Een roman en translationeel rat model van hersenschudding combineren van kracht en rotatie met in vivo cerebrale Microdialyse

Deze methode creëert een paradigma voor toekomstige studies door onderzoekers te voorzien van een betrouwbaar en translationeel model van hersenschudding dat longitudinale karakterisering van de moleculaire effecten van hersenschudding mogelijk maakt. Dit ratmodel combineert microdialyse waardoor continue analyte kwantificering mogelijk is met een wigwraptechniek die snelle versnelling en vertraging van het hoofd en de romp uitoefent en een essentieel kenmerk van menselijk craniocerebraal trauma nabootst. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot therapeutische studies van hersenschudding als het biedt een waardevolle kans om het mechanisme en de werkzaamheid van farmacologische agentia in vivo en ononderbroken te bestuderen.

Het wordt ten zeerste aanbevolen om te werken in teams van twee tijdens de hersenschudding en schijninductie stappen van deze methode om manipulatie fouten te beperken en de efficiëntie te maximaliseren tijdens het experiment. Het aantonen van de procedure zal Chloe Provost zijn, een technicus in ons laboratorium. Om de procedure te beginnen, scheert u het hoofd van het dier met behulp van een elektrische tondeuse.

Reinig het geschoren gebied met een oplossing van 2%isopropylalcohol en 2%chlorhexidine gluconaat drie keer. Breng vervolgens smeerbare oogzalf aan om droogte tijdens anesthesie te voorkomen. Plaats de rat vervolgens in een stereotaxic-apparaat.

Steek de oorbalken met grote zorg in de gehoorkanalen en draai de neusklem aan. Bevestig daarna een 26-meters roestvrijstalen geleidekanule aan de houderarm op het stereotaxic-apparaat. Maak een middellijn incisie van drie centimeter op de hoofdhuid.

Laat de schedel vrij door het installeren van vier klemmen rond de incisie. Schraap het periosteum stevig van de schedel met het chirurgische mes tot de bregma- en lambdahechtingen zichtbaar zijn. Als er bloeden, handhaven stevige druk op de schedel met een gaasje of katoen getipt applicator.

Bevestig of de schedel correct is uitgelijnd op het stereotaxic-apparaat door de dorsoventrale coördinaten van de bregma- en lambda-hechtingen te vergelijken. Identificeer de anteroposterior, mediolaterale en dorsoventrale coördinaten van de bregma hechting als de referentiepunten voor de coördinaten van de geleide canule. Bereken vervolgens de coördinaten van de bregma-hechting als referenties en bereken de coördinaten van de implantatieplaats van de geleide canule in de hippocampus.

Markeer de precieze implantatieplaats met behulp van een markering. Boor vervolgens een gat met een diameter van 0,5 millimeter door de schedel op de doelplaats van de geleide canule. Boor drie andere gaten ongeveer vijf millimeter rond dit punt om drie ankerschroeven in de schedel te rijgen die de canule zal stollen nadat acryl tandcement wordt toegepast.

Steek vervolgens de canule in de hippocampus en bevestig deze met tandcement. Wees voorzichtig niet te morsen overtollige tandcement rond de plaats waar het gewicht zal worden gedropt. Laat het cement twee minuten drogen en verwijder vervolgens de houderarm uit de canule.

Plaats een roestvrij stalen verwijderbare obturator in de canule om te voorkomen dat hersenvocht doorsijpelt en risico's van infectie. Verwijder daarna de vier klemmen, trek de ingetrokken huid terug en steek deze met een chirurgische hechtingsdraad. Verwijder vervolgens de rat uit het apparaat en injecteer Buprenorfine onderhuids om pijn te behandelen.

Plaats het knaagdier terug in zijn kooi met een verwarmingskussen eronder totdat het bij bewustzijn komt. Breng het vervolgens terug naar de dierenopvang voor een herstelperiode van zeven dagen onder nauwlettend toezicht. Verwijder in deze procedure de obturator uit de canule en steek langzaam een microdialysesonde in.

Bevestig vervolgens de sondeassemblage op een roestvrijstalen veer die vastkomt aan een vloeibare draaibare en tegenwichthefwapen met een ringstandaard en klemmen, zodat het dier zich vrij in zijn kooi kan bewegen. De aangebonden ratten hebben ad libitum toegang tot voedsel en water tijdens de gehele microdialyse procedure. Gebruik een micro-infusiepomp om perfusate te leveren aan de sonde en het dialysaat te verzamelen van de gesmolten silica uitlaatlijn.

Ten minste een uur en 30 minuten voordat de procedure begint, zet de sonde op de werkstroomsnelheid met een microliter per minuut. Controleer of de stroomsnelheid van de sonde consistent is door het volume in de loop van de tijd te meten met een pipet. Verzamel daarna elk dialysaatmonster in een voorgeladen fractie flacon met één microliter van 0,25 mol per liter perchloorzuur om afbraak van analyten te voorkomen.

Bewaar het monster op vier graden Celsius voor latere analyse. Zodra het laatste monster is verzameld, verwijder de microdialyse sonde uit de canule en de obturator opnieuw in te voeren voordat de rat terugkeert naar de dierenverzorgingsfaciliteit. Om het hersenschuddingapparaat te installeren, plakt u een aluminium plaat stevig vast aan een U-vormig plexiglasframe dat een schuimkussen bevat.

Gebruik een scherp scheermesje om spleten te maken in de aluminium plaat. Tape de sleuven aluminium plaat. Plaats vervolgens het plexiglasframe onder een PVC geleidebuis.

Houd de PVC geleidebuis op zijn plaats met een klemstandaard op 3-1/2 centimeter boven het sleuf aluminium. Bevestig een nylon vlieg vislijn door de metalen lus, zodat de onderkant van het gewicht is op 2-1/2 centimeter over de sleuven aluminium om meerdere klappen te voorkomen wanneer de rat valt op het schuim kussen na de botsing. Bevestig vervolgens de nylon vliegvislijn aan de klemstandaard.

Trek het gewicht door de PVC-buis met de nylon vliegvislijn. Houd het op zijn plaats door het invoegen van een hex sleutel door de voorlopige geboorde gaten op een meter boven de sleuven aluminiumfolie. Om een hersenschudding op te wekken, plaatst u het dier op zijn borst op de gegroefde aluminium plaat, zodat zijn hoofd direct in het pad van het kopergewicht wordt geplaatst.

Verwijder de neuskegel en trek aan de hex-toets. Het gewicht zal verticaal door de PVC-buis vallen en de kop van de rat beïnvloeden. Als gevolg hiervan zal de rat ondergaan een snelle 180 graden rotatie en land op zijn rug.

Haal de rat uit het schuimkussen en leg hem op zijn rug in de kooi. Gebruik een digitale timer om de juiste reflextijd te meten als een teken van herstel en letsel ernst. De juiste reflex tijd is de totale tijd van de impact tot de rat wakker wordt en spontaan keert terug naar de gevoelige positie of begint te lopen.

Let op tekenen van overlijden, breuk of bloeding. Voor schijninductie, plaats het dier op zijn borst op de sleuf aluminium plaat, zodat zijn hoofd ligt direct in het pad van het kopergewicht. Verwijder de neuskegel en verwijder het dier vervolgens van de aluminium plaat zonder aan de hex-toets te trekken.

Plaats de rat daarna op zijn rug in de kooi. Gebruik een digitale timer om de juiste tijd te meten als een indicator van neurologische restauratie. Dieren uit de gewonde groep had een aanzienlijk verhoogde juiste tijd gemiddeld versus sham gevallen en leek verbijsterd bij het herwinnen van het bewustzijn.

Van de 10 gevallen van de hersenschudding groep, slechts een dier vertoonde kleine tekenen van bloeding onder de impact site na de gewichtsval. Significante toenames van extracellulaire glutamaatconcentraties werden waargenomen in de hippocampal CA1-regio gedurende de eerste 10 minuten na trauma-inductie in vergelijking met schijnletsel. Vergeet niet tijdens de hersenschudding inductie voorkomen dat de invloed van de canule met het gewicht als dit zou leiden tot verwondingen aan de kern van de rat die aanzienlijk ernstiger zijn dan een hersenschudding.

Deze methode kan worden toegepast op de studie van herhaalde hersenschuddingen, omdat de procedure een nauwe hoofdletsel is dat op dezelfde dieren op verschillende tijdstippen kan worden herhaald.