Name: Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer hoe CFDA-lading in Arabidopsis-wortels en hypocotylen intercellulaire transport en floëemactiviteit visualiseert. Twee methoden tonen verschillende efficiëntie in opwaartse signaaloverdracht.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door National Natural Science Foundation of China (31671257) en Hubei Collaboratief innovatiecentrum voor graan industrie (LXT-16-18).

1. Arabidopsis verticale groei in MS medium
<ol><li>Het binnenland van laminaire stroom kabinet moet met 30 min UV licht en 15 min luchtstroom vóór gebruik worden behandeld. Zorg ervoor dat de glazen deur te sluiten wanneer UV-licht is ingeschakeld. Spray alle gereedschappen en platen met 70% ethanol alvorens ze in de kast.</li>
	<li>Bereid het Murashige en Skoog (MS) medium in een standaard 90 mm diameter Petri schaaltje onder een laminaire stromings kast. Opmerking: de MS medium bevat de volgende componenten: 20,6 mM NH4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mm MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 µ m na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 µ m ZnSO4· 7H2o, 0,1 µ m CuSO4· 5H2o, 0,1 µ m CoCl2· 6 uur2o, 1,39 µ m ki, 97 µ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 µ m ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA), 4,07 µ m nicotinezuur, 2,44 µ m pyridoxine hcl, 0,15 µ m thiamine hcl, 2,68 mm glycine, 555 µ m-inositol, 87,7 mm sacharose en 10 g/L agar.</li>
	<li>Hydrateren de gesteriliseerde tips of tandenstokers door het aanraken van de tip of tandenstokers aan de MS medium, dan Dompel de gesteriliseerde zaden een voor een op de vaste positie van elke Petri schaal aangegeven door de seeding kaart.</li>
	<li>Seal de Petri schaal met paraffine folie en plakband en plaats het verticaal op een duidelijke stand in een Groeiruimte (22 °C, 70% vocht) met een dag cyclus van 16 uur licht en 8 h van de duisternis (verlichting van 6 uur tot 10 uur). De Arabidopsis plant is klaar voor CFDA laden op dag 9-13 na het zaaien. Let op: de volgende procedure wordt uitgevoerd in de namiddag van 14.00 uur tot 17.00 uur.</li>
</ol>2. CFDA laden met de wortel snijden procedure
<ol><li>Bereid vers CFDA werkoplossing onmiddellijk voor gebruik. Verdun de 1 mM CFDA stockoplossing opgeslagen in-20 °C diepvries met steriele ultrapuur water tot een werkende concentratie van 5 µ M.</li>
	<li>Snijd de micro-poreuze paraffine folie (Zie de lijst van materialen) in kleine stukjes van 3 mm x 3 mm grootte.</li>
	<li>Ontdek de groeiende planten in de kamer op 22 ° c en duidelijk het overtollige vocht met een papieren handdoek. Plaats de kleine stukjes film onder elke wortel. Nota: van dit aan stap 2,6, zou het gehele proces binnen 15 min moeten worden voltooid.</li>
	<li>Til de planten op de Petri schaal deksel. Snijd de wortels in een positie van ongeveer 5-10 mm onder de wortel-hypocotyl kruising. Plaats de shoot deel terug op de film op het medium.</li>
	<li>Zorgvuldig van toepassing 0,25 µ L van CFDA op het snij einde van elke wortel onder een ontleden Microscoop. Vermijd spatten naar andere delen van de plant.</li>
	<li>Bedek de plaat en laat de planten onder het licht voor 2-3 h (22 ° c) in de Groeiruimte.</li>
	<li>Spoel de gebeitste planten drie keer achtereenvolgens in drie afzonderlijke bekers gevuld met gedistilleerd water, dan observeren de planten onder een stereo-fluorescentiemicroscoop met zoom van 1,4 x tot 3.3 x (Zie de tabel van materialen). Voor fluorescentie detectie, gebruik maken van een hoog rendement filter kubus (470/20 nm excitatie, 495 Nm Split en 525/50 nm emissie) gemonteerd op de fluorescentie signaal te zenden.</li>
</ol>3. CFDA laden met hypocotyl-knijpen procedure
<ol><li>Bereid vers CFDA werkoplossing onmiddellijk voor gebruik. Verdun de 1 mM CFDA stockoplossing opgeslagen in-20 °C diepvries met steriele ultrapuur water (Zie de tabel van materialen) tot een werkende concentratie van 5 µ m.</li>
	<li>Snijd de micro-poreuze paraffine folie (Zie de lijst van materialen) in kleine stukjes van 3 mm x 3 mm grootte.</li>
	<li>Ontdek de groeiende planten in de kamer op 22 ° c en duidelijk het overtollige vocht met een papieren handdoek. Nota: van dit aan stap 3,7, zou het gehele proces binnen 15 min moeten worden voltooid.</li>
	<li>Leg een klein stukje film onder de wortel-hypocotyl kruising van elke plant.</li>
	<li>Gebruik een tang om voorzichtig knijp de hypocotyl in de buurt van de wortel-hypocotyl kruising onder een ontleden Microscoop.</li>
	<li>Zorgvuldig van toepassing 0,1 µ L van CFDA op de wond site onder een ontleden Microscoop. Vermijd spatten naar andere delen van de plant.</li>
	<li>Bedek de plaat, en laat de planten onder het licht (22 ° c) voor 2-3 h.</li>
	<li>Spoel de gebeitste planten drie keer achtereenvolgens in drie afzonderlijke bekers gevuld met gedistilleerd water, dan observeren de planten onder een stereo-fluorescentiemicroscoop met zoom van 1,4 x tot 3.3 x (Zie de tabel van materialen). Voor fluorescentie detectie, Monteer een hoog rendement filter kubus (470/20 nm excitatie, 495 Nm Split en 525/50 nm emissie) om het fluorescentie signaal te zenden.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberization+in+Potato+Involves+a+Switch+from+Apoplastic+to+Symplastic+Phloem+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading.</a> The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+Comparison+of+a+Fluorescent+Solute+with+a+Fluorescent+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus.</a> The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).</li>
<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
<li>Spallek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+hormonal+control+of+host+root+morphology+by+parasitic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).</li>
<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
<li>Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-coupling+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis+is+progressively+reduced+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development.</a> Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).</li>
<li>Palevitz, B. A., Hepler, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+dye+coupling+of+stomatal+cells+of+Allium+and+Commelina+demonstrated+by+microinjection+of+Lucifer+yellow%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow.</a> Planta. 164 (4), 473-479 (1985).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Opkomende studies hebben aangetoond dat planten snel kunnen reageren op externe stimuli23, met inbegrip van manipulatie ingevoerd om de experimentele procedures22. In onze eerste experiment, ons toezicht op deze kennis leidt vaak tot vlekken falen. Met deze lessen stellen wij voor dat de volgende voorzorgsmaatregelen in gedachten worden gehouden bij het uitvoeren van dit experiment: (1) de zaden na de oogst moeten worden bewaard in een opbergkast ingesteld op een lage tempe...

Vele fluorescente tracers met een waaier van spectrale eigenschappen, zoals 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic zuur2, Lucifer geel CH (LYCH)3, Esculin en CTER4, zijn ontwikkeld en toegepast in planten om symplastic beweging en bastweefsel activiteit te controleren. Over het algemeen, wordt een symplastic kleurstof geladen in een besnoeiing in het doelweefsel en de opeenvolgende verspreiding van de verslaggever in andere delen van installatie zal de intercellulaire mededeling aantonen. Hoewel het mechanisme van de kleurstof absorptie is niet volledig begrepen, het principe onderliggende CF-beweging in levende cellen is alom erkend. De ester vorm van CF (CF DIACETAAT, CFDA) is niet-fluorescerend, maar membraan doorlaatbaar. Deze eigenschap maakt een snelle membraan diffusie van de kleurstof in cellen. Eenmaal binnen levende cellen, intracellulaire esterasen verwijderen van de acetaatgroepen op de 3 ' en 6 ' positie van CFDA, het vrijgeven van de TL-en membraan-ondoordringbare CF (Figuur 1, alternatief verwijzen Wright et al.2); CF kan dan door de plasmodesmata naar andere delen van planten bewegen.
Een gevestigde procedure met CFDA is dat het in bron bladeren kan worden geladen en gebruikt om het bastweefsel stromende en bastweefsel het leegmaken in de gootsteen weefsels van vele soorten te controleren, b.v., zoals het leegmaken van het CF in Arabidopsis wortel5, bastweefsel het leegmaken tijdens de aardappel tuberization6, bastweefsel lossen in de Nicotiana gootsteen bladeren7, en zo verder. Door gelijkaardige ladings benaderingen, hebben andere studies deze kleurstof goedgekeurd om de symplastic verbinding tussen gastheer en parasiet8,9te demonstreren, of de symbiotische verhoudingen10,11te openbaren.
Een andere manier om gebruik te maken van deze kleurstof is om het te laden in specifieke cellen of een cel door middel van Microinjection om zijn distributie patroon te bepalen. Dergelijke verfijnde technieken hebben sterk vergemakkelijkt ons dieper begrip van plasmodesmata-gemedieerde intercellulaire communicatie, met name in de ontwikkeling van het concept van symplastic domein12,13. Bijvoorbeeld, de Microinjection van CFDA in cotyledon cellen van Arabidopsis resulteerde in het kleurstof-koppelings patroon in de hypocotyl epidermis maar niet-koppeling in de onderliggende cellen of in de wortel epidermis, daarom vormt de hypocotyl epidermis een symplastic domein14. Vergelijkbare domeinen, zoals de stomatale Guard cellen15, zeef element-Companion cellen16, wortel haarcellen14 en root Cap17,18 zijn geïdentificeerd door de Microinjection techniek. Het meest verrassend, sommige domeinen kunnen Tracer moleculen te verplaatsen in een bepaalde richting. Neem de trichome domein bijvoorbeeld, Microinjection van een fluorescente sonde in de ondersteunende epidermale cel leidt tot de stroom van Tracer in het trichome domein, echter, de omgekeerde injectie houdt geen waar19. Een recent rapport heeft ook gelijkaardige situaties gevonden in de symplastic domeinen van het Sedum embryo20. Dus, alle bovenstaande gevallen impliceren dat het ruilen van laadplaatsen kan leiden tot nieuwe inzichten in symplastic communicatie. Ons vorige experiment gericht op het ontleden van de route van root-to-shoot mobiele silencing identificeerde een nieuwe symplastic domein, of de HEJ (Hypocotyl-epicotyl Junction) zone, die verder werd geverifieerd door de root-loading (niet-canonieke gootsteen-loading) CFDA experiment21. Hier, we verder uitwerken van de root-to-shoot CF-beweging met behulp van een eenvoudige methode en herstellen van een potentieel symplastic domein door het verschuiven van de laad-sites. Bovendien kan deze procedure worden aangepast aan de genetische achtergronden die zijn veranderd root-to-shoot lange afstand vervoer te differentiëren.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp;&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot;H2O&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot;2H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot;7H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot;5H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot;6H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot;7H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol&nbsp;&nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid&nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>MACKLIN</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>Agar powder</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu;l pipette</td><td>Dragon Laboratory Instruments</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu;l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&nbsp;</td><td>TWEEZERS</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel double-sided blade</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Double-Edge Blade</td><td></td></tr></tbody></table>

shootward beweging van cfda tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

De symplastic Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein DIACETAAT (CFDA) is op grote schaal toegepast in levende planten om de intercellulaire verbinding, bastweefsel transport en vasculaire patronen aan te tonen. Dit protocol toont onder-naar-top carboxyfluorescein (CF) beweging in de Arabidopsis met behulp van de root-Cutting en de hypocotyl-knijpen procedure respectievelijk. Deze twee verschillende procedures resulteren in verschillende efficiency van de beweging van het CF: ongeveer 91% verschijning van CF in de spruiten met de hypocotyl-knijpende procedure, terwijl slechts ongeveer 70% verschijning van CF met de wortel-snijdende procedure. De eenvoudige verandering van het laden van sites, wat resulteert in significante veranderingen in de mobiele efficiëntie van deze symplastic kleurstof, suggereert CF-beweging kan worden onderworpen aan de symplastic verordening, waarschijnlijk door de root-hypocotyl Junction.

Symplastic beweging is vaak onderhevig aan milieu fluctuaties. Verstoring van de plant groeiende staat, en zelfs het proces van weefsel bereiding zal invloed hebben op de grootte uitsluiting grens van plasmodesmata, waardoor de symplastic transport22. Ter verbetering van de kleuring efficiëntie, beperken we onze werking in de Groeiruimte, waar de temperatuur en vocht is strak gecontroleerd, en ook de hele procedure zo snel mogelijk (idealiter binnen 10-15 min na he...

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe de CFDA te laden in verschillende sites van de onderste delen van Arabidopsis. Vervolgens presenteren we de resulterende distributie patroon van CF in de scheuten.

Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

De veelgebruikte sonde CFDA, of een afkorting voor carboxyfluoresceïne diacetaat, is niet fluorescerend. De twee H3-groepen en de 3'6'-positie op deze verbinding maken het membraan-permeant. Waar eenmaal in cellen, interne cellulaire acetaat zal verwijderen van de acetaat groepen en laat de nieuwe vorm van CFDA.Dat is een carboxyfluorescein, of de CF, die fluorescerend is. En omdat deze nieuwe vorm minder membraan-permeant is, het gewicht, moeten alle cellen door de intercellulaire poriën bewegen, of de plasmodesmata in planten, dat maakt dit diacetaat de ideale sonde om intercellulair transport in phloemactiviteit te bestuderen. In de video van vandaag, gaan we de CFD-belasting demonstreren in de wortel en hypocotyl van de Arabidopsis-planten, respectievelijk, en we zullen laten zien hoe de twee iets verschillende procedures de bodem tot bovenste beweging van deze fluorescerende sonde zullen beïnvloeden.Bereik kleuring resultaten consequent, slaan we de geoogste Arabidopsis zaden in vier Celsius graad, 40% vocht kast. Nieuw geoogste zaden opgeslagen in deze toestand voor meer dan zeven dagen worden gemakkelijk gebruikt voor het zaaien. Om ervoor te zorgen dat elke plant wordt geteeld in een relatief vergelijkbare ruimte in de Petri schotel, zijn we met behulp van een zaad zone rang kaart.Nu, bevochtiging van de gesteriliseerde tip, duik in de gesteriliseerde zaden, en zaai de zaden een-voor-een op de aangewezen positie. Na het inzaaien, verzegel de Petri schotel met parafilm en een plakband, leg ze op een petrischaalstandaard om het verticaal te laten groeien. Hier zijn de tools die we gaan gebruiken in dit experiment.Houd er rekening mee dat we de kleurstof beter zo snel mogelijk kunnen laden. Normaal gesproken beëindig je het hele proces in 10 tot 15 minuten. Voordat we het CFDA-laadexperiment uitvoeren, bereiden we altijd een nieuwe CFDA-oplossing.Verdun hier de één millimolar CFDA in vijf micromolarconcentratie met water voordat u onmiddellijk gebruikt. Snijd de parafilm in kleine stukjes in drie bij drie millimeter groot. Omdat er condensatie op het deksel en de bodem van de petrischaal, moeten we ze duidelijk met papieren handdoek om te voorkomen dat kleurstof stroomt rond.Een klein parafilmstuk wordt onder de wortel gezet. Til de planten op en leg ze op het deksel. Snijd de wortels ongeveer vijf tot 10 millimeter onder de hypocotyl.Neem de scheuten terug op de kleine stukjes parafilm. Breng nu voorzichtig een microliter CFDA aan op het snijkant van de wortel. Probeer te voorkomen dat het vervuilen van alle proto-planten.Bedek dan het deksel, en laat ze dan in de groeiruimte voor twee uur. De Hypocotyl-knijpen methode. Het kleine parafilmstuk, zoals eerder voorbereid, wordt onder de wortel-hypocotylverbinding gezet.We gebruiken een forecep om de hypocotyl voorzichtig dicht bij het wortelweefsel te knijpen en voorzichtig 0,1 microliter CFDA op de beknelde kant aan te brengen en de plant twee uur te laten staan. De foto's van negen tot 12 dag na zone vlekken planten. Ze tonen allemaal de vasculaire kleuring patroon in zowel de cotyledons en de ware bladeren.Alleen in een zeer zeldzaam geval vertoonde het cotyledonblad een halfbladig kleuringspatroon. Dus in principe, de twee methoden niet een verschil maken in de CF kleuring patroon, maar als we het uitvoeren van kleurstof laden in meer en meer planten, vinden we de twee procedures geven een significant verschil deal in efficiëntie. Met de wortel-cut methode, ongeveer 70% van de planten tonen het fluorescerende signaal in de shoot.Maar de efficiëntie kan worden verhoogd tot 91%met behulp van de hypocotyl-knijpen methode. We hebben ook geprobeerd de wortel-knijpen methode, maar deze methode resulteren in de nog lagere efficiëntie, het is ongeveer 30%Daarom lijkt het de manier om de kleurstof te laden niet goed voor de kleuring verschil. Het verschil ligt hoogstwaarschijnlijk in de laadplaatsen, die kunnen worden gescheiden door een symplastische barrière.We lieten zien hoe we de CFDA in de Arabidopsis wortels en hypocotyl laden. We gebruikten twee iets verschillende procedures, en deze twee iets verschillende procedures resulteren in significant verschil in deze bodem tot top sonde beweging. We stellen voor dat deze methode ons zou kunnen helpen om een potentiële symplastische barrière voor root-afgeleide shootward signalen te identificeren.

shootward-movement-cfda-tracer-loaded-bottom-sink-tissues

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Macromoleculaire de handel tussen de plantencellen kan worden beoordeeld door kortstondig te drukken een fluorescent-gelabeld eiwit van belang en de analyse van de intra-en intercellulaire distributie door confocale microscopie.

Een cel-cel Macromoleculaire Transport Assay In Planta Door gebruik te maken biolistische Bombardement

We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming...

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Leer hoe CFDA-lading in Arabidopsis-wortels en hypocotylen intercellulaire transport en floëemactiviteit visualiseert. Twee methoden tonen verschillende efficiëntie in opwaartse signaaloverdracht.

Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis

Meer video's verkennen