Naar buiten kijken: isolatie van Cyanobacteriële vrijgekomen Koolhydraatpolymeren en eiwitten

Deze protocollen die we ontwikkelden zijn belangrijk om de afscheidingsmechanismen in cyanobacteriën en hun vrijgekomen producten te bestuderen, namelijk de extracellulaire koolhydraatpolymeren en eiwitten. De geproduceerde kennis stelt ons in staat om deze producten aan te passen voor verschillende toepassingen, namelijk biotechnologische en biomedische toepassingen. Deze protocollen zijn zeer eenvoudig.

Ze kunnen worden afgestemd op het producerende organisme, de behoeften van de gebruiker en de uiteindelijke toepassing van het product. Het belangrijkste voordeel van deze protocollen is dat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere levende systemen, met name aan andere bacteriën. Deze protocollen zijn eenvoudig.

Echter, men kan nodig zijn om een aantal veranderingen in te voeren, afhankelijk van de bacteriële stam of de mate van zuiverheid vereist. Om te beginnen cultiveren de cyanobacteriële stam onder standaard omstandigheden. Groei meten met behulp van standaardprotocollen.

Breng vervolgens de cultuur over in dialysemembranen en dialyseren tegen een minimum van 10 volumes gedeïïmiseerd water gedurende 24 uur met continu roeren. Centrifuge de cultuur op 15.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatant naar een nieuwe flacon, en gooi de pellet.

Centrifuge opnieuw op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten om verontreinigingen te verwijderen, zoals celwandpuin of lipopolysacchariden. Na de centrifugatie, breng de supernatant naar een glazen beker, en gooi de pellet. Om het polymeer te neerslaan, voeg twee volumes van 96% ethanol toe aan de supernatant en broed de suspensie 's nachts bij vier graden Celsius uit.

Voor kleine of niet zichtbare hoeveelheden neergeslagen polymeer, centrifugeren de suspensie op 13.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 25 minuten. Gooi voorzichtig de supernatant, en resuspend de pellet in een tot twee milliliter van autoclaved gedeïnseerd water. Breng de waterige schorsing over naar een flacon.

Voor zichtbare, grote hoeveelheden neergeslagen polymeer, verzamel het neergeslagen polymeer met steriele metalen tangen op een flacon. Knijp in het polymeer en gooi de overtollige ethanol weg. Om het lyophilisatieproces uit te voeren dat ook wel bekend staat als vriesdrogen, houdt u de flesjes met het neergeslagen polymeer 's nachts op min 80 graden Celsius.

Lyophilize het polymeer voor ten minste 48 uur. Bewaar het gedroogde polymeer vervolgens in een desiccator bij kamertemperatuur tot verder gebruik. Om het medium te concentreren, moet u eerst cyanobacteriën kweken onder standaardomstandigheden.

Controleer de groei van cyanobacterium met behulp van standaardprocedures. Dan, centrifuge de culturen op 4,000 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng de supernatant naar een kolf en gooi de celkorrel weg.

Vervolgens filtert u het gedecanteerde medium door een filter van 0,2 micron poriegrootte. Om het medium ongeveer 500 keer te concentreren, gebruikt u centrifugale concentrators met een nominaal moleculair gewichtssnede van drie kilodaltons om 4, 000 keer g en 15 graden Celsius te centrifugeren voor een maximum van een uur per percentrifugatieronde. Na centrifugatie, spoel de wanden van het monsterreservoir van het filterapparaat met het geconcentreerde monster en breng het de inhoud over naar een microcentrifugebuis.

Voer een extra wasstap uit van het monsterreservoir van het filterapparaat met het automatisch cullaved kweekmedium om een maximaal onteigeningsherstel te garanderen. Bewaar vervolgens de exoproteoommonsters bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. De ethanol moet krachtig worden toegevoegd om het polymeer neerslag en opbrengst te optimaliseren.

Na het centrifugeren van het neergeslagen polymeer moet het weggooien van het supernatant zorgvuldig worden gemaakt om resuspensie van de pellet te voorkomen die losjes op de kolfwand kan worden bevestigd. Als handmatige filtratie wordt uitgevoerd, moet het zacht zijn om te voorkomen dat het filtermembraan wordt gebroken. Sommige neergeslagen polymeren kunnen alleen zichtbaar zijn na centrifugatie, voornamelijk op de wanden van de kolven, zoals het geval van EPS van Synechocystis.

In andere gevallen, zoals Cyanothece polymeer, is het mogelijk om de polymeerklonten te zien drijven in het glazen bekerglas net na neerslag. Sommige verontreinigingen kunnen macroscopisch na polymeerlyophilization gemakkelijk worden ontdekt aangezien zij polymeerpigmentatie, gewoonlijk wit of lichtbruin zullen veranderen. Oranje polymeren zijn besmet met carotenoïden of structuren die deze pigmenten bevatten.

Groene polymeren zijn bijvoorbeeld verontreinigd met celafval en chlorofyl. Exoproteomen kunnen aanzienlijk variëren, afhankelijk van de bacteriestam. Zie bijvoorbeeld het exoproteoom van een eencellig cyanobacterium en een van een filamenteuze stam.

De hoge hoeveelheid polysaccharides in exoproteome-geconcentreerde monsters kan de analyse van het onteproteoom belemmeren. Het kan bijvoorbeeld de eiwitscheiding vertragen en minder overvloedige eiwitten maskeren. De gebruiker kan het polymeer karakteriseren in termen van samenstelling, fysische /chemische eigenschappen, testpolymeer biologische activiteit, of gemodificeerde polymeer componenten.

Voor eiwitidentificatie kan scheiding van eiwitten in gel en massaspectrometrie worden uitgevoerd. En voor de scheiding van vesicles moet ultracentrifugatie van het onteigendmiddel worden uitgevoerd. In onze groep hebben deze protocollen al de weg vrijgemaakt om cyanobacteriële afscheidingsmechanismen of toepassingen van de extracellulaire koolhydraatpolymeren op verschillende gebieden te ontrafelen, zoals in bioremediatie of als antitumor of drugbezorgers.