit van het ingekapseld enzym geëvalueerd.

Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

De opslagstabiliteit van extra cellulaire akeltjes is een belangrijke parameter voor hun prospectief therapeutisch gebruik. Ons protocol biedt een gemakkelijk toepasbare tool om te evalueren hoe opslag de vesicles beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat door de invoering van glucuronidase als een exogene marker, extracellulaire vesikels afgeleid van verschillende oudercellen een gemakkelijk te vergelijken met betrekking tot hun storvermogen.Asymmetrische stroomveld stroom fractionering, of AF4, is een mild alternatief voor grootte uitsluiting chromatografie zuivering voor zeer gevoelige verbindingen. Omdat de verbindingen minder pure stress tegenkomen in het kanaal. Omdat glucuronidase een gevoelig enzym is, profiteert de kwaliteit van de verblijven van een grondige planning en het uitvoeren van de stappen voor zuivering en analyse rug aan rug.Na het kweken van de cellijn van belang volgens de standaard voorwaarden voor die cellen, vervang de supernatant met serum vrij of extra cellulaire vesicle uitgeput medium en de cellen terug te keren naar de cel cultuur incubator voor een extra 24 tot 72 uur. Verzamel aan het einde van de incubatie de supernatant van e

evaluation-of-the-storage-stability-of-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Het protocol wordt een reproduceerbare methode ontworpen voor gebruik met cel cultuur supernatant voor het opsporen van oppervlakte epitopes op kleine extracellulaire blaasjes (EV) beschreven. Het maakt gebruik van specifieke EV immunoprecipitation met parels in combinatie met de antilichamen die surface antigeen CD9 herkent, CD63, en CD81. De methode is geoptimaliseerd voor downstream stroom cytometry analyse.

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Het onderhavige rapport belicht chronologische eisen voor extracellulaire vesicle (EV) isolatie van microglia of bloedmacrofagen. Microglia-afgeleide EV's werden geëvalueerd als regelgevers van de neurite uitgroei, terwijl bloed macrofaag-afgeleide EV's werden bestudeerd in de controle van C6 glioom cel invasie in in vitro testen. Het doel is om deze EV-functies als immuunbemiddelaars in specifieke micro-omgevingen beter te begrijpen.

Karakterisering van immuuncel-afgeleide extracellulaire vesicles en het bestuderen van functionele impact op celmilieu

Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.

Etikettering van extracellulaire blaasjes voor het monitoren van migratie en opname in kraakbeenexplantaten

Het huidige protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor isolatie, concentratie en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit cyanobacteriële culturen. Benaderingen voor het zuiveren van blaasjes uit culturen op verschillende schalen, afwegingen tussen methodologieën en overwegingen voor het werken met veldmonsters worden ook besproken.

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

We presenteren een protocol voor de isolatie en bevriezing van extracellulaire blaasjes (EV's) afkomstig van kankerachtige urotheelcellen. De freeze-fracture-techniek onthulde de diameter en vorm van de EV's en - als een uniek kenmerk - de interne organisatie van de EV-membranen. Deze zijn van immens belang om te begrijpen hoe EV's interageren met de membranen van de ontvanger.

Freeze-Fracture Elektronenmicroscopie voor extracellulaire vesikelanalyse

Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.

Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het sorteren van extracellulaire blaasjes (EV's) die vrijkomen door mesenchymale stromale cellen. Het richt zich met name op de instelling van het instrument en de optimalisatie van de sorteeromstandigheden. Het doel is om extracellulaire blaasjes te sorteren met behoud van hun kenmerken.

Een succesvolle sortering instellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Hier demonstreren we de karakteriseringsmethode voor extracellulaire blaasjes (EV's) verzameld uit biologische vloeistoffen, zoals tranen en speeksel, van menselijke proefpersonen. De scanner die bij deze methode wordt gebruikt, is in staat om het fenotype, de grootte en het totale aantal deeltjes van EV's van 1 μL van het monster te detecteren.

Karakterisering van extracellulaire blaasjes uit biologische vloeistoffen

Leer een protocol voor het evalueren van opslagstabiliteit van extracellulaire blaasjes met glucuronidase als marker. AF4-purificatie minimaliseert schuifspanning en maakt vergelijking tussen verschillende celtypen mogelijk.

Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Meer video's verkennen