Massa spectrometrie gebaseerde Proteomics Analyses met behulp van de OpenProt Database te onthullen nieuwe eiwitten vertaald uit niet-canonieke Open lezing Frames
11 april 2019
OpenProt is een vrij toegankelijke databank die wordt afgedwongen door een polycistronic model van eukaryotische genomen. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van OpenProt databases wanneer ondervragen massaspectrometrie datasets. Met behulp van OpenProt zorgt database voor analyse van proteomic experimenten voor de ontdekking van de roman en eerder niet detecteerbaar eiwitten.
OpenProt is de eerste database die een polysystronic annotatie van eukaryotische genomen mogelijk maakt, het coderingspotentieel van proto-genen herkent en de ontdekking van voorheen niet-detecteerbare eiwitten mogelijk maakt. We hebben dit protocol zo ontworpen dat het toegankelijk is voor alle gebruikers zonder dat uitgebreide bio-informatica vaardigheden Het plaatst in wezen proteomische ontdekkingen binnen de greep van iemand. Om de huidige uitdagingen in de geneeskunde te begrijpen en aan te pakken, moeten we het proteomische landschap en alle actoren en hun dynamiek volledig begrijpen.
OpenProt biedt die mogelijkheid. Hoewel hier, OpenProt wordt gebruikt voor de analyse van patonomische experimenten, het kan ook worden gebruikt met andere systemen als het biedt gewoon een meer duidelijke definitie van het proteoom. Begin met het openen van de OpenProt-website en het gebruik van de link vanuit het bovenste paginamenu om de downloadpagina te openen.
Klik op de soorten die van belang zijn op basis van de experimentele gegevens van de analyses en het gewenste eiwittype. Klik op AllProts, Isoforms en RefProds om bestanden te genereren met alle bekende en nieuwe eiwittypen die aanwezig zijn in de OpenProt-database en klik indien beschikbaar op de annotatie waaruit de eiwitsequenties worden getrokken. Klik op het niveau van ondersteunend bewijs dat nodig is voor de eiwitoverweging volgens de onderzoeksdoelstelling.
Klik vervolgens op alle voorspelde bestanden met alle OpenProt-voorspellingen en klik op de gewenste bestandsindeling om te downloaden. Selecteer voor proteomische anayses het FASTA-eiwitbestand. Het leesme-bestand bevat alle benodigde informatie in de bestandsindeling.
Log in op een geschikte instantie voor proteomics-gereedschap en maak een nieuwe geschiedenis voor databaseverwerking. Als u de gedownloade OpenProt-database wilt importeren, klikt u op Uploaden. Als u de werkstroom voor databaseafhandeling wilt invoeren, gaat u naar de werkstroompagina, klikt u nogmaals op Uploaden en klikt u op De werkstroom uitvoeren.
Selecteer vervolgens de geïmporteerde OpenProt-database als invoer en wijzig het verkregen Fasta-bestand in iets zinvols. De database is klaar om te worden gebruikt voor proteomics analyses. Open voor de voorbereiding van massaspectrometriebestanden de vrij beschikbare MS-convertertool vanuit de proteo-wizardsuite en upload het te analyseren gegevensbestand.
Selecteer de map voor de uitvoer en stel de gewenste bestandsindeling in op mzML en gebruik het op basis van het wavelet gebaseerde algoritme op massaspectrometrieniveaus één en twee om een piekpickingfilter te selecteren en de conversie te starten. Maak voor eiwitkwantificering een nieuwe geschiedenis en sleep en drop de eerder gemaakte database in de nieuwe geschiedenis. Klik op Uploaden om het getransformeerde mzML-gegevensbestand te importeren.
Open de werkstroompagina, klik nogmaals op Uploaden om de gewenste werkstroom te importeren en selecteer de werkstroom om de verschillende parameters te controleren. Selecteer het geïmporteerde mzML-gegevensbestand en voer de eerder gemaakte database in als het Fasta-databasebestand. Aangezien de workflow gebruik maakt van de X!
Tandem zoekmachine, klik op Uploaden om de X te importeren! Tandem standaardconfiguratiebestand. Om rekening te houden met de aanzienlijke toename in omvang bij het gebruik van de hele OpenProt databse gebruik maken van een strenge false discovery rate.
Voer voor kwaliteitscontrole het hulpprogramma bestandsgegevens uit op de id-filteruitvoer om algemene prestatiestatistieken te bieden, zoals het aantal peptidespectrumovereenkomsten of het aantal geïdentificeerde peptiden en eiwitten. Voor OpenProt database mining, terug te keren naar de OpenProt website en open de zoekpagina. Klik op de soorten waarvoor het eiwit is geïdentificeerd en voer het eiwittoetredingsnummer in de eiwitquerybox in.
Klik op piek en er verschijnt een tabel met basisinformatie voor het opgevraagde eiwit. Klik vervolgens op de koppeling Details. De nieuw geopende pagina bevat een genoombrowser die is gecentreerd op het opgevraagde eiwit, evenals andere informatie.
Om eiwit- of DNA-sequenties te verkrijgen, klikt u op de eiwit- of DNA-koppelingen van respectievelijk de infotabbladen, respectievelijk klik vervolgens op de tabbladen om door de gedetailleerde informatie over de massaspectrometriebewijs te bladeren, ribosoom profileringsdetectie en conserverings- en geïdentificeerde eiwitdomeinen. In deze representatieve anlyse werden de meeste in het oorspronkelijke papier geïdentificeerde eiwitten ook geïdentificeerd met behulp van de OpenProt-2_pep of de OpenProt_all-database, waaruit blijkt dat OpenProt-databases in staat zijn om eiwitidentificatie en kwantificering te produceren die vergelijkbaar is met die van de huidige procedures op basis van de InterPro KB-databases. 11 goed ondersteunde eiwitten die nog niet zijn geannoteerd in databases werden geïdentificeerd in alle datasets met zelfverzekerde peptiden met behulp van de OpenProt 2_pep database.
29 nieuwe eiwitten werden ontdekt in alle datasets met zelfverzekerde peptiden met behulp van de OpenProt_all database. De aanbevolen strenge false discovery rate had geen invloed op de meest zelfverzekerde eiwitidentificaties, hoewel het het totale aantal geïdentificeerde eiwitten wel daalde. Een nieuw eiwit werd ontdekt als een interactor van de Raf-1 eiwit.
Deze eiwitten waren niet eerder ontdekt door massaspectrometrie of ribosoomprofilering en toonden een goed kwaliteitsspectrum aan. Vergeet niet om ervoor te zorgen dat de geselecteerde parameters zijn geschikt voor het experimentele ontwerp en controleer altijd de kwaliteit van het sportbewijs bij het melden van nieuwe eiwit ontdekkingen. Dit protocol is aanpasbaar aan alle top-down proteomics experimenten met name bij gebruik met functionele proteomics.
Dit zal veel diepe screening en begrip van eiwit interacties en cellulaire trajecten mogelijk te maken. OpenProt benadrukt de aanzienlijke onderschatting van het protomische landschap doorgegeven door de huidige genomische notaties en benadrukt de polysystronic aard van eukaryotische genen. Het is een hele nieuwe weg voor onderzoek.
Het mooie van dit protocol is dat het geen uitgebreide bio-informaticavaardigheden vereist en dat omdat het verre servers gebruikt, het op elke computer kan worden uitgevoerd.
Overzicht
OpenProt is een baanbrekende database die een polycistronisch model van eukaryotische genomen ondersteunt en de ontdekking van eerder niet-detecteerbare eiwitten mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft hoe OpenProt-databases te gebruiken voor het analyseren van massaspectrometriegegevens, waardoor proteomische ontdekkingen toegankelijk worden voor onderzoekers zonder uitgebreide bioinformatica-vaardigheden.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Genomics
- Bioinformatica
Achtergrond
- OpenProt maakt polysystronische annotatie van eukaryotische genomen mogelijk.
- Het herkent het coderende potentieel van proto-genen.
- De database verbetert het begrip van het proteomische landschap.
- Het biedt een duidelijker definitie van het proteoom voor verschillende analyses.
Doel van het onderzoek
- Een protocol presenteren voor het gebruik van OpenProt in proteomische analyses.
- De identificatie van nieuwe eiwitten via massaspectrometrie mogelijk maken.
- Proteomische analyse toegankelijk maken voor gebruikers met verschillende niveaus van expertise.
Gebruikte Methoden
- Toegang tot de OpenProt-database en selectie van soorten van belang.
- Het downloaden van eiwitbestanden in verschillende formaten voor analyse.
- Gebruik van MS convert-tool voor voorbereiding van massaspectrometriegegevens.
- Het gebruik van workflows voor eiwitkwantificering en identificatie.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van 29 nieuwe eiwitten en 11 goed ondersteunde eiwitten die niet eerder waren geannoteerd.
- Vergelijkbare eiwitidentificatie aangetoond met bestaande databases.
- De onderschatting van het proteomische landschap door huidige genomische annotaties benadrukt.
- Aangetoond dat het protocol aanpasbaar is voor verschillende proteomics-experimenten.
Conclusies
- OpenProt verbetert de ontdekking van eiwitten in eukaryotische genomen aanzienlijk.
- Het protocol is gebruiksvriendelijk en vereist geen uitgebreide bioinformatica-vaardigheden.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in proteomics en functionele studies.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Current genome annotations underestimate the eukaryotic proteome by imposing arbitrary ORF length and single-ORF-per-transcript constraints, limiting target discovery in early drug development. OpenProt addresses this gap by enabling polycistronic annotation, revealing novel proteins from non-canonical ORFs that may represent underexplored therapeutic targets or off-liability risks. This expands the target validation landscape and improves predictive confidence in preclinical target selection by reducing false negatives in proteomic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins translated from non-coding regions, 5'/3' UTRs, or overlapping CDSs, clarifying proteome complexity.
- Operational Value: Supports functional target validation through detection of novel proteins with mass spectrometry evidence, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by uncovering proteins with potential disease relevance, improving confidence in target prioritization decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by providing comprehensive protein sequence databases that reflect the true proteomic landscape.
- Operational Value: Improves assay standardization and reproducibility through use of species-specific, evidence-tiered OpenProt databases in mass spectrometry workflows.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by reducing false negatives in proteomic screens via expanded search space with appropriate FDR controls.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by identifying novel proteins expressed in models used for preclinical validation, linking discovery to functional outcomes.
- Mechanistic De-risking: Facilitates biomarker alignment by detecting proteins with conserved domains or interaction profiles, such as the Raf-1 interactor, enabling pathway-level validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing proteins missed in conventional annotations, reducing late-stage biological surprises.
Pipeline & Workflow Integration
OpenProt integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enhancing proteome-wide screening with minimal bioinformatics overhead.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying proteins from non-canonical ORFs that may modulate disease-relevant signaling networks.
- Screening: Enhances assay readiness and quantitative output reliability by enabling comprehensive database searches with controlled FDR, improving detection of low-abundance or novel targets.
- Analytics: Generates peptide spectrum matches, protein identification, and quantification data that allow cross-condition comparison and target validation.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying proteins with conservation, domain architecture, or interaction evidence relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic knowledge base across species and projects, reducing redundant database curation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing the polycistronic nature of eukaryotic genes and reducing false negatives in proteomic discovery.
- Operational Value: Promotes standardization and scalability through freely accessible, species-specific protein databases compatible with mainstream proteomics tools.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of high-confidence novel targets, reducing investment in false leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by expanding the target space with evidence-based novel proteins, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires basic proteomics expertise in mass spectrometry data handling and database searching, though no advanced bioinformatics skills are needed.
- Necessitates access to proteomics tools capable of importing FASTA databases and running search engines like X!Tandem with custom workflows.
- Demands cross-team standardization on FDR thresholds and database versions (e.g., OpenProt_all vs OpenProt_2_pep) to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations when applying the database to non-model organisms or specialized sample types, guided by evidence level selection.
- Includes practical limitations such as increased database size requiring stringent FDR settings to maintain identification confidence, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
OpenProt Database Download
1:53
Database Handling
2:41
Mass Spectrometry File Preparation
3:13
Protein Quantification
4:13
Quality Control and OpenProt Database Mining
5:25
Results: Representative Interactor and Mass Spectrometry Identification of a Novel Protein
6:40
Conclusion
