Name: Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer longitudinale two-photon beeldvorming van de dorsale hippocampus CA1 bij levende muizen. Deze methode maakt onderzoek naar neuronale plasticiteit en geheugenprocessen op micrometerniveau gedurende meerdere weken mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

U. A. F. wordt ondersteund door de Schram Foundation; C.-W. T. P. en W. G. worden ondersteund door de Max Planck Society; L.Y. en R.Y. worden ondersteund door de Max Planck Society en het National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. wordt ondersteund door een KP7-subsidie van de Europese Onderzoeksraad, de ERANET-en I-CORE-Programma's, de Chief Scientist Office van het Israëlische ministerie van volksgezondheid, het federale ministerie van onderwijs en onderzoek, Roberto en Renata Ruhman, Bruno en Simone Lich, de Nella en Leon Benoziyo centrum voor neurologische aandoeningen, het Henry Chanoch Krenter Instituut voor biomedische beeldvorming en genomics, de Israel Science Foundation de Perlman familie, Adelis, Marc Besen, Pratt en Irving I. Moskowitz Foundations; A. A. wordt ondersteund door de Max Planck Society, de Schram Foundation en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). De 3P beelden werden verworven tijdens de Advanced cursus over neuroimaging technieken aan het Max Planck Florida Institute for Neuroscience. De geavanceerde cursus over neuroimaging-technieken wordt ondersteund door de Max Planck Society, het Florida State Max Planck Scientific Fellowship Program en het Max Planck Florida Institute Corporation Partnership Program. We willen Thorlabs, coherente en SpectraPhysics bedanken voor het leveren van ondersteuning en apparatuur voor het 2P/3P Imaging System tijdens de cursus. We zijn Henry Haeberle en Melissa Eberle ook dankbaar voor hulp bij het systeem tijdens de cursus.

Alle beschreven methoden zijn goedgekeurd door de regering van Opper-Beieren (licentie 2016_ROB-55.2 vet-2532. Vet_02-16-48) en door de Stanford en Max Planck Florida Institute for Neuroscience administratieve panels op laboratorium Animal Care.
1. bereiding van de beeldvormings canule
<ol><li>Houd een precisie boor op een boorstandaard geleverd met een beweegbare liniaal tafel.</li>
	<li>Klem een roestvrijstalen buis van 3,0 mm diameter op de beweegbare liniaal tafel.</li>
	<li>Snijd de buis naar een 1,6 mm lange metalen ring. Als de randen van de ring niet bot na het snijden, bestand uit de onregelmatigheden.</li>
	<li>Spoel de metalen ring en een cirkelvormige glazen afdekplaat met 4 mm diameter in 100% aceton en laat voor ≈ 5 min drogen.</li>
	<li>Plaats de metalen ring en de glazen afdekplaat op een gladde, gelijkmatige en schone werkplek, onder een stereoscoop.</li>
	<li>Plaats een druppel UV-uithardende optische lijm op een glad oppervlak, zoals een Petri schaaltje. Gebruik een naald of een spatel om de lijm uit te spreiden om een dunne (< 0,5 mm) laag te vormen.</li>
	<li>Gebruik de tang om de ene kant van de metalen ring in de lijm te dompelen. Let vooral op de binnenkant van de ring niet verzegelen. Als dit gebeurt, gebruik dan een naald om de optische lijm in de ring te breken.</li>
	<li>Gebruik de stereoscoop om de metalen ring in het midden van de glazen afdekplaat te plaatsen met de zijkant van de ring bedekt met lijm die de afdekplaat aanraakt. Een dunne ring van lijm moet worden vorm op de interface tussen de metalen ring en de dekslip. Vermijd het verspreiden van lijm naar het midden van de dekslip.</li>
	<li>Zet de UV-uithardende LED-driver unit en glans licht (365 nm) gedurende 1 minuut aan. Let op: UV-licht veroorzaakt brandwonden van de huid en is een mutagene stof. Draag UV-beschermende brillen en Bescherm handen en armen met handschoenen en een Labcoat om huid blootstelling te voorkomen.</li>
	<li>Om de lijm gelijkmatig te genezen, zorg ervoor dat alle zijden van de ring even verlicht zijn door de richting van de lichtbron te veranderen.</li>
	<li>Laat de lijm ten minste 2 uur verharden, bij voorkeur, 's nachts.</li>
	<li>Houd de canule stevig vast van het open uiteinde van de metalen ring door middel van een hemostat. Gebruik een tandheelkundige boor, uitgerust met een draaiend bestand en werkend onder de stereoscoop, om de overtollige glazen afdekplaat af te spoelen met de zijkanten van de ring (Figuur 1a).</li>
</ol>2. implantatie van de beeldvormings canule over de dorsale Hippocampus
<ol><li>Voorbereiding van apparatuur en installatie
	<ol>
<li>Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten schoon en steriel zijn. Bij gebruik van een glazen kraal sterilisator voor sterilisatie, reinig de instrumenten en plaats ze in de sterilisator (ingesteld op 250 °C) gedurende 10 minuten, vóór gebruik. U de instrumenten ook voor gebruik Autoclaveren.</li>
		<li>Bereid alle materialen die nodig zijn voor de operatie, evenals chirurgische instrumenten, zodat ze gemakkelijk kunnen worden bereikt.</li>
		<li>Zorg ervoor dat er genoeg vers bereide medicijnen zoals pijnstillers of ontstekingsremmende geneesmiddelen.</li>
		<li>Zorg ervoor dat er voldoende Isofluraan is voor de hele duur van de operatie (ongeveer 1 uur per operatie).</li>
		<li>Zet het verwarmings tapijt aan en stel het in op 37 °C om de dieren temperatuur stabiel te houden onder anesthesie.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het opruimings systeem voor Isofluraan functioneert.</li>
		<li>Open de klep van de zuurstoftoevoer.</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthesie inductie, en dierlijke fixatie
	<ol>
<li>Plaats de muis in de anesthesie-inductie kamer op 3% Isofluraan in 1 L/min O2 en wacht tot het bewustzijn verliest. Beoordeel anesthesie met behulp van de teen pinch reflex test.</li>
		<li>Weeg het dier af.</li>
		<li>Breng anti-inflammatoire (Meloxicam, 1mg/kg) en pijn Killer (Vetalgin, 200mg/kg) drugs subcutaan.</li>
		<li>Plaats de muis op het verwarmings tapijt. Zorg ervoor dat het dier niet in direct contact is met het verwarmings tapijt om thermische brandwonden te voorkomen.</li>
		<li>Bevestig het hoofd aan het stereotactische apparaat en plaats de neuskegel om de snuit te bedekken. Om anesthesie te handhaven, vermindert Isofluraan tot 1,5-2%. Gedurende de hele operatie, monitor muis toestand door het visueel controleren van de ademhaling en door het testen van Teen pinch reflex. Reguleren Isofluraan percentage indien nodig.</li>
		<li>Breng oftalmische zalf aan op de ogen om uitdroging en mogelijke blindheid te voorkomen. Opmerking: voor anesthesie en dierlijke medicatie zijn alternatieve methoden en geneesmiddelen mogelijk. Raadpleeg uw dieren licentie en de relatieve literatuur.</li>
	</ol></li>
	<li>Implantatie van optische canule
	<ol><li>Schakel de glasvezel lichtbron in.</li>
		<li>Verwijder het haar en Desinfecteer de huid over de muis kop.</li>
		<li>Verwijder met een schaar en een tang de hoofdhuid van de muis. Begin met het maken van een kleine snede in de hoofdhuid in een positie dicht bij Lambda. Ga door met het openen van de hoofdhuid aan de twee zijden. Eerst bewegen lateraal in de richting van de oren, dan rostrally, in de richting van de oogbanen, een driehoek op de sagittale as vormen, ongeveer 4 mm rostrale migratoire naar bregma. Let op niet te dicht bij oren en ogen te snijden, maar bloot bregma en lambda, evenals pariëtale botten en de achterste helft van de voorste botten.</li>
		<li>Breng één druppel (≈ 10 mg) lidocaïne (28,9% v/v in alcohol) aan op de schedel.</li>
		<li>Wis het periosteum en droog de schedel met een wattenstaafje.</li>
		<li>Plaats de oorstangen om de muis kop vast te maken.</li>
		<li>Maak een kleine craniotomie, met behulp van een micro-boor met een 0,5 mm breedte Burr. Plaats het gat in het frontale bot tegenover de afbeelding van de hippocampus, ongeveer 1,5 mm van het sagittale hecht en 2 mm ver van de coronale hecht.</li>
		<li>Schroef een 0,86 mm-breedte roestvrijstalen botschroef in het schedel gat.</li>
		<li>Reinig indien nodig het puin en droog de schedel.</li>
		<li>Bereiding van een mengsel van snellijm cement
		<ol>
<li>Met behulp van een kleine lepel (≈ 4,5 mm diameter), doseren 1-1.5 niveau Scoops van L-poeder in een meng goed.</li>
			<li>Doseer 3-4 druppels snelle basis in de put.</li>
			<li>Doseer 1 druppel universele katalysator in de put.</li>
			<li>Roer de mix voor 5-10 s door een precisie applicator. Opmerking: er zijn alternatieven beschikbaar. Raadpleeg de instructies van de fabrikant.</li>
		</ol></li>
		<li>Gebruik precisie applicatoren om snel lijm cement toe te passen op de schedel, de schroef en de omringende huid. Laat het 30 sec. tot 1 min drogen.</li>
		<li>Gebruik een 3,0 mm diameter genoemd boor om een craniotomie in het pariëtale bot te maken. Plaats het gat ongeveer 1,5 mm afstand van de sagittale hecht en 2 mm afstand van de lambdoïde hecht.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de botflap.</li>
		<li>Controleer de grootte van de craniotomie met behulp van de canule om ervoor te zorgen dat deze past. Gebruik een micro-Drill van 0,5 mm of 0,9 mm om de craniotomie zo nodig te vergroten.</li>
		<li>Verwijder de hersenvliezen met de Dumont-Tang.</li>
		<li>Ablate corticale materie, om de externe capsule te bereiken. Gebruik een 0,9 mm diameter (19 gauge) botte naald aangesloten op een vacuümpomp. Irrigeren met zoutoplossing om uitdroging van het blootgestelde weefsel te voorkomen en rest bloed weg te spoelen nadat het bloeden is verdwenen. Zuig het corticale weefsel langzaam, ≈ 50-100 μm tegelijk, totdat de cortex loskomt van de capsule, waardoor de vezels van het Cingulum of het corpus callosumworden blootgesteld. Verander de naald regelmatig, om verstopping te voorkomen.</li>
		<li>Vezels strekken zich voornamelijk uit in drie richtingen (Figuur 1b). Schil voorzichtig de rugvezels tot de diepste vezels (alveus van de hippocampus) worden blootgesteld.</li>
		<li>Spoel het weefsel met zoutoplossing. Gebruik dunne tang om de onderste canule in een zoutoplossing te dompelen en plaats deze over het schedel gat. Canule en weefsel moeten met een zoutoplossing worden verzegeld om te voorkomen dat luchtbellen tussen de canule en het weefsel worden overgevuld.</li>
		<li>Duw de canule in de schedel (figuur 1c) totdat de glazen afdekplaat in aanraking komt met de vezels.</li>
		<li>Droog de schedel goed met behulp van absorptie driehoeken, wattenstaafjes en/of de vacuümpomp.</li>
		<li>Bereiding van een mengsel van snellijm cement (zie stap 2.3.10).</li>
		<li>Gebruik precisie applicatoren om snel lijm cement toe te passen op de schedel. Lijm ook aanbrengen op de rand van de canule. Zorg ervoor dat de lijm niet in de canule loopt. Laat het 30 sec. tot 1 min drogen.</li>
		<li>Gebruik een stereotaxic arm om een kophouder plaat over de canule te positioneren, in contact met de schedel.</li>
		<li>Bereiding van een mengsel van tandheelkundige acryl
		<ol>
<li>Gebruik een lepel (≈ 9 mm diameter), Doseer 1 niveau schep (1 deel) poeder in een meng goed.</li>
			<li>Verdeel 2-3 delen van vloeistof in dezelfde put. Bedek het hele poeder met de vloeistof.</li>
			<li>Roer voor ≈ 1 min met behulp van een spatel. Opmerking: er zijn alternatieve acryl beschikbaar. Raadpleeg de instructies van de fabrikant.</li>
		</ol></li>
		<li>Gebruik een spatel of een precisie applicator om acryl over de cranium toe te passen. Bedek de gehele blootgestelde schedel, de schroef en de open huid met tandheelkundige acryl. Dit maakt de voorbereiding stabiel. Laat acryl niet in de nek, oren en ogen lopen.</li>
		<li>Laat het acryl drogen en harden voor ongeveer 15 min.</li>
		<li>Breng een verwijderbare Kleef film aan op de plaat van de hoofd houder, om te voorkomen dat er vuil in de canule terechtkomt. Het wordt aanbevolen dat de film grootte overeenkomt met die van de plaat.</li>
		<li>Schakel Isofluraan flow uit, verwijder het dier uit het stereotactische apparaat en Positioneer het op een verwarmingsplaat om de fysiologische lichaamstemperatuur te behouden terwijl het wakker wordt van de anesthesie.</li>
		<li>Bewaak het dier totdat het voldoende bewustzijn heeft gekregen om borstbeen recumbency te handhaven.</li>
		<li>Terugkeer van het dier dat een operatie heeft ondergaan aan het gezelschap van andere dieren alleen wanneer volledig hersteld.</li>
	</ol></li>
</ol>3. postoperatieve zorg
<ol><li>Controleer de status van de muis gedurende 2 dagen na de operatie, door het gewicht en het algemene gedrag te bewaken.</li>
	<li>Breng anti-inflammatoire (Meloxicam, 1mg/kg) en pijn Killer (Vetalgin, 200mg/kg) drugs subcutaan gedurende 2 dagen na de operatie Opmerking: alternatieve bewakingsprocedures, drugs en doseringen zijn mogelijk voor postoperatieve zorg. Raadpleeg uw dieren licentie en de relatieve literatuur.</li>
</ol>4. voorbereiding van de beeldvormings sessie
<ol><li>Schakel de Imaging Setup van tevoren in en laat de laser zo nodig opwarmen en stabiliseren.</li>
	<li>Anesthetiseer de muis (zie stap 2.2.1).</li>
	<li>Gebruik de tang om de zelfklevende folie voorzichtig van de kophouder plaat te verwijderen. Houd de muis in een hand en de hoofd Houderplaat met de vingers. Verwijder de film zachtjes, om beschadiging van het preparaat te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de muis onder de Microscoop, over het verwarmings tapijt en bevestig de kopplaat aan de houder (figuur 1d).</li>
	<li>Plaats de neuskegel om de snuit te bedekken en verlaag de Isofluraan tot 1,5-2%.</li>
	<li>Breng oftalmische zalf aan op de ogen van de muis.</li>
	<li>Reinig de Imaging canule door het spoelen met gedeïoniseerd water. Gebruik een spuit en een dunne naald om water in de canule te laten vallen en een vacuümpomp om deze te verwijderen.</li>
</ol>5. Imaging sessie
<ol><li>Gebruik een lage vergroting, lange werkafstand doelstellingen om de canule visueel te controleren op restwater, vuil, integriteit en de aanwezigheid van fluorescentie.</li>
	<li>Lijn de canule op de optische as door de hoeken van de armen van de hoofd houder aan te passen.</li>
	<li>Overschakelen naar de 25X 1,0 NA, 4 mm WD of de 40X 0,8 NA, 3 mm WD, water onderdompeling doelstellingen. Voeg voldoende gedeïoniseerd water toe om de canule te vullen en overtollig water boven op de canule te houden. Vermijd de vorming van luchtbellen.</li>
	<li>Gebruik 2P excitatie en beeld fluorescerende signalen. Opmerking: het Imaging-protocol is sterk afhankelijk van de tijd en ruimtelijke schalen die moeten worden afgebeeld. Raadpleeg de secties representatieve resultaten en discussie voor meer informatie over de Imaging-instellingen die we hebben gebruikt voor het produceren van de afbeeldingen die in dit artikel worden weergegeven.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt een procedure voor herhaalde 2P-beeldvorming van de dorsale CA1 in levende muizen beschreven. Na de operatie herstelt de muis meestal binnen 2 dagen. De procedure induceert minimale Astrogliose26,43. Bloedingen en oedeem die de operatie kunnen volgen, worden meestal binnen 10 tot 14 dagen opnieuw geadsorreven. Over het algemeen is de bereiding vanaf 14 dagen na implantatie voldoende duidelijk om intravital beeldvorming uit te voeren. Het succes van de operatie is niet afhankelijk van het werken in een steriele omgeving. Echter, het is cruciaal om een hoog niveau van hygiëne te handhaven, om complicaties te voorkomen als gevolg van chirurgie-geassocieerde infecties. Dit wordt verkregen door de chirurgische instrumenten voor en na de operatie nauwgezet te reinigen en door ze onmiddellijk voorafgaand aan elk gebruik te verwarmen (stap 2.1.1). De optische canule wordt in een schone, gesteriliseerde verpakking gehouden en vlak voor de implantatie gespoeld met steriele zoutoplossing. Het uitvoeren van gemeenschappelijke chirurgische praktijken van handendesinfectie en reiniging van het chirurgische station is ook erg belangrijk. De bereiding blijft stabiel en maakt cellulaire en subcellulaire resolutie beeldvorming voor enkele weken26,35.
Kritieke stappen, wijzigingen en probleemoplossing.
Het is belangrijk om de uitwendige capsule te schillen tot de diepste vezels worden blootgesteld. Het niet blootleggen van de alveus kan resulteren in het onvermogen om zich te concentreren op het SOMA van PNS, of in gereduceerde resolutie beeldvormende dendritische stekels, bij het gebruik van commerciële doelstellingen met 3-of 4-mm WD. Voor dit doel is het nuttig om de neocortex zeer langzaam te ablaten met een naald van 0,9 mm diameter en vervolgens over te schakelen op een 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) naald voor een fijnere controle van de zuigkracht bij het verwijderen van de meest dorsale vezels. Als alternatief kan Fine Tang worden gebruikt om de resterende cortex te verwijderen na blootstelling aan vezels36.
Bloeden tijdens de operatie kan problematisch zijn, als bloed belemmert het uitzicht. Wachten op het stolsel te vormen en vervolgens spoelen met zoutoplossing om rest bloed te wassen wordt aanbevolen. Herhaal deze indien nodig.
Een nauwsluitende pasvorm tussen de canule en de craniotomie helpt de stabiliteit van het preparaat te verhogen door de canule op zijn plaats te houden vóór het aanbrengen van het cement, vooral als de buitenste rand van de canule met de schedel is uitgelijnd. Omdat de maten van de genoemd boor en de canule worden geëvenaard, kan een losse pasvorm ontstaan door onregelmatigheden aan de zijkant van de canule-die iets grotere craniotomieën nodig hebben om te passen (zie stap 2.3.14)-of van een onregelmatige craniotomie. Eventuele onregelmatigheden bij de canule moeten worden afgezet (stappen 1,3 en 1,12) en de trefine moet loodrecht op de schedel worden gehouden totdat de craniotomie is voltooid (stap 2.3.12). Het verwijderen van de trefine uit de schedel voordat de craniotomie is voltooid kan resulteren in onregelmatige craniotomieën.
Beperkingen- Invasiviteit en stabiliteit van het preparaat.
Het is moeilijk om het effect van corticale ablatie te evalueren, omdat het lastig is om de gebieden die direct en indirect worden getroffen nauwkeurig te definiëren. In het algemeen, de operatie verwijdert een deel van de pariëtale cortex en een deel van de visuele en hindledemaat zintuiglijke cortex21. De ablatie cortex niet direct projecteren op de hippocampus en hippocampal weefsel is niet geraakt noch gewond. Belangrijk is dat het is aangetoond dat implantatie van een beeldvormings canule de hippocampal functie en specifiek de hippocampal-afhankelijke leerproces niet sterk wijzigt21,36,37,38, 39. Toch is het belangrijk om te kwantificeren in hoeverre zowel de canule als het uitwendige deel van het implantaat (hoofd Houderplaat en tandheelkundige acryl dop) chronische stressoren zijn door de bloedspiegels van corticosteron en de bijnier gewicht te beoordelen in vergelijking met ongeimplanteerde muizen.
Het preparaat blijft over het algemeen stabiel van weken tot maanden26. Op de lange termijn, huid-en botgroei neiging om het acryl kapje te verplaatsen en de instabiliteit van de Imaging voorbereiding te verhogen.
Optische beperkingen.
Conventionele 2p microscopie maakt beeldvorming tot ongeveer 1 mm diep in neocorticale weefsel40,41. Consistent met deze, het is mogelijk om te beeld dendrites en dendritische stekels gelegen in de SR (figuur 2D-F) of SLM36. Echter, beeldvorming door middel van een canule vormt beperkingen voor de effectieve NA. Om de maximale resolutie te bereiken, moeten de diameter en diepte van de beeldvormings canules worden afgestemd op de Imaging NA, omdat kleinere diameters en langere diepten licht van hoge NA-doelstellingen zullen clippen. Bijvoorbeeld, bij beeldvorming met een 1,0 NA water onderdompeling doel door een 1,6 mm lange canule, is een 3,65 mm binnendiameter nodig om de volledige NA te houden. Echter, met behulp van een canule van deze diameter zal de compressie op de Hippocampus te verhogen en kan invloed hebben op de gezondheid van het weefsel, om deze reden, gebruiken we een canule met een kleinere diameter. Bij beeldvorming met een 0,8 NA water onderdompeling door middel van een 1,6 mm lange canule, zou een inwendige diameter van 2,5 mm voldoende zijn om het volledige NA te houden. Echter, 0,8 NA water onderdompeling doelstellingen hebben een kortere WD (3 mm in ons geval), die kan voorkomen dat zich te concentreren op de SP.
Deze berekeningen zijn van toepassing op het midden van het gezichtsveld aan de onderkant van de canule. Echter, verplaatsen van het beeldveld van de weergave Sidewise-dichter bij de randen van de canule-of dieper in het weefsel te focussen-verder van het glasoppervlak van de canule-vermindert verder de effectieve NA in het brandvlak en dus vermindert de resolutie. Dit zal leiden tot een niet-homogene resolutie over de verschillende volumes van afbeelding gemaakt weefsel en kan een zorg zijn voor kwantitatieve beeldvorming op subcellulaire resolutie, vooral bij het gebruik van super-resolution technieken zoals 2p-STED microscopie42. Deze problemen zijn minder belangrijk bij Imaging op cellulaire resolutie.
Weefsel beweging.
Beweging binnen het weefsel-afkomstig van ademhaling en hartslag bij verdomde dieren-neigt te worden ernstiger met verhoogde afstand van de Imaging canule. Dit is mogelijk omdat de Imaging canule mechanische druk op de hersenen toepast, waardoor een deel van de beweging in de nabijheid van de canule wordt tegengedraaid (vergelijkbaar met neocorticale preparaten). Dus, hoewel beeldvorming van dendritische stekels mogelijk is in SR en SLM, in onze handen, het is de meest robuuste rug tot de zo tot ≈ 200 μm van het oppervlak van de canule. Om de beweging te compenseren, gebruiken we resonante scanners en offline middeling. Verschillende beelden (4 tot 6 herhalingen) worden per beeldvlak van een z-stack verkregen bij de maximaal beschikbare snelheid (30 frames/s). Alle herhalingen voor elk z-vlak worden vervolgens deconvolved (met behulp van de commerciële software, AutoQuant), geregistreerd (met behulp van ImageJ) en gemiddeld in een enkele afbeelding26. Voorbeeld vorming van somata, beweging is vaak verwaarloosbaar op anesthesie35 en twee gemiddelden zijn vaak voldoende om te compenseren voor bewegings artefacten.
Toekomstige toepassingen of richtingen van de methode . 
De bereiding kan worden gecombineerd met micro-endoscopen26,43. Micro-endoscopen zijn stijve optische sondes die gebruik maken van gradiënt brekingsindex (GRIN) micro lenzen om licht van en naar diep weefsel18te leiden. Het gebruik van micro-endoscopen maakt canules van kleinere diameters of zelfs geen canules helemaal. Commerciële micro-endoscopen zijn echter minder goed gecorrigeerd voor optische aberraties en hebben lagere NA dan commerciële doelstellingen. Stroom voelers bereiken laterale en axiale resoluties van ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respectievelijk17,18,44. Het gebruik van micro-endoscopen maakt ook de combinatie van dit preparaat mogelijk met Head-Mounted geïntegreerde Widefield microscopen45,46,47.
De methode leent zich ook om te gebruiken in niet-anesthetized muizen, en het is gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire activiteit met behulp van CA2 + sensoren in wakker hoofd-vaste muizen21,37,48,49. In deze gevallen, als gevolg van de snelle tijdschalen van de fluorescentie veranderingen, is het raadzaam om te implementeren lijn registratie50. Het is ook mogelijk om de voorbereiding voorbeeld vorming van andere subregio's van hippocampal, zoals de getand gyrus (DG)39,51,52, aan te passen. Het combineren van dit preparaat met 3p excitatie53,54 met 1 MHz frequentie gepulseerde Laser afgestemd op 1400 nm, we konden dieper beeld in de hippocampal formatie bereiken van de moleculaire laag, submodule cellaag en de Hilus van het DG (Figuur 4) zonder het opheffen van de overplaatsing Ca1.
Concluderend, presenteren we een methode die optische toegang tot de dorsale Hippocampus biedt en toelaat longitudinale en correlatieve studies van de dynamiek van de hippocampal structuur en activiteit. Deze techniek breidt de mogelijkheden van de analyse van de hippocampal functie onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

In zoogdieren, de hippocampus is een belangrijke hersenregio voor de codering en terugroepen van episodische herinneringen, alsmede voor ruimtelijke navigatie1,2,3,4. Om deze reden, de hippocampus is geweest-en is nog steeds-een zeer belangrijk model om de basismechanismen die het mogelijk maken de hersenen om te coderen en terugroepen herinneringen5,6,7 of om te navigeren in een omgeving te bestuderen8 ,9 beloningen verzamelen en gevaren vermijden. Daarnaast is de hippocampal formatie is een van de hersengebieden waar nieuwe neuronen worden gegenereerd gedurende het leven van knaagdieren10,11 en, eventueel, van de mens12,13. Tot slot, degeneratie of aantasting van de hippocampal vorming worden geassocieerd met neurologische en psychiatrische stoornissen, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer14.
Bij muizen ligt de Hippocampus ongeveer 1 mm onder het hersen oppervlak15. Zijn positie heeft optische toegang voorkomen in het intacte brein en bijgevolg hebben longitudinale studies van hippocampal Dynamics zich voornamelijk gebaseerd op magnetische resonantie (MR) Imaging, elektrofysiologie en ex vivo imaging analyses. De heer Imaging methodes maken het volgen van biologische processen (bijv. genexpressie wijzigingen16) in hetzelfde dier over meerdere dagen mogelijk, maar missen de ruimtelijke resolutie om enkelvoudige neuronen te discrimineren. Klassieke in vivo elektrofysiologische technieken bieden een zeer hoge temporele resolutie en een uitstekende gevoeligheid voor veranderingen in membraanpotentiaal. Ze hebben echter een beperkte ruimtelijke resolutie en ze missen de mogelijkheid om dezelfde cellen betrouwbaar te volgen gedurende langere perioden. Optische beeldvorming maakt het mogelijk om meer diverse processen te studeren op grond van de hoge temporele en ruimtelijke resoluties. Ex vivo imaging biedt echter alleen snapshots van lopende processen, en is dus niet geschikt voor longitudinale studies waarbij de dieren informatie leren en terugroepen.
Optische beeldvorming combineert in vivo een aantal voordelen van de heer Imaging en elektrofysiologie met die van optische beeldvorming. Daarom is het zeer goed geschikt voor longitudinale en correlatieve analyses van muis hersen dynamiek en gedrag. Dit is relevant in studies van biologische processen met zeer snel (milliseconden tot seconden) of zeer traag (dagen tot weken) tijdschema's. Voorbeelden voor dergelijke processen die relevant zijn voor de neurowetenschappen zijn membraanspanning dynamiek, CA2 + transiënten, cellulaire plasticiteit en structurele veranderingen, die worden allemaal verondersteld te zijn zeer belangrijk voor Geheugenvorming en terugroepen. Verschillende methodes zijn uitgebreid in vivo imaging naar de dorsale Hippocampus18,19,20,21,22. Acute preparaten hebben het volgen van de activiteit van piramidale neuron (PN), evenals hun dendritische stekels gedurende enkele uren20,22toegestaan. Deze temporele tijdspanne staat echter niet toe dat structurele veranderingen op de lange termijn, die kunnen leiden tot incrementele leerprocessen, worden bestudeerd. Chronische preparaten-in combinatie met micro-endoscopen23,24 of met lange werkafstand (WD) standaard Microscoop doelstellingen21 -hebben herhaalde beeldvorming van de dorsale Hippocampus over verschillende Weken.
Hier beschrijven we een chronische voorbereiding die terugkerende optische toegang biedt tot het CA1-subveld van de dorsale Hippocampus van levende muizen met behulp van een permanent ingevoegde beeldvormings canule. Dit preparaat maakt herhaalde toegang tot de CA1 zonder functionele verstoring en is geschikt voor intravital Two-photon (2P) of breed-veld epifluorescentie beeldvorming. Twee voorbeelden van 2 p diepe hersenen chronische beeldvorming in de dorsale CA1 van levende muizen zijn gedetailleerd: longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische wervelkolom dynamiek en longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. De belangrijkste voordelen en beperkingen van de techniek worden besproken.

<table><tbody><tr><td>Professional drill/grinder IBS/E</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28481</td><td>Precisie boormachine</td></tr><tr><td>MICROMOT drill stand MB 200</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28600</td><td>Verplaatsbare liniaaltafel</td></tr><tr><td>MICRO compound table KT 70</td><td>Proxxon GmbH</td><td>27100</td><td>Verplaatsbare liniaaltafel</td></tr><tr><td>Machine vice MS 4</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28132</td><td>Verplaatsbare liniaaltafel</td></tr><tr><td>Stainless steel tube &Oslash; 3,0 x 0,25 mm (Inner &Oslash; 2,5 mm ) L = 500 mm</td><td>Sawade</td><td>R00303</td><td>Rouwbuistraad voor de canule metalen ring</td></tr><tr><td>Microscope Cover glass (4 mm round)</td><td>Engelbrecht Medizin and Labortechnik</td><td></td><td>Glazen deksel voor de canule glas</td></tr><tr><td>Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui</td><td>Hoffmann Group</td><td>713750 160</td><td>Handmatig vijlen</td></tr><tr><td>Pr&auml;zisions-Nadelfeile Gesamtl&auml;nge 140 mm 4</td><td>Hoffmann Group</td><td>527230 4</td><td>Handmatig vijlen</td></tr><tr><td>UV-Curing Optical Adhesives</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>UV-hardende kleefstof</td></tr><tr><td>UV Curing LED System, 365 nm</td><td>Thorlabs</td><td>CS2010</td><td>UV-hardende LED-driver unit</td></tr><tr><td>Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stereoscoop</td></tr><tr><td>Presto II</td><td>NSK-Nakanishi Germany</td><td>Z307015</td><td>Tandboormachine</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein</td><td>MF Dental</td><td>F837.014.FG</td><td>Vijl voor de tandboormachine</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob</td><td>MF Dental</td><td>G837.014.FG</td><td>Vijl voor de tandboormachine</td></tr><tr><td>Graefe Forceps - Straight / Serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Pincet voor de chirurgie</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-05</td><td>0,5 mm breed slijpwiel voor de microboor</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-09</td><td>0,9 mm breed slijpwiel voor de microboor</td></tr><tr><td>MicroMotor mit Handst&uuml;ck</td><td>DentaTec</td><td>MM11</td><td>Microboor voor de craniotomie</td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Dumont pincet voor de chirurgie</td></tr><tr><td>Fine Scissors - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Schaar voor de chirurgie</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>MW Dental</td><td>229-020</td><td>Trephineweergave - 3,0 mm diameter; voor de microboor</td></tr><tr><td>Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>0,86 mm breedte botschroeven</td></tr><tr><td>Stereotaxic apparatus</td><td>Kopf</td><td></td><td>Stereotaxisch apparaat</td></tr><tr><td>3-D-Gelenkarm</td><td>Hoffmann Group</td><td>442114</td><td>Stereotaxisch arm en plaathouder</td></tr><tr><td>Aufnahme 2SM</td><td>Hoffmann Group</td><td>442100 2SM</td><td>Stereotaxisch arm en plaathouder</td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilizers</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Glazen parels sterilisator</td></tr><tr><td>Isofluran CP, Flasche 250 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798932</td><td>Vloeibare isofluraan voor anesthesie</td></tr><tr><td>Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer</td><td>Harvard Apparatus GmbH</td><td>34-1040</td><td>Isofluraanverdamper</td></tr><tr><td>Lab Active Scavenger</td><td>Gropper Medizintechnik</td><td>UV17014</td><td>Isofluraan scavengeer systeem</td></tr><tr><td>Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798566</td><td>Meloxicam, ontstekingsremmer</td></tr><tr><td>Vetalgin 500 mg/ml</td><td>MSD Tiergesundheit</td><td></td><td>Vetalgin, pijnstiller</td></tr><tr><td>CMA 450 Temperature Controller</td><td>Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH</td><td>8003770</td><td>Verwarmingsdeken</td></tr><tr><td>Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Oftalmische zalf</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td></td><td>Lichtbron voor lichtgeleiders</td></tr><tr><td>Xylocain Pumpspray</td><td>AstraZeneca GmbH</td><td></td><td>Lidocaine, lokaal verdovingsmiddel</td></tr><tr><td>Absorption Triangles - Unmounted</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-03</td><td>Absorptie driehoeken voor de chirurgie</td></tr><tr><td>Parkell C&amp;B Metabond clear powder L</td><td>Hofmeester dental</td><td>013622</td><td>Snel hechtend cement</td></tr><tr><td>Parkell C&amp;B Metabond Quick Base B</td><td>Hofmeester dental</td><td>013621</td><td>Snel hechtend cement</td></tr><tr><td>Parkell C&amp;B Metabond Universal Catalyst C</td><td>Hofmeester dental</td><td>013620</td><td>Snel hechtend cement</td></tr><tr><td>Adjustable Precision Applicator Brushes</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td>Precisie applicatoren voor de chirurgie</td></tr><tr><td>Blunt needles 0.9x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0441324</td><td>Blunt naalden</td></tr><tr><td>Blunt needles 0.5x42 mm</td><td>Dentina</td><td>0452155</td><td>Blunt naalden</td></tr><tr><td>Blunt needles 0.3x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0553532</td><td>Blunt naalden</td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>Acryline vloeibare component</td></tr><tr><td>Kallocryl</td><td>Speiko</td><td>1609</td><td>Acryline poeder</td></tr><tr><td>Hydrofilm transparent roll</td><td>Hartmann</td><td></td><td>Zelfklevende film</td></tr><tr><td>Head plates</td><td>Custom made</td><td></td><td>30 mm x 10 mm grootte; gat van 8 mm diameter, titanium</td></tr><tr><td>Head plate clamp</td><td>Custom made</td><td></td><td>Houder voor hoofdplaat</td></tr><tr><td>Pedestal post holders</td><td>Thorlabs</td><td>PH20E/M</td><td>Houder voor hoofdplaat</td></tr><tr><td>Stainless steel post</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td><td>Houder voor hoofdplaat</td></tr><tr><td>Stainless steel post</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M</td><td>Houder voor hoofdplaat</td></tr><tr><td>Stainless steel post</td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M</td><td>Houder voor hoofdplaat</td></tr><tr><td>Post connector clamps</td><td>Custom made</td><td></td><td>Houder voor hoofdplaat</td></tr><tr><td>Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps</td><td>Thorlabs</td><td>MB3045/M</td><td>Microscoop stand</td></tr><tr><td>7" x 4" Lab Jack</td><td>Thorlabs</td><td>L490/M</td><td>Microscoop stand</td></tr><tr><td>

longitudinale two-photon beeldvorming van dorsale hippocampal ca1 in levende muizen

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopie is een fundamenteel hulpmiddel voor Neurowetenschappen, omdat het onderzoek van de hersenen van levende dieren op ruimtelijke schalen mogelijk maakt, variërend van subcellulaire tot netwerk niveaus en op temporele schalen van milliseconden tot weken. Daarnaast kan Two-photon Imaging worden gecombineerd met een verscheidenheid aan gedragstaken om de causale relaties tussen hersenfunctie en gedrag te verkennen. Echter, in zoogdieren, beperkte penetratie en verstrooiing van licht hebben beperkt twee-photon intravital beeldvorming meestal aan oppervlakkige hersengebieden, dus in de richting van longitudinaal onderzoek van diepe hersengebieden zoals de hippocampus. De hippocampus is betrokken bij ruimtelijke navigatie en episodische geheugen en is een lange-staande model gebruikt voor het bestuderen van cellulaire evenals cognitieve processen belangrijk voor het leren en terugroepen, zowel in de gezondheid en de ziekte. Hier is een voorbereiding die chronische optische toegang tot de rughippo campus in levende muizen mogelijk maakt gedetailleerd. Dit preparaat kan worden gecombineerd met twee-photon optische beeldvorming op cellulaire en subcellulaire resolutie in hoofd vaste, verdoofd levende muizen over meerdere weken. Deze technieken maken herhaalde beeldvorming van neuronale structuur of activiteit-Evoked plasticiteit in tientallen tot honderden neuronen in de rughippocampal CA1. Bovendien kan deze chronische voorbereiding worden gebruikt in combinatie met andere technieken zoals micro-endoscopie, hoofd-gemonteerde brede veld microscopie of drie-Fobe microscopie, waardoor de gereedschapskist sterk wordt uitgebreid om cellulaire en netwerkprocessen te bestuderen die betrokken zijn in leren en geheugen.

Aangezien de canule is geplaatst net rugvin aan Ca1, het rugaspect van de Ca1 is meer proximale aan de Microscoop als in vergelijking met de ventrale één. De alveus is de meest proximale structuur gevolgd in volgorde door stratum Oriens (so), stratum pyramidale (SP), stratum radiatum (SR) en stratum lacunosum moleculare (SLM), de meest distale laag (figuren 1B , C). Longitudinale 2P beeldvorming van neuronale structuur met subcellulaire resolutie en van activiteit-Evoked plasticiteit met cellulaire resolutie worden gepresenteerd als representatieve resultaten. Om de fluor Foren groene fluorescerende eiwitten (GFP), d2Venus en TurboFP635 te prikkelen, wordt een femtosecondelaser gepulseerde TI: saffier laser afgestemd op 920 nm gebruikt en het gemiddelde Laser vermogen wordt aangepast tot 5-25 mW bij het monster. De verschillende emissie golflengten worden gescheiden door middel van emissie filters en verschillende fotomultiplicatorbuizen.
Longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische stekels dynamiek.
Om te dun etiket hippocampal PNs en visualiseren hun structuur, een Thy1-GFP transgene muis lijn (M-lijn) wordt gebruikt. Thy1-GFP muizen Express cytoplasmatische verbeterde GFP onder de controle van de Thy1 promotor in een schaars, willekeurige populatie van PNS25. Over het algemeen is de belangrijkste as van CA1 PNs ruwweg loodrecht op het XY-Imaging vlak (figuren 1B, Fig. 2a en aanvullende film 1). Basale dendrieten strekken zich uit in de SO, van het SOMA naar de canule, terwijl apicale en apicale Tuft dendrites zich in de tegenovergestelde richting uitbreiden naar de canule (aanvullende film 1). Aangezien de voorbereiding de diepste vezels van de alveus intact laat, moeten een paar fluorescerende vezels die het gezichtsveld doorkruisen, net onder de canule, zichtbaar zijn (Figuur 2a en film 1). De voorbereiding maakt het mogelijk om de PN-dendrites te Imaging met rugresolutie (Figuur 2 A-C). Voorbeeld dendrites en dendritische stekels, een 25X 1,0 NA, 4 mm WD, water onderdompeling commerciële objectief objectief wordt gebruikt.
Voor longitudinale tracking worden verschillende hersengebieden binnen het gezichtsveld van de canule gedefinieerd tijdens de eerste beeldvormings sessie. Elke regio komt overeen met een oppervlakte van ongeveer 240 x 240 μm en bevat tussen 1 en 7 dendritische segmenten (Figuur 2b). Deze gebieden worden handmatig toegewezen aan een driedimensionale stapel met een lage vergroting die het patroon van GFP-expressie weergeeft in het volume onder de beeldvormings canule (Figuur 2a). Vervolgens worden 1 μm z-Step beeld stapels van CA1 PN basale dendrites verworven op verschillende tijdstippen (van 24 uur tot 3 dagen) gedurende maximaal 14 dagen (figuur 2c). Langere beeldvormings duur en intervallen zijn mogelijk26. Elke beeldvormings sessie duurt ongeveer 60 tot 90 min. Hoewel de meeste beelden van dendritische stekels zijn, is het ook mogelijk om dendritische stekels te afbeelden in de schuine dendrites van SR (figuren 2D-F). Naast de dichtheid van de wervelkolom, deze methode maakt de studie van de wervelkolom dynamiek door het kwantificeren van hun overleving, winst en verlies tarieven26,27,28,29,30, 31 , 32. om dendritische stekels na verloop van tijd te scoren en te volgen (figuur 2c), wordt een aangepaste MATLAB-interface gebruikt. Hierdoor kan de uitlijning van de beeld stapels verworven op verschillende tijdstippen en ondersteunt handmatige labeling van dendrites en stekels tijdens het volgen van dendritische lengtes en wervelkolom posities na verloop van tijd26. Belangrijk is dat deze methode kan worden gebruikt om onderscheid te maken (per tijdpunt, met uitzondering van de eerste) tussen reeds bestaande en pasgeboren dendritische stekels. Dit is belangrijk omdat de verschillende klassen van dendritische stekels worden verondersteld te hebben verschillende rollen in geheugen verwerving en retentie33.
Longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit.
Om beeld activiteit-Evoked plasticiteit in Ca1 PNS, de rugvin Ca1 hippocampal gebied wordt geïnjecteerd met een virale vector uitdrukken groen fluorescerende gedestabiliseerde d2Venus via een verbeterde vorm van de synaptische activity-responsief element (E-SARE) binnen de Arc Enhancer/promotor en Red fluorescent TurboFP635 via de Epgk Promoter34. Dit zorgt voor Imaging niveaus van activiteit-Evoked plasticiteit van honderden CA1 PNs in elk dier35. Gezien de zeer dichte labeling van PNs, het is over het algemeen niet mogelijk om op te lossen de dendrites van CA1 PNs (aanvullende film 2).
Om het beeld van de somata van CA1 PNs, een 40X 0,8 NA, 3 mm WD, water onderdompeling objectief lens wordt gebruikt. Voor longitudinale tracking worden 1 tot 9 hersengebieden per muis gedefinieerd tijdens de eerste beeldvormings sessie. Elke regio komt overeen met een oppervlakte van ongeveer 300 x 300 μm en bevat tussen 50 en 150 cellen (Figuur 3a). Deze regio's worden handmatig toegewezen aan lokale weefsel monumenten die zichtbaar zijn bij een lagere vergroting. Vervolgens worden 3 μm z-Step beeld stapels verworven, die de SP van CA1 PNs (Figuur 3a en aanvullende film 2) op verschillende tijdstippen (van 24 uur tot 6 dagen) voor maximaal 30 dagen omvatten. Elke Imaging sessie duurt ongeveer 60 tot 90 min. E-SARE activatie pieken 6 tot 8 h na blootstelling aan een nieuwe of verrijkte omgeving (EE, Figuur 3b) en vervalt in de loop van een paar dagen. Dus, we over het algemeen beeld 6 aan 8 h na ervaring en toestaan voor 5 dagen tussen Imaging sessies35.
Om d2Venus-en TurboFP635 fluorescentie waarden te kwantificeren, wordt een cirkelvormig gebied van 4,64 μm in diameter getekend, dat kleiner is dan een neurale cellichaam, gecentreerd op de cel Soma. We gaan dan verder naar het volgende tijdpunt, scoren het SOMA van dezelfde cel op dezelfde manier en herhalen deze procedure voor alle tijdpunten en alle zichtbare cellen in de longitudinale gegevensset. De gemiddelde waarde van elke neuron (activiteitsafhankelijke) d2Venus-emissie wordt genormaliseerd door de gemiddelde (activiteitsonafhankelijke) TurboFP635 emissie. Deze methode maakt het onderzoek van de lange termijn dynamiek van ensemble plasticiteit van CA1 PNs35 (figuur 3c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig1.jpg"> Figuur 1: voorbereiding voor in vivo diepe hersenen optische beeldvorming. (A). boven (links) en zijkant (rechts) weergaven van voorbeeld beeldvormings cannuals. Imaging canules hebben een transparante glazen bodem om optische toegang tot de Hippocampus mogelijk te maken. (B). schematische beschrijving van het preparaat dat de relatieve positie van de beeldvormings canule, een Ca1-PN en de drie lagen van vezels van rugvin tot ventrale benadrukt. (C, D). Schematische beschrijving van de installatie van Imaging (C) en van de fixatie van het dier (D) tijdens een beeldvormings sessie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig2.jpg"> Figuur 2: Longitudinale beeldvorming van dendritische structuur en dendritische stekels dynamiek. (A). 2p beeld stapel (maximale intensiteit projectie (MIP) van 59 beeld vlakken, 2 μm z-afstand) van neuronen en dendrites gelabeld door GFP in een live THY1-GFP muis. (B). hogere vergroting (MIP van 53 beeld vlakken, 1 μm z-afstand) met gedetailleerde Details van basale dendrites die zich in so bevinden. (C). de sequentie van een dendritisch segment dat gedurende 14 dagen is afgebeeld. Pijlpunten geven dendritische stekels aan die gedurende 14 dagen worden bijgehouden. (D, E). 2P beeld stapel van neuronen en dendrites gelabeld door GFP in een live Thy1-GFP muis; D) zy projectie (31 beeld vlakken, 3 μm z-Spacing) en (E) XY projecties (17 beeld vlakken, 3 μm z-Spacing). (F). hogere vergrotingsfactor (enkelbeeld vlak) met gedetailleerde apicale dendrites en dendritische stekels die zich in SR. pijlpunten duiden op dendritische stekels. Excitatie: 920 nm; emissie piek: 510 Nm. Schaal stangen: A, 50 μm; B, 10 μm; C, 2 μm; D en E, 15 μm; F, 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig3.jpg"> Figuur 3: Longitudinale beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. (A). 2p-afbeeldingen (afzonderlijke afbeeldings vlakken) van een live-muis, met dezelfde cellen op baseline dag 0 en na ee op dag 1. (B). 2p-beeld stapels (mip's van 4-6-beeld vlakken, 3 μm z-afstand) met E-SARE-activerings patronen die specifiek zijn voor omgeving a (dagen 1, 19 en 25) en milieu B (dagen 7 en 13). Groen: d2Venus fluorescentie. Rood: TurboFP635 fluorescentie. Excitatie: 920 nm; d2Venus emissie piek: 530 nm; TurboFP635 emissie piek: 635nm. Schaal staven: A, 20 μm; B, 10 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Attardo et al., 201835. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig4.jpg"> Figuur 4: Beeldvorming van neuronale structuur in hippocampal DG met behulp van drie-photon (3P) microscopie. (a-H). 3P-beelden (enkele beeld vlakken) van neuronen en dendrites gelabeld door GFP in een live Thy1-GFP muis detaillering (A-E) PNs in de CA1 en (F-H) submodule cellen in het DG. Excitatie: 1400 nm; emissie piek: 510 Nm. Schaalbalk: 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende film 1: Imaging Field of View in een live Thy1-GFP-muis. 2P-beeld stapel (83-beeld vlakken, 7 μm z-afstand) van neuronen en dendrites gelabeld door GFP (wit) in een levende Thy1-GFP-muis die zich uitstrekt van de bodem van de canule naar SLM. Om rekening te kunnen maken met het verval van het fluorescentie signaal met toenemende diepte, gebruikten we een niet-lineaire gradiënt van de gain van fotomultiplicator tubes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_1_FINAL.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende film 2: beeldvorming van activiteit-Evoked plasticiteit. 2P beeld stapel (28 beeld vlakken, 3 μm z-afstand) van neuronen die E-SARE reporter van IEG expressie uitdrukken in een live muis met SP. groen: d2Venus fluorescentie. Rood: TurboFP635 fluorescentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_2_FINAL.avi">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Deze procedure biedt herhaalde optische toegang tot de rug hippocampus van levende muizen om de mechanismen van geheugenvorming en terugroepen te bestuderen terwijl ze leertaken uitvoeren. Deze techniek maakt het gebruik van lichte microscopie mogelijk om de rug hippocampus van levende muizen op micrometerniveau ruimtelijke resolutie longitudinally over verscheidene weken te bestuderen. Geheugenverlies is een algemeen kenmerk van sommige hersenziekten zoals de ziekte van Alzheimer.Inzicht in het mechanisme van geheugenvorming en terugroepen kan uiteindelijk helpen patiënten die lijden aan deze ziekten. Deze methode kan worden toegepast op andere diersystemen met een schedel, zoals kleine zoogdieren. Het monitoren van vitale functies tijdens een overlevingsoperatie kan zowel afleidend als stressvol zijn.Het kan nuttig zijn om eerst de procedure voor een dood dier uit te voeren om zich te concentreren op de meer cruciale aspecten van de procedure. Om de beeldvormings canule voor te bereiden, snijdt u eerst een roestvrijstalen buis met een diameter van drie millimeter in een 1,6 millimeter lange metalen ring. Als de randen van de ring niet stomp zijn na het snijden, bestand uit de onregelmatigheden.Gebruik vervolgens een paar tangen om een kant van de metalen ring in een UV-uitharding optische lijm te dompelen. Plaats vervolgens de metalen ring in het midden van een glazen coverslip met de zijkant van de ring bedekt met lijm aanraken van de coverslip. Zet de UV-uitharding LED-driver unit en schijn 365 nanometer golflengte licht op de lijm voor een minuut om de lijm te genezen.Zorg ervoor dat alle zijden van de ring gelijkmatig verlicht zijn door de richting van de lichtbron te veranderen. Nadat de lijm ten minste twee uur is uitgehard, houdt u de canule van het open uiteinde van de metalen ring stevig vast door middel van een hemostat. Met behulp van een tandheelkundige boor uitgerust met een roterend bestand, bestand uit de overtollige glazen coverslip totdat het wordt gespoeld met de zijkanten van de ring.Bereid de vereiste instrumenten voor en verdoof de muis zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Verwijder vervolgens het haar en desinfecteer de huid over het muizenhoofd. Gebruik vervolgens een schaar en tang om een kleine snede in de hoofdhuid te maken in de positie dicht bij lambda.Beweeg zijwaarts in de richting van de oren dan rostrally in de richting van de oogbanen om een driehoek op de sagittale as te vormen ongeveer vier millimeter rostral aan bregma. Breng een druppel lidocaïne aan op de schedel. Na twee minuten, duidelijk het periosteum en droog de schedel met behulp van een wattenstaafje.Plaats vervolgens de oorbalken om het hoofd van de muis te bevestigen. Met behulp van een micro-boor met een 0,5 millimeter breed braam, maak een klein gaatje in het frontale bot tegenover de afgebeelde hippocampus ongeveer 1,5 millimeter van de sagittale hechting en twee millimeter distal van de coronale hechting. Schroef vervolgens een roestvrijstalen botschroef van 0,86 millimeter breed in het schedelgat.Zet het op zijn plaats met behulp van lijmcement. Laat het cement 30 seconden tot een minuut drogen. Gebruik vervolgens een trephine-boor met een diameter van drie millimeter om een klein gaatje in het pariëtale bot te maken.Plaats het gat ongeveer 1,5 millimeter distaal van de sagittale hechting en twee millimeter distaal van de lambdoïde hechting. Verwijder voorzichtig de botflap. Verwijder vervolgens de hersenvliezen met behulp van Dumont tangen.Ablate corticale materie om de externe capsule te bereiken. Gebruik een 19-meter stompe naald aangesloten op een vacuümpomp en bevloeien met zoutoplossing om uitdroging van het blootgestelde weefsel te voorkomen en weg te wassen alle resterende bloed na het bloeden is opgelost. Zuig corticale weefsel langzaam ongeveer 50 tot 100 micron per keer totdat de cortex loskomt van de capsule bloot de vezels van het cingulum of het corpus callosum.Schil vervolgens voorzichtig de rugvezels tot de diepste vezels, de alveus van de hippocampus worden blootgesteld. Spoel het weefsel af met zout. Gebruik vervolgens dunne tangen om de onderste canule in zout te dompelen en deze over het schedelgat te plaatsen.Duw vervolgens de canule in de schedel totdat de glazen coverslip in contact is met de vezels. Droog de schedel en breng een snelle lijm cement over de schedel om de canule op zijn plaats te houden. Zorg ervoor dat u ook lijm aanbrengen op de rand van de canule, maar wees voorzichtig niet te laten de lijm lopen in de canule.Eenmaal droog, gebruik dan een stereotaxic arm om een hoofdhouder plaat positie over de canule in contact met de schedel. Bereid een mengsel van tandheelkundige acryl en breng het vervolgens over de hele schedel. Bedek de gehele blootgestelde schedel, de schroef en de open huid met gebits acryl om het preparaat te stabiliseren.Breng na 15 minuten een verwijderbare kleeffolie aan op de hoofdhouderplaat om te voorkomen dat er vuil in de canule komt. Wanneer klaar om de hersenen beeld, opnieuw volgen in de begeleidende tekst protocol voor details over verdoving. Gebruik, eenmaal voldoende verdoofd, tangen om de kleeffolie voorzichtig van de hoofdhouderplaat te verwijderen.Verwijder de folie voorzichtig om beschadiging van het preparaat te voorkomen. Plaats vervolgens de muis onder de microscoop over het verwarmingstapijt en bevestig de hoofdplaat aan de houder. Breng oogzalf aan op de ogen van het dier.Reinig vervolgens de beeldvormingskanule met behulp van een spuit en een dunne naald om gedeïoniseerd water in de canule te laten vallen, gevolgd door verwijdering met een vacuümpomp. Gebruik doelstellingen voor een lage vergroting op lange werkafstand om de canule visueel te controleren op restwater, vuil, integriteit en de aanwezigheid van fluorescentie. Vervolgens lijn de canule op de optische as door het aanpassen van de hoeken van de hoofdhouder armen.Schakel over naar een 25X-doelstelling met een numeriek diafragma van 1.0 en een werkafstand van vier millimeter. Voeg vervolgens voldoende gedeïsized water toe aan de canule om het te vullen en overtollig water op de top van de canule te behouden. Gebruik ten slotte twee fotonexcitatie en beeld de fluorescentiesignalen.Hier getoond is een 2P beeld stapel van een thy1-GFP transgene muis hersenen. Thy1-GFP muizen uiten cytoplasma verbeterde GFP onder de controle van de Thy1 promotor in een schaarse willekeurige populatie van piramidale neuronen. Over het algemeen staat de belangrijkste as van piramidale neuronen in de rug hippocampal CA1 ongeveer loodrecht op het XY-beeldvormingsvlak.Deze gebieden worden handmatig toegewezen aan een driedimensionale lage vergrotingsstapel met het patroon van GFP-expressie in het volume onder de beeldvormingsblikule. Voor longitudinale tracking worden verschillende hersengebieden binnen het gezichtsveld van de canule gedefinieerd. Elke regio komt overeen met een gebied van ongeveer 240 bij 240 micrometer en bevat tussen één en zeven dendritische segmenten.De afgebeelde serie hier toont een micrometer z-stap beeld stapels CA1 piramidale neuronen en basale dendrieten verworven op verschillende tijdsintervallen gedurende 14 dagen. Echter, langere beeldvorming duur en intervallen zijn mogelijk. Hoewel de meeste beelden van dendritische stekels in de stratum oriens zijn, is het ook mogelijk om dendritische stekels in de schuine dendrieten van het stratum radiatum te beelden.Een andere uitbreiding van deze techniek is om beeldactiviteit-opgeroepen plasticiteit in CA1 piramidale neuronen door het injecteren van de dorsale CA1 hippocampal gebied met een virale vector. Dit zorgt voor de plasticiteit van honderden CA1 piramidale neuronen in elk dier te meten hier weergegeven als een 2P-beeldstapel. Het is van cruciaal belang om schade aan de hippocampus te voorkomen bij het verwijderen van het bovengaande weefsel.Bovendien moet men de canule correct plaatsen om een stabiele voorbereiding te garanderen. De beschreven voorbereiding maakt het gebruik van verschillende soorten optische beeldvorming mogelijk, zoals miniatuurmicroscopen die op het hoofd van het dier kunnen worden geïmplanteerd. Dit stelt de onderzoeker in staat om neuronale activiteit te volgen in vrij bewegende dieren.Oorspronkelijk werd de techniek gebruikt om structurele plasticiteit in hippocampal neuronen te bestuderen. Vandaag, het wordt uitgevoerd in het bestuderen van neuronale activiteit ook in andere hersengebieden.

longitudinal-two-photon-imaging-of-dorsal-hippocampal-ca1-in-live-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Source: Maruoka, H., et. al. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (2022)     This video shows a two-photon microscopy procedure for imaging neuronal activity and microglial dynamics in an awake mouse during visual stimulation, highlighting calcium transients and cellular interactions.

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Source: Ulivi, A. F., et. al. Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice. J. Vis. Exp. (2019) This video demonstrates longitudinal two-photon imaging of fluorescently-labeled pyramidal neurons in a live mouse, showcasing the preparation, cannula alignment, and imaging of dendrites and dendritic spines to study neuronal structure in the hippocampal CA1 region.

Longitudinal Two-Photon Imaging of Fluorescently Labeled Neurons in a Live Mouse Hippocampus 

Source: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the setup and imaging process for in vivo two-photon microscopy of microglial dynamics in the hippocampal CA1 (Cornu ammonis 1) and dentate gyrus, ensuring optimal optical alignment and structural integrity assessment.

In Vivo Two-Photon Imaging of Microglial Dynamics in the Mouse Hippocampus

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.

Twee-foton Beeldvorming Calcium in Muizen navigeren van een Virtual Reality-omgeving

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer longitudinale two-photon beeldvorming van de dorsale hippocampus CA1 bij levende muizen. Deze methode maakt onderzoek naar neuronale plasticiteit en geheugenprocessen op micrometerniveau gedurende meerdere weken mogelijk.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Meer video's verkennen