Gebruik van Microtiter schotel Radiolabeling voor meervoudige in vivo metingen van Escherichia coli (p) Ppgpp gevolgd door Dunnelaagchromatografie

Deze methode meet de niveaus van de wereldwijde regulator ppGpp binnen verschillende groeiomstandigheden en stresssituaties. PpGpp kan worden gevonden in gram positieve en negatieve bacteriën, evenals in chloroplast. PpGpp heeft een snelle start in seconden, die leiden tot een snelle tweede relatie zodra stress wordt geproduceerd.

Tegelijkertijd heeft het een korte halflevenstijd, tot 30 seconden. Daarom is het nodig om veel cultuur te controleren met tijdsintervallen die kunnen variëren van 10 seconden tot uren, inclusief gestreste overgangen. We hebben ook radiolabel bacteriële culturen in microtiter gerechten vergemakkelijkt hoge doorvoer bemonsteringen die meerdere technische en biologische replica's mogelijk te maken.

Zorg ervoor dat u de juiste veiligheidsmaatregelen volgt bij het werken met radioactieve materialen. Om deze procedure te beginnen, bereid alle media zoals beschreven in het tekstprotocol. Kweek 's nachts culturen in MOPS media met drie millimolar natriumfosfaat.

Voeg 550 microliter mopsmedia toe, waarbij 0,2 micromolar natriumfosfaatdrager en 30 microliter van elk bacterieel entmateriaal aan de putten van een 24 putplaat worden verbonden. Dit zal resulteren in een eerste entmateriaal met een OD600 van 0,1. Voeg verse media toe aan een goed en een steriliteitscontrole.

Plaats de plaat in een schuddende couveuse op 37 graden Celsius, schudden op 900 RPM gedurende 30 minuten. De groei kan worden gecontroleerd met behulp van een plaatlezer met een replicerende plaat parallel in de media ontbreekt p32 met behulp van een plaatlezer tijdens het uitbroeden onder dezelfde omstandigheden. Voeg vervolgens 100 microcuries p32 ofthfosfaat toe aan elke put van de plaat.

Kweek de culturen in een schuddende couveuse voor één tot twee verdubbelingen om extern etiket grotendeels te laten equilibrate met intercellulaire nucleotidepools. Voor een goede visualisatie werd geen van het actieve materiaal gebruikt in deze video. In een echt experiment is een goede afscherming vereist, evenals constante monitoring op verontreiniging met een meetmeter.

Ten eerste, induceren stress met behulp van een methode die geschikt is voor het soort stress bestudeerd. Voeg vervolgens 20 microliter van elk gelabeld celmonster toe aan een aparte PCR-buis van 0,2 milliliter, met 20 microliter ijskoud zes molar mierenzuur. Plaats de monsters onmiddellijk op droogijs.

Verbeter de cellulaire extractie-efficiëntie met drie cycli van bevriezen en ontdooien. Net voordat u PEI cellulose dunne laag chromatogrammen, centrifugeren de monsters voor een minuut op maximale snelheid om pellet cel puin. Ten eerste, zet een 20 bij 20 centimeter PEI cellulose TLC plaat.

Gebruik een schaar om de bovenste vijf centimeter te verwijderen. En gebruik een zacht potlood om een oorsprongslijn te markeren op een centimeter van de rand. Breng een druppel van vijf microliter van elk monster aan op het PEI-oppervlak.

Voordat de spot kan drogen, breng je de plaat over naar een tank met een laag van 1,5 molar monopotassiumfosfaat dat ondiep genoeg is om de oorsprongsmonsterplek niet aan te raken. Bedek de tank met een luchtdichte afdichting, en laat vloeibare klim naar de top van de 15 centimeter bijgesneden plaat. Verwijder hierna het volledig ontwikkelde chromatogram en droog het bij kamertemperatuur.

Snijd en gooi het bovenste gedeelte van het chromatogram met de vrije P32 in radioactief afval. Gebruik een fosforscherm om de audioradiografische films 's nachts bloot te leggen. De volgende dag, de ontwikkeling van de film en gebruik een fosforimager te vangen en kwantificeren van de fosfor groene signaal.

Gebruik vervolgens ImageJ-software om de radioactieve vlekken te kwantificeren. Na het veroorzaken van stress of honger voor tijd voldoende om ppGpp accumulatie mogelijk te maken, gebruik maken van een geschikte methode om de stress te keren. Neem monsters om de 20 tot 30 seconden gedurende maximaal twee minuten en verwerkt de monsters zoals eerder beschreven.

Zodra de TLC is ontwikkeld, en de niveaus van ppGpp worden verkregen tijdens de tijd cursus, plot de resterende ppGpp inhoud op een semilogarithische plot versus tijd. In deze studie worden cellen gekweekt in MOPS die alle aminozuren bevatten, behalve ILV, gelabeld met P32. Eenmaal gelabeld, L valine wordt toegevoegd aan isoleucine honger te produceren.

Na vijf minuten, een twee en twee en een half oude toename van de niveaus van tetra en pentaphosfate van guanosine opgetreden. Een negatieve controle van een cel vrij gelabeld monster wordt gebruikt om mogelijke verbindingen die niet orthophosphate in de P32 bron te detecteren. Omkering van isoleucine honger kan worden bereikt door chlooramphenicol, een remmer van eiwitsynthese, die de consumptie van geladen isoleucine tRNA vermindert, en op zijn beurt, herstelt hoge verhoudingen van geladen tot ongeladen tRNA.

Activering van de sterke rela-gemedieerde ppGpp synthetase wordt afgeschaft, waardoor een maatregel van ppGpp afbraak onversterkend door restsynthese. In dit geval vervalt ppGpp met een halvetijd van ongeveer 64 seconden. Het is belangrijk om de cellen te laten groeien voor een paar generaties om een uniforme etikettering te bereiken voordat het induceren van stress of honger.

Omdat ppGpp op grote schaal wordt verspreid onder bacteriën, kan deze methode worden toegepast op andere organismen. Wijziging van de TLC-ontwikkelingsmethode zou de juiste scheiding van alle regelgevende nucleotiden mogelijk kunnen maken, zoals ppApp. P52 is een betere zender isotoop, dus het is belangrijk om de juiste afscherming te gebruiken en om eventuele residuen goed weg te gooien.