Name: Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Leer hoe u protocatechuaat 3,4-dioxygenase (PCD) produceert en zuivert voor zuurstofverwijdering in waterige systemen. Dit protocol garandeert hoog actief enzym zonder detecteerbare nuclease-verontreinigingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH GM121284 en AI126742 to KEY.

1. induceren PCD expressie in E. coli
<ol><li>Combineer 1 μL pVP91A-pcaHG-expressie plasmide (20 ng/μL, Figuur 1A) en 20 μl E. coli BL21 (in de handel verkrijgbare cellen van 20 μl, > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in een buisje. Veeg de buis om te mengen. Plaats de buis op ijs 5 min.</li>
	<li>Plaats de transformatie bij 42 °C gedurende 30 sec. Vervolgens ijs 2 min.</li>
	<li>Voeg 80 μL Soc-media (Super optimale bouillon met van-onderdrukking: 2,5 mm KCl, 10 mm NaCl, 2% Tryptone, 0,5% gistextract, 10 mm MgSO4, 10 mm MgCl2, 20 mm glucose) toe. Schud bij 225 omwentelingen per min (rpm) 37 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Plaat de transformatie reactie op LB amp agar (1L Luria Bouillon agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-Tryptone, 5 g gistextract, 15 g agar, 50 μg/mL ampicillaire; 25 mL per 10 cm diameter petrischaaltje).</li>
	<li>Incueren van de plaat, deksel naar beneden, bij 37 ° c voor 16-18 h.</li>
	<li>Inoculeren 50 mL LB amp (1L LB: 10 g bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g gistextract, 50 μg/mL ampicilinus) in een erlenmeyer kolf van 250 mL met één kolonie. Inincuberen bij 37 °C voor 16-18 h schudden bij 225 rpm.</li>
	<li>Breng 20 mL cultuur over naar een 4 L kolf met 1 L LB amp. Schud bij 225 rpm bij 37 °C.</li>
	<li>Elke h meet de cultuur OD600 (optische dichtheid bij 600 nm). Naarmate de cultuur OD600 nadert 0,5, Verhoog de frequentie van metingen naar elke 15 min. De gewenste dichtheid van de cultuur is 0,5 OD600.</li>
	<li>Breng de kolf van 4L over in een bak ijs. Draai de kolf in het ijsbad om de cultuur temperatuur te verlagen. Opmerking: De tijd op ijs moet tot een minimum worden beperkt, zodat de cellen metabolisch actief blijven. Idealiter zullen de cellen op ijs minder dan 10 min.</li>
	<li>Succesvolle inductie van PCD kan worden waargenomen door denaturering natriumdodecylsulfaat Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) analyse. Oogst 1 mL van de niet-geïnduceerde cultuur in een buisje. Draai het monster 1 min bij 14.000 x g in een microfugebuis bij omgevingstemperatuur. Decanterende het supernatant.<ol>
<li>Solubiliseer de gepelleteerde cellen in 150 μL PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing).</li>
		<li>Voeg een gelijk volume van 2x laad kleurstof toe (1,2% SDS, 30% glycerol, 150 mm tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% broomfenolblauw, 15% β-mercaptoethanol). Vortex het monster grondig mengen.</li>
		<li>Kook het monster 3 min en breng het over naar ijs. Het monster kan worden opgeslagen in een vriezer van-20 °C voor toekomstige analyse. Opmerking: PBS is in de handel verkrijgbaar met of zonder CaCl2 en MgCl2. Veel laboratoria zullen PBS hebben zonder CaCl2 en MgCl2 voor celkweek methoden. We hebben geen verschil gevonden met PBS met of zonder CaCl2 en MgCl2.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng de kolf van 4 L over in een incubator bij 17 °C met 180 rpm schudden. Blijf elke 20 minuten de OD600 monitoren.</li>
	<li>Bij 0,7 OD600 Voeg Isopropyl-Beta-D-thiogalactopyranoside (iptg) toe aan 0,5 mm eindconcentratie (0,25 M voorraadoplossing) en 10 mg/L ammoniumijzer (II) sulfaat-hexahydraat (Fe (NH4)2(dus4)2, 10 mg/ml stockoplossing). PCD-genen Pcah en pcag worden geïnduceerd door de promotor T5 door toevoeging van iptg (Figuur 1A). Ijzersulfaat is gebonden door PCD en vereist voor katalytische activiteit door het coördineren van zuurstof tijdens het openen van de catechol.</li>
	<li>Schud de cultuur bij 180 rpm bij 17 °C gedurende 18 uur.</li>
	<li>Plaats de kweek kolf in ijs zoals in 1,2. Oogst 1 mL van de geïnduceerde cellen voor SDS-PAGE zoals in 1,3.</li>
	<li>Giet de bacteriecultuur op flessen die geschikt zijn voor centrifugeren. Een 1 L cultuur kan worden gecentrifugeerd in 4 250 mL conische bodem flessen. Pellet de cultuur bij 4 °C gedurende 20 minuten bij 3000 x g. Decante de supernatants. Verwijder bacterieel vloeibaar afval op de juiste manier.</li>
	<li>Pipet om de pellets te hervatten in 25 mL koude PBS (CaCl2 en MgCl2 zijn optioneel) per 1 L-cultuur.</li>
	<li>Breng de resuspensie over naar 50 mL conische buizen (1 50 mL Tube per 1 L cultuur). Pellet de cellen bij 3000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Decaneer het supernatant en gooi het op de juiste manier weg.</li>
	<li>Respendeer de cellen in 10 mL lysisbuffer (300 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazol, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine en 87,1 μg/mL fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) door pipetteren. Vries de resuspensie met vloeibare stikstof in een Dewar kolf. Bewaar de monsterbuisjes in een vriezer van 80 °C. We hebben het gezuiverde PCD van pellets opgeslagen bij-80 °C gedurende één jaar zonder duidelijk verlies van activiteit.</li>
	<li>Vergelijk de niet-geïnduceerde en geïnduceerde cellen door SDS-PAGE. Opmerking: We hebben geen moeite met inductie van PCD heterodimer. We raden echter aan om de inductie te testen voordat u doorgaat met de zuivering in het geval dat een reagens onverwacht is verlopen.<ol>
<li>Montage platen voor SDS-PAGE (afmetingen: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm dik). De stapel gel is 1,5 mL 6% poly acrylamide (6% acrylamide, 125 mM tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). De oplossend gel is 3,5 mL 12% poly acrylamide (12% acrylamide, 375 mM tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Plaats een 10-put-kam aan de stapel slaag.</li>
		<li>Plaats 10 μL van niet-geïnduceerde en geïnduceerde bacteriële monsters. Plaats 4 μL voorgebeitst molecuulgewicht markers voor eiwitten (Figuur 1B).</li>
		<li>Elektroforese de gel bij 16,5 V/cm ongeveer 1 h. De broomfenolblauw moet de bodem van de gel bereiken.</li>
		<li>Plaats de gel in Coomassie Blue Stain (10% azijnzuur, 40% methanol, 0,1% Coomassie Blue Dye) in een plastic kuip. De vlek moet de gel volledig onderdompelen. Vlek bij omgevingstemperatuur gedurende 20 min. zachte rotatie tijdens het kleuren is optioneel.</li>
		<li>Vervang de oplossing doorlaat (10% azijnzuur, 40% methanol). Inincuberen bij omgevingstemperatuur met optionele zachte rotatie tot de eiwit banden goed zichtbaar zijn.</li>
		<li>Vervang de laat door gedeïoniseerd water. Onder de bacteriële eiwitten, de geïnduceerde PCD subeenheden moeten worden zichtbaar in de geïnduceerde cellen. Hexahistidine Tagged PCD subeenheid pcaH heeft een molecuulgewicht van 28,3 kDa en de pcaG-subeenheid is 22,4 kDa. Als de PCD subeenheden niet duidelijk, een nieuwe inductie afgeleid van een roman kolonie moet worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
</ol>2. nikkel-affiniteits chromatografie zuivering van PCD
<ol><li>Ontdooien op ijs 1 50 mL buis van geïnduceerde cellen. Het kan 2-3 uur duren om het monster volledig te ontdooien.</li>
	<li>Houd de buis op ijs, sonificeren het monster met 30% amplitude gedurende 1 minuut, fietsen 1 s aan en uit. Gebruik een taps toelopende microtip (diameter 0,125 inches) sonicator. Het maximale vermogen is 400 W en de frequentie is 20 kHz en per 1 L kweek korrel.</li>
	<li>Na sonicatie, voeg lysozym toe aan 0,2 mg/ml eindconcentratie (10 mg/ml stockoplossing) en blijf 30 minuten op ijs bij 4 °c.</li>
	<li>Giet het bacteriële lysaat in een voorgekoelde polycarbonaat fles (afmetingen: 25 mm x 89 mm). De fles moet compatibel zijn met een vaste hoek ultracentrifuge rotor. Andere buizen en/of rotors mogen worden vervangen, maar de uiteindelijke zwaartekracht moet worden gehandhaafd.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 60 min bij 120.000 x g bij 4 °C. Cellulair puin zal een pellet vormen. Het supernatant kan geel lijken.<ol>
<li>De pellet kan worden opgenomen in volgende SDS-PAGE-analyse om de oplosbaarheid van PCD te bepalen (Figuur 1B). Solubiliseer de pellet door grondig in 10 ml PBS. Breng 150 μL over in een buis van 1,5 mL. Bereid het monster voor SDS-PAGE zoals in 1,3.</li>
	</ol></li>
	<li>Giet de supernatant in een koude 50 mL conische buis. Noteer het volume. Verontreiniging van het supernatant met bacterieel DNA kan een viskeuze monster opleveren. Het bacteriële genomische DNA kan de kolom stroom blokkeren. De ultracentrifugatie stap 2,2 moet worden herhaald om het bacteriële DNA te pellet. Een pellet uit deze tweede spin kan niet gemakkelijk zichtbaar zijn of transparant zijn.</li>
	<li>Maak 500 mL ni buffer A (300 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, en 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine, en 87,1 μg/mL PMSF) en 500 mL ni buffer B (300 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine, en 87,1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazol, pH 8,0). Passeren beide ni buffers door middel van 0,2 μm porie filters.</li>
	<li>Het monster, de buffers en het FPLC-systeem (Fast proteïne Liquid Chromatography) bevinden zich in een gekoelde ruimte bij 4 °C. Was pomp A met ni buffer A en pomp B met ni buffer B. was het systeem met 20 mM imidazol (8% ni buffer B, 92% ni buffer A) totdat de UV en geleidbaarheid stabiliseren. We routinematig stroom buffers bij 5 mL/min met een 1,0 MPa druk limiet. De stroomsnelheid en de druk grens moeten worden bepaald aan de hand van de specificaties van het gebruikte FPLC-instrument.</li>
	<li>Bereid een kolom voor met 1,5 mL nikkel-geladen hars (afmetingen: 110 mm lang x 5 mm). De hars bindende capaciteit is 50 mg/mL en kan 1 MPa druk verdragen. Een kolom kan vóór zuivering op 4 °C worden gegoten en opgeslagen. Opmerking: De grootte van de kolom kan proportioneel worden verhoogd om meer dan 1 50 mL buis van geïnduceerde cellen te ontvangen als er meer eiwitten nodig zijn. We geven de voorkeur aan een nieuwe kolom voor elke bereiding om ervoor te zorgen dat geen enkele eiwitten ons gewenste eiwit verontreinigen. Nikkel harsen kunnen echter volgens de instructies van de fabrikant worden gerecycled.</li>
	<li>Bevestig de kolom nikkel geladen hars aan de FPLC. Voer 20 mL van 92% ni buffer A en 8% ni buffer B (20 mM imidazol) bij 0,5 mL/min met een 0,5 MPa druk grens door de kolom om te equilibreren. In real-time moet de FPLC een280 (280 nm UV-extinctie) en geleidbaarheid meten. Als deze waarden niet zijn gestabiliseerd nadat 20 mL volume door de kolom is gepasseerd, stroom de buffers totdat ze zijn gestabiliseerd.</li>
	<li>Laad het monster in de kolom (~ 10 mL) bij 0,15 mL/min. Stel de druk limiet in op 0,5 MPa. Verzamel de stroom door.</li>
	<li>Was de kolom met 20 mL ni buffer bij 20 mM imidazol (92% ni buffer A en 8% ni buffer B). Bewaar de was in een tube van 50 mL voor analyse. Was de kolom met 15 mL 50% ni buffer A en 50% ni buffer B (125 mM imidazol). Verzamel de elutie in 19 fracties van 0,8 mL volume. Was de kolom met 15 mL 100% ni buffer B. Verzamel een extra 75 fracties van 0,2 mL. Sommige PCD heterodimer zal Elueer in de 50% ni buffer b Wash, maar de meerderheid van de heterodimer zal Elueer in de 100% ni buffer b Wash.</li>
	<li>Analyseer verzamelde fracties op 12% SDS-PAGE gels om de aanwezigheid van PCD te bevestigen. Voeg gelijke volumes van 2X laad kleurstof toe aan de stroom door, was en piek A280 fracties. Kook gedurende 3 min. Transfer naar Ice. Giet 2 12% SDS-PAGE gels (zoals in stap 1,7). Herhaal de gelmethode zoals beschreven in 1,7.</li>
</ol>3. Nuclease activiteit assay
<ol><li>Op basis van de SDS-PAGE-analyse identificeert u nikkel-affiniteits fracties die bijna zuivere PCD bevatten. Combineer 5 μL chromatografie Fractie en 500 ng 3 KB supercoiled plasmide pxba + in reactiebuffer (50 mM tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT) met een eindvolume van 50 μL.<ol>
<li>Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Bevatten een negatieve controle (geen toegevoegde eiwitten) en een positieve controle (in de handel verkrijgbare PCD). Stop de reactie met 10 μL stop oplossing (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% oranje G).</li>
		<li>Monsters mogen in een diepvriezer van-20 °C worden bewaard om later te worden geanalyseerd. Elke supercoiled plasmide kan worden gebruikt in een Nuclease Assay, zolang de supercoiled en ontspannen cirkel reactieproducten kunnen worden opgelost door agarose gel elektroforese.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giet een 120 mL 1% agarose gel in 1X TAE ethidiumbromide buffer (40 mM tris-acetaat, 1 mM EDTA, 0,5 μg/mL ethidiumbromide bromide) in een gelgegoten (afmetingen: 15 x 10 cm). Gebruik een 15 goed kam (goed afmetingen: 5mm x 1,5 mm). Wanneer de gel is ingesteld, dompel deze dan onder in 1X TAE ethidiumbromide buffer.</li>
	<li>Analyseer 30 μL van de reacties door agarose gel. Elektroforese bij 10 V/cm bij omgevingstemperatuur gedurende ongeveer 1 uur. De oranje G kleurstof front moet aan het einde van de gel.</li>
	<li>Gebruik een fluorescentie scanner om onmiddellijk het Ethidiumbromide bromide-signaal van de gel te afbeelen. Als een 3 KB plasmide werd gebruikt, zal de langzaamste band ontspannen cirkels op ~ 3,5 KB, lineaire DNA zal lopen op 3 KB, en supercoiled plasmide zal de snelste mobiliteit op ~ 2 KB.<ol>
<li>Bereken het totale pixel volume van elke rijstrook met beeldanalyse software.</li>
		<li>Bepaal het pixel volume van de verschillende DNA-soorten, zoals supercoiled, lineair en verkreukeld cirkels. Gebruik deze waarden om het percentage van elke DNA-soort te bepalen. Bijvoorbeeld, verhoogde aanwezigheid van verkreukeld cirkels geassocieerd met een fractie in vergelijking met de negatieve controle geeft de aanwezigheid van Nuclease. Het pixel volume van verkreukeld cirkels in een baan wordt gedeeld door de pixelwaarde van totaal DNA. Bepaal een percentage door dit getal te vermenigvuldigen met 100.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combineer fracties van de tweede elutie piek die bijna zuivere PCD heterodimer bevatten op basis van SDS-PAGE analyse en minimale tot niet-detecteerbare Nuclease activiteit. Ons typisch gepoolde volume is ~ 2 mL.</li>
	<li>Laad het monster in een centrifugaalfilter eenheid met een 10 kDa moleculair gewicht cutoff. Centrifugeer in een swingende emmer centrifuge bij 4000 x g voor 40 min bij 4 °C. Als alternatief kan een 35 ° vaste hoekrotor worden gebruikt bij 7500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.<ol>
<li>Herhaal de centrifugeren tot het uiteindelijke retentaat volume 100-200 μL is.</li>
		<li>Keer de filtereenheid om en herstel de retentaat door centrifugeren bij 1000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. grootte uitsluiting chromatografie zuivering van PCD
<ol><li>Maak 250 mL grootte uitsluitings chromatografie (SEC) lopende buffer (100 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine, en 87,1 μg/mL PMSF). Geef de buffer door een porie filter van 0,2 μm en bewaar deze bij 4 °C. Opmerking: Voer alle stappen uit in een gekoelde ruimte bij 4 °C. SEC zuivering is optioneel, maar het eiwit moet worden opgeslagen in SEC lopende buffer. Als SEC zuivering wordt weggelaten, de retentaat verzameld in 3.6.2. moet worden gedialyseerd tegen 1 L van SEC-buffer in 10 kDa MWCO-dialyse slang (met moleculair gewicht afgesneden) bij 4 °C 's nachts.</li>
	<li>Een gecrosskoppelde agarose-kolom (grootte uitsluitings chromatografie) (dimesies: 10 mm x 300 mm; 24 mL bedvolume; 25-500 μL monstervolume; 1,5 MPa druk limiet; 2 x 106 da uitsluitings grens; 1 tot 300 kDa scheiding) met SEC lopende Buffer bij 0,5 ml/min. Opmerking: Indien gewenst alternatieve grootte SEC kolommen kunnen worden gebruikt.</li>
	<li>Plaats de geconcentreerde fracties in een injectie kring met een volume van 200 μL. Laad het monster op 0,5 mL/min in de kolom. SEC-resolutie neemt toe met een kleiner laadvolume. Elute met 23 mL SEC lopende buffer en verzamel 94 fracties van 250 μL. De SEC chromatogram moet een enkele een280 piek dat is de PCD heterodimer oplossen. We vinden dat PCD kolom 8,9 ml. De elutie timing zal veranderen met alternatieve SEC kolommen.</li>
</ol>5. PCA-oxidatie en Nuclease activiteit assays
<ol><li>Reacties ter bepaling van zowel de oxidatie van PCA en Nuclease activiteit worden uitgevoerd in een 96-goed vlakke bodemplaat. Monteer reacties in een 96-put op ijs in een koude kamer van 4 °C om vroegtijdige katalyse te voorkomen. Combineer in een eindvolume van 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT, 5 mm PCA, 10 ng/ml supercoiled plasmide pxba + en 10 ΜL individuele PCD SEC fracties. Opmerking: De PCD SEC fracties moeten worden toegevoegd laatste en onmiddellijk voor de analyse als het eiwit zal beginnen met katalyse op het moment van toevoeging.</li>
	<li>PCD-oxidatie van PCA resulteert in een verminderde extinctie van PCA bij 290 nm (A290). Breng de 96 well plate over naar de plaathouder van een plaat lezer die is ingesteld op een inwendige temperatuur van 37 °C. Trek de plaathouder in het apparaat en meet een290 bij 20 s intervallen voor 1 uur. Laat het apparaat de plaat 5 s schudden voor elke meting.</li>
	<li>Na 1 uur de reacties beëindigen door toevoeging van 10 μL stop oplossing (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% oranje G).</li>
	<li>Voorbereiden, laden en uitvoeren van een agarose gel zoals in stap 3,2.</li>
	<li>Beeld en analyseer de agarose-gel zoals in stap 3,3.</li>
	<li>Selecteer fracties met de meeste PCA-oxidatie activiteit en geen waargenomen Nuclease besmetting voor langdurige opslag bij-80 °C. Meet de A280.</li>
	<li>Bereken de totale PCD-concentratie met behulp van de A280 en de extinctiecoëfficiënt (ε280) van 734.700 M-1cm-1.</li>
	<li>Snap bevriezen individuele fracties in vloeibare stikstof. Bewaren in een vriezer van 80 °C. U ook actieve, Nuclease vrije fracties combineren, aliquot, en bevriezen op dezelfde manier. Onze typische opbrengst is 1-2 mg PCD per L-cultuur. Typisch gebruik in een SM-experiment is 3 μg PCD. We hebben gebruikt PCD opgeslagen bij-80 °C voor maximaal 1 jaar zonder afname van de activiteit.</li>
</ol>

<ol><li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li>
<li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li>
<li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li>
<li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+oxygen+induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li>
<li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies%3A+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li>
<li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase1%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zuurstof opruimings systemen worden vaak opgenomen in één molecuul fluorescentiemicroscopie om fotobleaching3,7,8te verminderen. Deze microscopie technieken worden vaak gebruikt om nucleïnezuren of eiwit interacties met nucleïnezuren te observeren1,13,14. Verontreiniging van OSSs met nucleasen kan leiden tot valse resultaten.
<p cla...

Single molecuul (SM) biofysica is een snel groeiend veld dat de manier waarop we naar biologische fenomenen kijken verandert. Dit veld heeft de unieke mogelijkheid om fundamentele wetten van de fysica en chemie te koppelen aan de biologie. Fluorescentiemicroscopie is een biofysische methode die SM-gevoeligheid kan bereiken. Fluorescentie wordt gebruikt om biomoleules te detecteren door ze te koppelen aan kleine organische fluor Foren of Quantum dots1. Deze moleculen kunnen fotonen uitzenden wanneer ze opgewonden worden door lasers voordat ze onomkeerbaar2fotobleaching. Fotobleaching treedt op wanneer de fluorescerende etiketten chemische schade ondergaan die hun vermogen om te prikkelen op de gewenste golflengte2,3vernietigt. De aanwezigheid van reactieve zuurstof soorten (Ros) in waterige buffer zijn een primaire oorzaak van photobleaching2,4. Bovendien kan Ros biomoleules beschadigen en leiden tot foutieve waarnemingen in SM-experimenten5,6. Om oxidatieve schade te voorkomen, kunnen zuurstof opruimings systemen (OSS) worden gebruikt3,7,8. Het glucose oxidase/catalase (GODCAT) systeem is efficiënt in het verwijderen van zuurstof8, maar het produceert potentieel schadelijke peroxiden als tussen producten. Deze kunnen schadelijk zijn voor biomoleules van belang in SM-studies.
Als alternatief, protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) zal efficiënt verwijderen O2 van een waterige oplossing met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA)7,9. PCD is een metalloenzym dat nonheme ijzer gebruikt om PCA te coördineren en de catechol ringopening reactie te katalyseren met behulp van opgeloste O210. Deze One-Step reactie is een algemeen betere OSS voor het verbeteren van de stabiliteit in SM experimenten7. Helaas bevatten veel in de handel verkrijgbare OSS-enzymen, waaronder PCD, contaminerende nucleasen11. Deze verontreinigingen kunnen leiden tot de schade van op nucleïnezuur gebaseerde substraten die in SM-experimenten worden gebruikt. Dit werk zal verhelderden een op chromatografie gebaseerd zuiverings protocol voor het gebruik van recombinant PCD in SM-systemen. PCD kan breed worden toegepast op elk experiment waarbij ROS schadelijke substraten zijn die nodig zijn voor het verzamelen van gegevens.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>&beta;ME</td></tr><tr><td>30% acrylamide en bis-acrylamide oplossing, 29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur, Glaciaal Gecertificeerd ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38C-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Gegranuleerd</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC-systeem</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, en Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 Centrifugaal Filter Unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa MWCO</td></tr><tr><td>Ammonium ijzer (II) sulfaat hexahydraat</td><td>Sigma</td><td>F-2262</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfaat (APS) Tabletten</td><td>Amresco</td><td>K833-100TABS</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Gedehydrateerde Cultuur Media Additief: Flesselgist Extract</td><td>VWR</td><td>90004-092</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS propaan, >=99,0% (titratie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blauw</td><td>Amresco</td><td>0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96&ndash;Well Flat&ndash;Bottom EIA Plate</td><td>Bio-Rad</td><td>2240096EDU</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Gegranuleerde LB Broth Miller</td><td>EMD Biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agarose</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250-250G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Roche</td><td>11017128001</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym uit kippeneiwit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride Hexahydraat</td><td>Amresco</td><td>0288-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Microvolume Spectrophotometer, met cuvetmogelijkheid</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Novagen BL21 Competente Cellen</td><td>EMD Millipore</td><td>69-449-3</td><td>SOC media inbegrepen</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-020-25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>0754-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protocatechuïnezuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15642110</td><td>PCA</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>P212121</td><td>CI-00270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td><td>Molecular Devises</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele Wegwerpfiltereenheden met PES-membraan > 250mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-741-04</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Wegwerpfiltereenheden met PES-membraan > 500mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>Superose 12 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>0761-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 variabele modus fluorescente imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

expressie en zuivering van nuclease-vrije zuurstof scavenger protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Enkelvoudige molecuul (SM) microscopie wordt gebruikt in de studie van dynamische moleculaire interacties van de gelabelde biomoleules in real time. Echter, fluoroforen zijn gevoelig voor verlies van signaal via photobleaching door opgeloste zuurstof (O2). Om fotobleking te voorkomen en de levensduur van de te verlengen, worden zuurstof opruimings systemen (OSS) gebruikt om O2te verminderen. In de handel verkrijgbare OSS kan verontreinigd zijn door nucleasen die nucleïnezuren beschadigen of degraderen, waardoor de experimentele resultaten worden geïnterpreteerd. Hier gedetailleerd een protocol voor de expressie en zuivering van zeer actieve Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) zonder detecteerbare Nuclease besmetting. PCD kan efficiënt verwijderen reactieve O2 soorten door omzetting van het substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA) 3-Carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Deze methode kan worden gebruikt in elk watersysteem waarbij O2 een nadelige rol speelt bij het verzamelen van gegevens. Deze methode is effectief in het produceren van zeer actieve, Nuclease vrije PCD in vergelijking met commercieel beschikbare PCD.

In de handel verkrijgbare zuurstof Scavenger PCD is vaak verontreinigd met een DNA-Nuclease. Contaminerende Nuclease activiteit kan leiden tot valse resultaten in fluorescerende studies, met name studies die DNA analyseren of DNA interactie eiwitten. We hebben geconstateerd dat recombinant PCD, een heterodimer van hexahistidine gelabeld pcaH en pcaG, kan worden uitgedrukt in E. coli (Figuur 1). De heterodimer wordt eerst gezuiverd door nikkel-affiniteits chro...

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisch vrij diatomaire zuurstof verwijderen uit een watersysteem met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA). Dit protocol beschrijft de expressie, zuivering, en activiteit analyse van deze enzym voor het opruimen van zuurstof.

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Ons protocol levert zeer actieve PCD vrij van detecteerbare nuclease, die kan worden gebruikt in elke oplossing waar waterige zuurstof is een verontreiniging. De technieken die we gebruiken zijn eenvoudig te repliceren en zorgen ervoor dat er geen nuclease verontreinigingen aanwezig zijn in het product. Om te beginnen, combineren een microliter van pVP91A-pcaHG PCD expressie plasmid en 20 microliters van commercieel verkrijgbaar E.coli BL21 in een buis.Veeg de buis te mengen, en plaats de buis op ijs gedurende vijf minuten. Om de transformatiereactie voort te zetten, plaatst u de buis in een waterbad op 42 graden Celsius gedurende 30 seconden en vervolgens gedurende twee minuten op ijs. Voeg 80 microliter SOC-media toe en schud een uur lang bij 225 rpm en 37 graden Celsius.Giet vervolgens het transformatiereactiemengsel op een LB-ampicilline agar en gebruik een plaatspreader om het mengsel te verspreiden. Bedek de plaat met een deksel en broed de plaat 16 tot 18 uur in op 37 graden Celsius. Kies daarna een kolonie van de plaat en inent in 50 microliter LB-ampicilline in een Erlenmeyer-kolf van 250 milliliter.Plaats de kolf op een shaker bij 225 rpm om 16 tot 18 uur bij 37 graden Celsius in te broeden. Breng vervolgens 20 milliliter van de geïncubeerde cultuur over naar een vierliter kolf gevuld met een liter LB-ampicilline. Schud bij 225 rpm bij 37 graden Celsius.Elk uur, teken een milliliter van de cultuur in een cuvette om de optische dichtheid te meten op 600 nanometer op een fotometer. Naarmate de optische dichtheid van de cultuur toeneemt in de buurt van 0,5, verhoogt u de frequentie van metingen tot elke 15 minuten, totdat de OD600 0,5 bereikt. Breng vervolgens de vierliter kolf over in een bak ijs.Draai de kolf in het ijsbad om de cultuurtemperatuur te verlagen. Breng de vierliter kolf over naar een couveuse bij 17 graden Celsius en 180 tpm. Blijf de OD600 elke 20 minuten in de gaten houden.Voeg bij 0,7 OD600 IPTG- en ammoniumijzersulfaatsuxahydraatoplossingen toe om een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 0,5 millimolar en 10 milligram per liter te bereiken. Schud de cultuur bij 180 tpm en 17 graden Celsius gedurende 18 uur. Na incubatie, plaats de cultuurfles twee minuten in ijs.Oogst een milliliter van de geïnduceerde cellen in een 1,5-milliliter polypropyleen microcentrifuge buis voor SDS-PAGE analyse. Giet vervolgens de bacteriecultuur in flessen, 500 milliliter per fles, voor centrifugatie. Pellet de cultuur op vier graden Celsius en 3.000 keer g gedurende 20 minuten.Decanteer de supernatants. Pipette om de pellets opnieuw op te stellen, elk in 12,5 milliliter koude PBS, en combineer elke twee resuspensions in een 50-milliliter conische buis. Pellet de cellen weer als voorheen.Gooi vervolgens de supernatants weg en gebruik een pipet om 10 milliliter lysebuffer in elke buis toe te voegen om de cellen opnieuw op te hangen. Na het soniceren van de buizen met geïnduceerde cellen, giet de bacteriële lysate in een voorgekoelde polycarbonaat fles. Centrifugeer gedurende 60 minuten op 120, 000 keer g en vier graden Celsius, en giet de supernatant tot een koude 50-milliliter conische buis.Na het voorbereiden van FPLC-instrument met de nikkel-geladen harskolom, laad het monster op de kolom op 0,15 milliliter per minuut. Was de kolom met 20 milliliter nikkelbuffer bij 20 millimolar imidazool. Bewaar de was in een buis van 50 milliliter voor analyse.Was vervolgens de kolom met 15 milliliter nikkelbuffer bij 125 millimolar imidazool. Verzamel de elutie in 19 fracties van 0,8 milliliter per stuk. Was de kolom opnieuw met 15 milliliter van 100%nikkelbuffer B en verzamel nog eens 75 fracties van 0,2 milliliter per stuk.Ga verder met de analyse van de verzamelde fracties op 12%SDS-PAGE gels om de aanwezigheid van PCD te bevestigen. Voeg eerst 35 microliter reactiebuffer toe aan een 1,5 milliliter polypropyleen microcentrifugebuis. Combineer in de buis vijf microliters van de piekchromatografiefracties en 500 nanogram van drie kilobasispaar supercoiled plasmid pXba.Plaats de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende een uur. Na het bereiden van agarose gel volgens het manuscript, voeg 30 microliter van elke reactie in putten in de gel. Elektrophorese bij 10 volt per centimeter bij omgevingstemperatuur gedurende ongeveer een uur.Nu heeft de oranje G kleurstof het einde van de gel bereikt. Gebruik onmiddellijk een fluorescentiescanner om het ethidium bromidesignaal van de gel in beeld te brengen. Met de functie van de intensiteit en beeld pixelgrootte, bepaal het pixelvolume van de verschillende DNA-soorten, zoals supercoiled, lineaire en gejat cirkels.Als u het percentage van elke DNA-soort wilt bepalen, deelt u het pixelvolume van één DNA-soort door het totale pixelvolume voor alle afzonderlijke soorten. De SDS-PAGE analyse toont aan dat de tweede elutiepiek minimale eiwitverontreiniging bevat, wat bijna zuiver PCD-heterodimeer en minimale tot niet-detecteerbare nuclease-activiteit vertegenwoordigt. Combineer deze 10 fracties van de tweede PCD-elutie dus in een conische buis van vijf milliliter voor verdere analyse.Na grootte-uitsluiting chromatografie zuivering van PCD, in een vier-graden Celsius koude ruimte, combineren in een microcentrifuge buis geschikt volume van natriumchloride, Tris hydrochloride, magnesiumchloride, dithiothreitol, PCA, en supercoiled plasmid pXba om een 5X voorraad te maken. Plaats een 96-well platte bodemplaat op ijs en breng 10 microliter van de gecombineerde 5X-oplossing over naar de putten. Voeg vlak voor de analyse aan elke bron 10 microliters van de afzonderlijke PCD SEC-fracties toe.Stel de plaatlezer in op een interne temperatuur van 37 graden Celsius en breng de plaat van 96 put over naar de plaathouder. Trek de plaathouder in het instrument en meet de absorptie op 290 nanometer met intervallen van 20 seconden gedurende een uur. Stel het instrument in om de plaat vijf seconden voor elke meting te schudden.Voeg na een uur 10 microliter stopoplossing toe aan elke put om de reacties te beëindigen. Voer gel elektroforese uit voor de PCD SEC-fracties. Selecteer breuken met de meeste PCA-oxidatieactiviteit, aangegeven door verminderde absorptie en geen waargenomen nuclease-verontreiniging.Meet de absorptie op 280 nanometer en bereken de totale PCD-concentratie op basis van de absorptie- en uitstervingscoëfficiënt. Bewaar de geselecteerde fracties voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. In dit experiment bleek dat recombinant PCD, een heterodimeer van hexahistidine met pcaH en pcaG, werd uitgedrukt in E.coli.Het heterodimeer werd voor het eerst gezuiverd door nikkel affiniteit chromatografie. De absorptie wordt weergegeven in blauw, en de procentconcentratie van nikkelbuffer B wordt in het rood weergegeven. De flow-through toont de oplosbare bacteriële eiwitten die zich niet binden aan de nikkelmeren.Sommige PCD eluted in de aanwezigheid van 125-millimolar imidazool, maar de meerderheid van het eiwit eluted in 250-millimolar imidazool. Representatieve SDS-PAGE analyse geeft aan dat de fracties van de elution stap vrij waren van verontreinigingen. Agarose gel van nuclease test onthult besmetting door te vergelijken met de negatieve controle zonder toegevoegde eiwitten en een positieve controle besmet met een DNA nuclease.Kwantificering van de verschillende DNA-soorten waargenomen in de agarose gel nuclease test toont fracties 29 tot en met 38 had weinig nuclease activiteit, die werden gekozen om te worden gecombineerd, geconcentreerd, en verder gezuiverd door SEC. Gegevens van drie representatieve SEC fracties bleek dat gezuiverde PCD verminderde de absorptie op 290 nanometer, wat wijst op oxidatie van PCA. Na deze procedure kan de gezuiverde PCD worden gebruikt en geoptimaliseerd in het gewenste zuurstofopruimsysteem.Dit bepaalt de exacte hoeveelheid PCD die nodig is voor het systeem. Deze techniek is gebruikt om fluorofophore levens te verlengen in microscopie-experimenten met één molecuul, waardoor voor langere perioden van gegevensverzameling is toegestaan. De gebruikte ultracentrifuge is gevaarlijk.Zorg ervoor dat centrifuges goed in balans zijn voorafgaand aan het spinnen. Ethidium bromide is een gevaarlijk reagens. Vermijd contact door het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, en gooi het op de juiste manier.

expression-purification-nuclease-free-oxygen-scavenger

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Stabiele isotoop labeling workflows in...

Protease-en Acid-gekatalyseerde Labeling Werkstromen Gebruikmakend<sup&gt; 18</sup&gt; O verrijkte Water

We beschrijven een protocol voor het licht-gekatalyseerde vorming van waterstofperoxide - een cofactor voor oxidatieve transformaties.

Light-driven Enzymatische Decarboxylatie

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Een protocol voor de productie, zuivering en het gebruik van enzymverpakte buitenmembraanvesikels (OMV) dat zorgt voor verbeterde enzymstabiliteit voor implementatie in diverse toepassingen wordt gepresenteerd.

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.

Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Hier presenteren we een protocol voor anaërobe EiwitReiniging, anaërobe eiwitconcentratie en latere kinetische karakterisering met behulp van een zuurstof-elektrode-systeem. De methode wordt geïllustreerd met behulp van het enzym DesB, een dioxygenase enzym die meer stabiel actief en wanneer gezuiverd en in een anaëroob milieu opgeslagen.

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Hier presenteren we een protocol voor de synthese en de karakterisering van nanodeeltjes (nanoceria) oxide cerium voor ROS (reactieve zuurstof soorten) opruiming in vivo, nanoceria in plantaardige weefsels door confocale microscopie en in vivo imaging monitoring van nanoceria ROS opruiming door confocale microscopie.

Katalytische opruiming van Plant reactieve zuurstof soorten In Vivo door anionogene Cerium Oxide nanodeeltjes

We beschrijven een strategie voor het gebruik van RNA-monsters van niet-gerefereerde Pacifische oester specimens en evalueren het genetische materiaal in vergelijking met openbaar beschikbare genoom gegevens om een virtueel gesequentieerde cDNA-Bibliotheek te genereren.

Een convergerende strategie voor het genereren van een virtueel Gesequentieerde cDNA-Bibliotheek van niet-gerefereerde Pacifische oesters

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

Leer hoe u protocatechuaat 3,4-dioxygenase (PCD) produceert en zuivert voor zuurstofverwijdering in waterige systemen. Dit protocol garandeert hoog actief enzym zonder detecteerbare nuclease-verontreinigingen.

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Meer video's verkennen