Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Ons protocol levert zeer actieve PCD vrij van detecteerbare nuclease, die kan worden gebruikt in elke oplossing waar waterige zuurstof is een verontreiniging. De technieken die we gebruiken zijn eenvoudig te repliceren en zorgen ervoor dat er geen nuclease verontreinigingen aanwezig zijn in het product. Om te beginnen, combineren een microliter van pVP91A-pcaHG PCD expressie plasmid en 20 microliters van commercieel verkrijgbaar E.coli BL21 in een buis.

Veeg de buis te mengen, en plaats de buis op ijs gedurende vijf minuten. Om de transformatiereactie voort te zetten, plaatst u de buis in een waterbad op 42 graden Celsius gedurende 30 seconden en vervolgens gedurende twee minuten op ijs. Voeg 80 microliter SOC-media toe en schud een uur lang bij 225 rpm en 37 graden Celsius.

Giet vervolgens het transformatiereactiemengsel op een LB-ampicilline agar en gebruik een plaatspreader om het mengsel te verspreiden. Bedek de plaat met een deksel en broed de plaat 16 tot 18 uur in op 37 graden Celsius. Kies daarna een kolonie van de plaat en inent in 50 microliter LB-ampicilline in een Erlenmeyer-kolf van 250 milliliter.

Plaats de kolf op een shaker bij 225 rpm om 16 tot 18 uur bij 37 graden Celsius in te broeden. Breng vervolgens 20 milliliter van de geïncubeerde cultuur over naar een vierliter kolf gevuld met een liter LB-ampicilline. Schud bij 225 rpm bij 37 graden Celsius.

Elk uur, teken een milliliter van de cultuur in een cuvette om de optische dichtheid te meten op 600 nanometer op een fotometer. Naarmate de optische dichtheid van de cultuur toeneemt in de buurt van 0,5, verhoogt u de frequentie van metingen tot elke 15 minuten, totdat de OD600 0,5 bereikt. Breng vervolgens de vierliter kolf over in een bak ijs.

Draai de kolf in het ijsbad om de cultuurtemperatuur te verlagen. Breng de vierliter kolf over naar een couveuse bij 17 graden Celsius en 180 tpm. Blijf de OD600 elke 20 minuten in de gaten houden.

Voeg bij 0,7 OD600 IPTG- en ammoniumijzersulfaatsuxahydraatoplossingen toe om een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 0,5 millimolar en 10 milligram per liter te bereiken. Schud de cultuur bij 180 tpm en 17 graden Celsius gedurende 18 uur. Na incubatie, plaats de cultuurfles twee minuten in ijs.

Oogst een milliliter van de geïnduceerde cellen in een 1,5-milliliter polypropyleen microcentrifuge buis voor SDS-PAGE analyse. Giet vervolgens de bacteriecultuur in flessen, 500 milliliter per fles, voor centrifugatie. Pellet de cultuur op vier graden Celsius en 3.000 keer g gedurende 20 minuten.

Decanteer de supernatants. Pipette om de pellets opnieuw op te stellen, elk in 12,5 milliliter koude PBS, en combineer elke twee resuspensions in een 50-milliliter conische buis. Pellet de cellen weer als voorheen.

Gooi vervolgens de supernatants weg en gebruik een pipet om 10 milliliter lysebuffer in elke buis toe te voegen om de cellen opnieuw op te hangen. Na het soniceren van de buizen met geïnduceerde cellen, giet de bacteriële lysate in een voorgekoelde polycarbonaat fles. Centrifugeer gedurende 60 minuten op 120, 000 keer g en vier graden Celsius, en giet de supernatant tot een koude 50-milliliter conische buis.

Na het voorbereiden van FPLC-instrument met de nikkel-geladen harskolom, laad het monster op de kolom op 0,15 milliliter per minuut. Was de kolom met 20 milliliter nikkelbuffer bij 20 millimolar imidazool. Bewaar de was in een buis van 50 milliliter voor analyse.

Was vervolgens de kolom met 15 milliliter nikkelbuffer bij 125 millimolar imidazool. Verzamel de elutie in 19 fracties van 0,8 milliliter per stuk. Was de kolom opnieuw met 15 milliliter van 100%nikkelbuffer B en verzamel nog eens 75 fracties van 0,2 milliliter per stuk.

Ga verder met de analyse van de verzamelde fracties op 12%SDS-PAGE gels om de aanwezigheid van PCD te bevestigen. Voeg eerst 35 microliter reactiebuffer toe aan een 1,5 milliliter polypropyleen microcentrifugebuis. Combineer in de buis vijf microliters van de piekchromatografiefracties en 500 nanogram van drie kilobasispaar supercoiled plasmid pXba.

Plaats de buis in een waterbad op 37 graden Celsius gedurende een uur. Na het bereiden van agarose gel volgens het manuscript, voeg 30 microliter van elke reactie in putten in de gel. Elektrophorese bij 10 volt per centimeter bij omgevingstemperatuur gedurende ongeveer een uur.

Nu heeft de oranje G kleurstof het einde van de gel bereikt. Gebruik onmiddellijk een fluorescentiescanner om het ethidium bromidesignaal van de gel in beeld te brengen. Met de functie van de intensiteit en beeld pixelgrootte, bepaal het pixelvolume van de verschillende DNA-soorten, zoals supercoiled, lineaire en gejat cirkels.

Als u het percentage van elke DNA-soort wilt bepalen, deelt u het pixelvolume van één DNA-soort door het totale pixelvolume voor alle afzonderlijke soorten. De SDS-PAGE analyse toont aan dat de tweede elutiepiek minimale eiwitverontreiniging bevat, wat bijna zuiver PCD-heterodimeer en minimale tot niet-detecteerbare nuclease-activiteit vertegenwoordigt. Combineer deze 10 fracties van de tweede PCD-elutie dus in een conische buis van vijf milliliter voor verdere analyse.

Na grootte-uitsluiting chromatografie zuivering van PCD, in een vier-graden Celsius koude ruimte, combineren in een microcentrifuge buis geschikt volume van natriumchloride, Tris hydrochloride, magnesiumchloride, dithiothreitol, PCA, en supercoiled plasmid pXba om een 5X voorraad te maken. Plaats een 96-well platte bodemplaat op ijs en breng 10 microliter van de gecombineerde 5X-oplossing over naar de putten. Voeg vlak voor de analyse aan elke bron 10 microliters van de afzonderlijke PCD SEC-fracties toe.

Stel de plaatlezer in op een interne temperatuur van 37 graden Celsius en breng de plaat van 96 put over naar de plaathouder. Trek de plaathouder in het instrument en meet de absorptie op 290 nanometer met intervallen van 20 seconden gedurende een uur. Stel het instrument in om de plaat vijf seconden voor elke meting te schudden.

Voeg na een uur 10 microliter stopoplossing toe aan elke put om de reacties te beëindigen. Voer gel elektroforese uit voor de PCD SEC-fracties. Selecteer breuken met de meeste PCA-oxidatieactiviteit, aangegeven door verminderde absorptie en geen waargenomen nuclease-verontreiniging.

Meet de absorptie op 280 nanometer en bereken de totale PCD-concentratie op basis van de absorptie- en uitstervingscoëfficiënt. Bewaar de geselecteerde fracties voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. In dit experiment bleek dat recombinant PCD, een heterodimeer van hexahistidine met pcaH en pcaG, werd uitgedrukt in E.coli.

Het heterodimeer werd voor het eerst gezuiverd door nikkel affiniteit chromatografie. De absorptie wordt weergegeven in blauw, en de procentconcentratie van nikkelbuffer B wordt in het rood weergegeven. De flow-through toont de oplosbare bacteriële eiwitten die zich niet binden aan de nikkelmeren.

Sommige PCD eluted in de aanwezigheid van 125-millimolar imidazool, maar de meerderheid van het eiwit eluted in 250-millimolar imidazool. Representatieve SDS-PAGE analyse geeft aan dat de fracties van de elution stap vrij waren van verontreinigingen. Agarose gel van nuclease test onthult besmetting door te vergelijken met de negatieve controle zonder toegevoegde eiwitten en een positieve controle besmet met een DNA nuclease.

Kwantificering van de verschillende DNA-soorten waargenomen in de agarose gel nuclease test toont fracties 29 tot en met 38 had weinig nuclease activiteit, die werden gekozen om te worden gecombineerd, geconcentreerd, en verder gezuiverd door SEC. Gegevens van drie representatieve SEC fracties bleek dat gezuiverde PCD verminderde de absorptie op 290 nanometer, wat wijst op oxidatie van PCA. Na deze procedure kan de gezuiverde PCD worden gebruikt en geoptimaliseerd in het gewenste zuurstofopruimsysteem.

Dit bepaalt de exacte hoeveelheid PCD die nodig is voor het systeem. Deze techniek is gebruikt om fluorofophore levens te verlengen in microscopie-experimenten met één molecuul, waardoor voor langere perioden van gegevensverzameling is toegestaan. De gebruikte ultracentrifuge is gevaarlijk.

Zorg ervoor dat centrifuges goed in balans zijn voorafgaand aan het spinnen. Ethidium bromide is een gevaarlijk reagens. Vermijd contact door het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, en gooi het op de juiste manier.