Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis
30 april 2019
We presenteren een vrij eenvoudige en gevoelige methode voor nauwkeurige kwantificering van de dichtheid van de gal duct in de lever van de muis. Deze methode kan helpen bij het bepalen van de effecten van genetische en omgevings modificatoren en de effectiviteit van mogelijke therapieën in muizen modellen van galziekten.
Dit protocol stelt de onderzoeker in staat om galkanaalontwikkeling te kwantificeren in muismodellen van leverziekte. Het maakt het ook mogelijk voor de evaluatie van de effecten van genetische modifiers op galkanaal ontwikkeling. Het voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, gevoelige en kwantitatieve methode is voor de directe beoordeling van de ontwikkeling van galwegen.
Om te beginnen, met de huid strak gehouden door tangen, gebruik kleine schaar om een dwarse incisie ongeveer een centimeter onder de ribbenkast van een geëuthanaseerde muis te maken. Stel het hele ventrale oppervlak van de lever bloot. Gebruik kleine schaar om zorgvuldig te snijden door de ligamenten die de lever aan de andere organen in de buik.
Vervolgens, snijd door de gemeenschappelijke galkanaal om de lever los te maken van de darm. Houd de galblaas vast en verwijder voorzichtig de lever. Plaats het onmiddellijk in een 50 milliliter buis gevuld driekwart met 4%paraformaldehyde.
Om het leverweefsel te repareren, incubeer het in 4%PFA bij vier graden Celsius gedurende 48 uur. Na een reeks ethanol wast, was de lever met clearing agent drie keer gedurende 30 minuten elk bij kamertemperatuur. Om te beginnen met inbedden, was een weefsel cassette in een weefsel schimmel drie keer gedurende 30 minuten in paraffine wax voorverwarmd tot 60 graden Celsius.
Vul vervolgens de weefselmal met paraffinewas tot driekwart hoogte en bewaar deze op een verwarmingsblok op 60 graden Celsius. Plaats de lever in de mal met de ventrale kant naar boven gericht. Na het zorgvuldig verwijderen van de mal uit het verwarmingsblok, plaats de bovenkant van de cassette op de mal.
Top af met hete vloeibare paraffine en laat het afkoelen tot kamertemperatuur 's nachts. Na het verwijderen van het leverblok uit de mal, gebruik een microtome om te beginnen met het doorsneed door de oppervlakkige rugzijde van de lever, waardoor vijf micrometersecties. Controleer de oppervlakkige secties onder een dissectiemicroscoop om ervoor te zorgen de secties niet worden gevouwen of gevouwen.
Als u dia's voor immunohistochemie wilt verwerken, selecteert u één dia per te analyseren genotype en 15 minuten wassen in xyleen, 100%ethanol, 95% ethanol en ten slotte 70%ethanol. Na het wassen van de glijbaan in het geïoniseerde water, dompel het onder in Tris-gebaseerde hoge pH antigeen retrieval oplossing. Dan, verwarm het onder druk in een snelkookpan gedurende drie minuten op 10 pond per vierkante inch.
Nadat u de dia hebt laten afkoelen tot kamertemperatuur, gebruikt u een PAP-pen om de secties op de dia te schetsen. Na het wassen met PBS Tween, blokkeer de weefselsecties door 100 microliters van blokkerende oplossing per sectie toe te voegen en incbaat behandeld bij vier graden Van Celsius gedurende één uur toe te voegen. Breng 100 microliter van de verdunde antilichaamoplossing aan die alle drie de primaire antilichamen op elke sectie bevat en broed ze 's nachts bij vier graden Celsius uit.
Voeg na het wassen van de glijbanen 100 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe die zowel secundaire antilichamen bevat als een uur lang bij kamertemperatuur incuvoeert. Tot slot, breng montagemedium en een coverslip aan op de dia's. Gebruik een fluorescerende microscoop om 20x beelden te maken bij 1x zoom van elke sectie.
Zorg ervoor dat elke poortader over de lever wordt afgebeeld. Maak een spreadsheet met de volgende kolommen:Dier/Voorbeeldnummer, Afbeeldingsnummer, aantal portaladders en het aantal galwegen. Identificeer en noteert het aantal portaladders per afbeelding voor elke afbeelding.
Identificeer vervolgens octrooigalewegen in elk beeld, door de aanwezigheid van cholangiocyten rond een definieerbaar lumen. Deze structuren moeten worden gescheiden door mesenchyme van andere breedspectrum cytokeratine-positieve cellen. Een belangrijke uitdaging van deze techniek is het identificeren van octrooigale kanalen.
Het bepalen van wat een octrooikanaal is vereist een analyse van de vorm van het kanaal en de cellen rond het lumen. Tel elk octrooigalekanaal en plaats in dezelfde kolom als het afbeeldingsnummer en herhaal voor elke poortaderafbeelding. Bereken ten slotte de som van alle portaladders en alle galwegen in het levermonster en bereken de galkanaal-poort-poortaderverhouding voor het levermonster.
P30 muis levers werden gesectied en mede-gekleurd voor CK8 en CK19 samen met de vasculaire marker, alpha-SMA, om de BD-PV-verhouding te bepalen. Wanneer alle portaaladeren in elke leverkwab worden afgebeeld, werden portaladders gedefinieerd als alfa-SMA bevlekte vaten met aangrenzende cytokeratininvlekken met een breed spectrum. De alfa-SMA vlekstructuren zonder breedspectrumcytokeratine waren centrale aderen die van de analyse werden uitgesloten.
Octrooikanalen hebben een duidelijk definieerbaar lumen dat wordt omringd door breedspectrumcytokeratine-positieve cholangioctyes en zijn meestal gescheiden van nabijgelegen kanalen of cholangiocyten door mesenchyme. Breedspectrum cytokeratine-positieve cellen die geen definieerbaar lumen hebben, worden niet meegeteld voor het totale aantal galwegen. Lever sectie van een wild-type dier toont een portaal ader geassocieerd met een volledig octrooikanaal, samen met een aantal niet-opgenomen cellen.
Representatieve lever sectie van een JAG1 heterozygoot dier toont geen octrooi galwegen aanwezig zijn rond de drie portaal aderen. Alle breedspectrumcytokeratine-positieve cellen hier zijn niet opgenomen en daarom niet mogen worden geteld. Analyse van de BD-pv-verhouding voor drie wilde en drie JAG1 heterozygoot dieren laat zien hoe de twee genotypen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden op basis van galkanaaltellingen.
Het is belangrijk om alle portaalschepen voor galwegen te beoordelen. Het is vooral van cruciaal belang voor het bepalen van galkanaaldichtheid als er fenotypische variabiliteit over de lever. Deze techniek werd gebruikt om een genetische suppressor van het galfenotype te identificeren in een muismodel van Helgason.
Daarom kan het nuttig zijn bij het beoordelen van de behandelingsmodaliteiten van diermodellen van galziekte.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt het mogelijk om de ontwikkeling van galgangen te kwantificeren in muismodellen van leverziekten. Het is een eenvoudige, gevoelige en kwantitatieve methode voor het beoordelen van de dichtheid van galgangen, wat kan helpen bij het evalueren van genetische en omgevingsfactoren bij galwegziekten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Leverziekteonderzoek
Achtergrond
- De dichtheid van de galgangen is cruciaal voor het begrijpen van de leverfunctie.
- Muismodellen worden veelvuldig gebruikt om leverziekten te bestuderen.
- Genetische modifiers kunnen de ontwikkeling van de galgangen beïnvloeden.
- Nauwkeurige kwantificatiemethoden zijn nodig voor effectief onderzoek.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van de dichtheid van de galgangen.
- Om de impact van genetische en omgevingsfactoren te beoordelen.
- Om potentiële therapieën in muismodellen te evalueren.
Gebruikte methoden
- Transversale incisie gemaakt onder de ribbenkast van een geëuthanaseerde muis.
- Blootstelling van het ventrale oppervlak van de lever.
- Voorzichtige dissectie van de ligamenten die de lever met andere organen verbinden.
- Kwantitatieve beoordeling van de dichtheid van de galgangen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van de dichtheid van de galgangen is bereikt.
- De methode heeft gevoeligheid en nauwkeurigheid aangetoond.
- Potentiële toepassingen bij het evalueren van therapieën voor galwegziekten.
- Inzichten in genetische modifiers die de ontwikkeling van de galgangen beïnvloeden.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van de dichtheid van de galgangen.
- Het kan onderzoek naar genetische en omgevingsinvloeden faciliteren.
- Een veelbelovend instrument voor het beoordelen van therapeutische interventies bij leverziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor management
Kwantitatieve beoordeling van de ontwikkeling van de galgangen maakt mechanische risicoreductie mogelijk in preklinische modellen van cholestatische leverziekten. Deze methode ondersteunt target-validatie door een reproduceerbare, genotype-onafhankelijke analyse van bilaire fenotypes te bieden. Het faciliteert portefeuilletriage door wild-type modellen te onderscheiden van ziektemodellen op basis van de ratio tussen galgangen en poortaders.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de galgangdichtheid te kwantificeren als functionele uitkomstmaat van de rijping van cholangiocyten.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde, op microscopie gebaseerde assay voor het vergelijken van de galwegontwikkeling over verschillende genotypen en experimentele condities.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door genetische modificaties te correleren met galwegfenotypen in ziekterelevante systemen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve ratio's van galgangen ten opzichte van poortaders, waardoor een objectieve vergelijking van de vorming van ductulaire reacties mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van cytokeratine-immunokleuring en lichtmicroscopie, wat een schaalbare en reproduceerbare workflow biedt voor de analyse van meerdere leverkwabben.
- Klaar voor assay: Produceert numerieke outputs die geschikt zijn voor high-content screening en cross-functionele gegevensuitwisseling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door menselijke galwegdefecten, zoals het Alagille-syndroom, in muizenlevers te modelleren.
- Operationele waarde: Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door consistente coupes- en beeldvormingsprotocollen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de fenotypische ernst en suppressor-effecten in genetische modellen te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in discovery biology-workflows door een kwantitatief eindpunt te bieden voor de beoordeling van de galwegontwikkeling voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de dichtheid van de galgangen te meten als fenotypische output van genetische manipulaties.
- Screening: Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays mogelijk via systematische beeldvorming van alle poortaders in de leverkwabben.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (aantal galgangen per poortader), waardoor statistische vergelijkingen tussen condities mogelijk zijn.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door menselijke galwegziekte-fenotypes in muizen te modelleren.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Creëert een herbruikbare mogelijkheid voor het evalueren van galwegtoxiciteit of herstel in meerdere ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door ambiguïteit bij de beoordeling van het galwegfenotype te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde procedures voor doorsnijden, kleuren en tellen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van targets die betrokken zijn bij galwegontwikkelingspaden mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde prioritering door de getrouwheid van het ziektemodel en de therapeutische respons te kwantificeren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in histologie, immunohistochemie en lichtmicroscopie voor een nauwkeurige identificatie van de galgangen.
- Afhankelijk van infrastructuur voor paraffine-inbedding, microtoom-snijden en antigeen-retrieval.
- Vereist standaardisatie tussen teams bij beeldacquisitie en dataregistratie om vergelijkbaarheid te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten antilichaamvalidatie en consistentie in de definitie van het lumen over verschillende modelsystemen heen.
- Praktische beperking: De driedimensionale structuur van de galboom kan niet worden gevisualiseerd, waardoor de beoordeling beperkt blijft tot de tweedimensionale gangdichtheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Mouse Liver Tissue Collection
1:19
Fixation, Paraffin Embedding, and Liver Block Sectioning
2:35
Immunohistochemistry for Wide-spectrum Cytokeratin (wsCK) and αSMA
4:08
Imaging and Quantification of Bile Ducts (BDs)
5:27
Results: Determining BD to PV Ratio
7:00
Conclusion
