Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis

De veelgebruikte sonde CFDA, of een afkorting voor carboxyfluoresceïne diacetaat, is niet fluorescerend. De twee H3-groepen en de 3'6'-positie op deze verbinding maken het membraan-permeant. Waar eenmaal in cellen, interne cellulaire acetaat zal verwijderen van de acetaat groepen en laat de nieuwe vorm van CFDA.

Dat is een carboxyfluorescein, of de CF, die fluorescerend is. En omdat deze nieuwe vorm minder membraan-permeant is, het gewicht, moeten alle cellen door de intercellulaire poriën bewegen, of de plasmodesmata in planten, dat maakt dit diacetaat de ideale sonde om intercellulair transport in phloemactiviteit te bestuderen. In de video van vandaag, gaan we de CFD-belasting demonstreren in de wortel en hypocotyl van de Arabidopsis-planten, respectievelijk, en we zullen laten zien hoe de twee iets verschillende procedures de bodem tot bovenste beweging van deze fluorescerende sonde zullen beïnvloeden.

Bereik kleuring resultaten consequent, slaan we de geoogste Arabidopsis zaden in vier Celsius graad, 40% vocht kast. Nieuw geoogste zaden opgeslagen in deze toestand voor meer dan zeven dagen worden gemakkelijk gebruikt voor het zaaien. Om ervoor te zorgen dat elke plant wordt geteeld in een relatief vergelijkbare ruimte in de Petri schotel, zijn we met behulp van een zaad zone rang kaart.

Nu, bevochtiging van de gesteriliseerde tip, duik in de gesteriliseerde zaden, en zaai de zaden een-voor-een op de aangewezen positie. Na het inzaaien, verzegel de Petri schotel met parafilm en een plakband, leg ze op een petrischaalstandaard om het verticaal te laten groeien. Hier zijn de tools die we gaan gebruiken in dit experiment.

Houd er rekening mee dat we de kleurstof beter zo snel mogelijk kunnen laden. Normaal gesproken beëindig je het hele proces in 10 tot 15 minuten. Voordat we het CFDA-laadexperiment uitvoeren, bereiden we altijd een nieuwe CFDA-oplossing.

Verdun hier de één millimolar CFDA in vijf micromolarconcentratie met water voordat u onmiddellijk gebruikt. Snijd de parafilm in kleine stukjes in drie bij drie millimeter groot. Omdat er condensatie op het deksel en de bodem van de petrischaal, moeten we ze duidelijk met papieren handdoek om te voorkomen dat kleurstof stroomt rond.

Een klein parafilmstuk wordt onder de wortel gezet. Til de planten op en leg ze op het deksel. Snijd de wortels ongeveer vijf tot 10 millimeter onder de hypocotyl.

Neem de scheuten terug op de kleine stukjes parafilm. Breng nu voorzichtig een microliter CFDA aan op het snijkant van de wortel. Probeer te voorkomen dat het vervuilen van alle proto-planten.

Bedek dan het deksel, en laat ze dan in de groeiruimte voor twee uur. De Hypocotyl-knijpen methode. Het kleine parafilmstuk, zoals eerder voorbereid, wordt onder de wortel-hypocotylverbinding gezet.

We gebruiken een forecep om de hypocotyl voorzichtig dicht bij het wortelweefsel te knijpen en voorzichtig 0,1 microliter CFDA op de beknelde kant aan te brengen en de plant twee uur te laten staan. De foto's van negen tot 12 dag na zone vlekken planten. Ze tonen allemaal de vasculaire kleuring patroon in zowel de cotyledons en de ware bladeren.

Alleen in een zeer zeldzaam geval vertoonde het cotyledonblad een halfbladig kleuringspatroon. Dus in principe, de twee methoden niet een verschil maken in de CF kleuring patroon, maar als we het uitvoeren van kleurstof laden in meer en meer planten, vinden we de twee procedures geven een significant verschil deal in efficiëntie. Met de wortel-cut methode, ongeveer 70% van de planten tonen het fluorescerende signaal in de shoot.

Maar de efficiëntie kan worden verhoogd tot 91%met behulp van de hypocotyl-knijpen methode. We hebben ook geprobeerd de wortel-knijpen methode, maar deze methode resulteren in de nog lagere efficiëntie, het is ongeveer 30%Daarom lijkt het de manier om de kleurstof te laden niet goed voor de kleuring verschil. Het verschil ligt hoogstwaarschijnlijk in de laadplaatsen, die kunnen worden gescheiden door een symplastische barrière.

We lieten zien hoe we de CFDA in de Arabidopsis wortels en hypocotyl laden. We gebruikten twee iets verschillende procedures, en deze twee iets verschillende procedures resulteren in significant verschil in deze bodem tot top sonde beweging. We stellen voor dat deze methode ons zou kunnen helpen om een potentiële symplastische barrière voor root-afgeleide shootward signalen te identificeren.