Name: Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer de scratch-migratie-assay en dorsale huidkamer voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing bij muizen. Deze methoden helpen onderzoekers celmigratie en farmacologische effecten evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Petra Weissgerber en de transgene Unit van de SPF dieren faciliteit (project P2 van SFB 894) van de medische faculteit en de dieren faciliteit aan het Instituut voor klinische en experimentele chirurgie aan de medische faculteit van de Universiteit van Saarland, Homburg. We danken Dr. Andreas Beck voor de kritische lezing van het manuscript. Deze studie werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, project a3 tot A.B. en V.F.).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de ethische voorschriften en de dierenwelzijns comités van Saarland en de Universiteit van Saarland.
1 primaire celcultuur en siRNA-transfectie
Opmerking: in de beschreven methode worden primaire fibroblasten gebruikt. Deze cellen spelen een cruciale rol in de wondgenezing en weefsel remodellering11. In dit experiment, het Cacnb3 gen, het coderen van de cavβ3 subeenheid van hoogspannings-gated calcium kanalen12 was down-gereguleerd, waardoor zijn rol in de Celmigratie in vitro en huid wond reparatie in vivo4.
<ol><li>Bereiding van siRNA: voordat u de Sirna's reconstitueren, centrifugeer kort de buizen om ervoor te zorgen dat de inhoud aan de onderkant. Reconstitueer de Sirna's in 100 μL RNase-vrije buffer (100 mM Kaliumacetaat, 30 mM HEPES, pH 7,5) die door de fabrikant wordt geleverd met een concentratie van 20 μM. Dit is een stockoplossing van siRNAs.</li>
	<li>Aliquot deze stamoplossing bij 10 μL per buis (20 μM concentratie) en bewaren bij-20 °C tot het gebruik.</li>
	<li>Met behulp van een ultrafijne permanente marker, Markeer een 6-put plaat met een horizontale lijn aan de onderkant van elk goed om te kunnen altijd dezelfde Scratch regio van belang te identificeren en de sluiting te volgen. Opmerking: in deze assay zijn 6-well cultuur platen gebruikt omdat ze groot genoeg zijn, om voldoende ruimte en flexibiliteit te bieden om een consistente, reproduceerbare en verticale kras toe te passen met behulp van een 200 μL pipetpunt over de monolayer van de cel. Als er een beperkt aantal cellen beschikbaar is, zou een alternatief en waarschijnlijk de kostenefficiënte manier zijn om 12-of 24-goed cultuur platen te gebruiken.</li>
	<li>Plaat primaire fibroblasten, geïsoleerd van het wild-type en β3-deficiënte muizen4, in een 6-put-plaat met een dichtheid van 5 x 105 cellen/goed in de aanwezigheid van 2 ml Dulbecco's gemodificeerde EAGLE'S medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FCS). Opmerking: 5 x 105 cellen per well is vastgesteld voor 6-well cultuur plaat en voor primaire muis fibroblasten. Tests kunnen nodig zijn bij gebruik van 12-of 24-Well celkweek platen of andere celtypen, die verschillend kunnen zijn in grootte. Cellen moeten worden behandeld in een steriele omgeving zoals biologische veiligheidskasten klasse II.</li>
	<li>Label de 6-well plaat met het celtype, genotype en de datum.</li>
	<li>Beweeg de 6-put plaat in de celkweek incubator en onderhoud de cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur.</li>
	<li>De volgende dag, neem de plaat uit de incubator, aspireren het celkweekmedium uit de put, gooi het weg en vervang het door 2,25 mL vers kweekmedium door het voorzichtig toe te voegen tegen de wand van de put.</li>
	<li>Gebruik voor het transfect van fibroblasten met sirna's een transfectie-reagens op basis van lipiden, zoals aanbevolen door de fabrikant.</li>
	<li>Voor elke transfectie, label twee micro centrifugebuizen. Voeg in de eerste 9 μL van het transfectiereagens toe en Verdun het met 150 μL verlaagd serum medium. Voeg in de tweede buis 1,5 μL siRNA (Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 of gecodeerde siRNA als negatieve controle) toe en Verdun deze met 150 μl verlaagd serum medium.</li>
	<li>Voeg de verdunde siRNA in de buis met verdund transfectiereagens en Vortex voor 2 s. inbroed het mengsel gedurende 5 minuten bij 21 °C.</li>
	<li>Label Wells met ofwel Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 of gecodeerde siRNA. Voeg 250 μL van het siRNA-transfection-reagens mengsel met druppelsgewijs aan de cellen toe.</li>
	<li>Plaats de 6-well kweek plaat terug in de incubator en houd cellen bij 37 °C en 5% CO2 voor 72 h.</li>
	<li>Om de efficiëntie van Cacnb3 gen-uitschakeling te controleren, verzamel cellen en voer immunoblotanalyse uit zoals eerder beschreven4.</li>
</ol>2. in vitro wondgenezing assay (scratch Migration assay)
<ol><li>Neem de celkweek plaat uit de incubator en onderzoek de cellen onder de microscoop met behulp van de 10x-doelstelling. Begin met de Scratch assay alleen als ze 100% confluency hebben bereikt. Opmerking: voor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid is 100% confluentie een verplichte factor voor het starten van de Scratch Migration assay. Daarom is het belangrijk om hetzelfde aantal cellen in de kweek putten te laten nakijken, om elk putje te onderzoeken voor confluentie en om de kras op hetzelfde tijdstip (dag 0 confluentie) toe te passen. Wachten langer na de cellen bereiken 100% confluentie kan verschillende reacties oproepen.</li>
	<li>Zodra de cel 100% confluency bereikt, aspireren het cultuurmedium uit de put en gooi het weg.</li>
	<li>Gebruik een pipetpunt (200 μL) om handmatig een kras verticaal te maken op de horizontale lijn die is gemarkeerd aan de onderkant van de put, over de confluente celmonolayer in het midden van de put.</li>
	<li>Spoel elk goed tweemaal af met 2 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2po4, 8,1 mm na2HPO4, pH 7,4) om de vrijgekomen factoren van beschadigde cellen, losse cellen en puin uit het bekraste gebied te verwijderen. Voeg 2 mL PBS voorzichtig tegen de wand van de put toe om te voorkomen dat cellen goed worden losgekoppeld van de celcultuur.</li>
	<li>Voeg 2 mL celkweekmedium met een serum van 10% of 1% serum zorgvuldig toe aan elk goed. Opmerking: het wordt aanbevolen om de Scratch assay onder 10% serum en onder 1% serum uit te voeren om te bevestigen dat het waargenomen effect wordt veroorzaakt door de celproliferatie en-migratie of alleen door Celmigratie.</li>
	<li>Beweeg de plaat naar de Microscoop-fase en leg heldere veld afbeeldingen van het cel vrije gebied vast (twee gebieden per put) onmiddellijk na het krabben (t = 0H) bij een 10x vergroting met behulp van een licht Microscoop. Om de afbeelding altijd hetzelfde gebied van de Scratch, gebruik de horizontale lijn, die werd voorbereid in stap (1,3), en neem een afbeelding boven deze regel en één afbeelding onder deze regel. Afbeeldingen opslaan als TIFF of JPEG.</li>
	<li>Omdat de fase van de Microscoop de celgroei toestand niet handhaaft, verplaatst u de plaat terug naar de celkweek incubator en houdt u de cellen bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Beweeg na 6, 10 en 30 uur de plaat opnieuw naar de Microscoop-fase en leg afbeeldingen op dezelfde manier vast als beschreven in stap 2,6. Opmerking: deze tijdspunten zijn vastgesteld voor de beschreven procedure en voor primaire fibroblasten. Tijdens het eerste proef experiment werden meer tijdpunten getest om te zien hoe snelle fibroblasten de kloof herbevolken. Hoewel 0, 6, 10 en 30 h redelijke begintijd punten zijn, moeten de onderzoekers de juiste tijdspunten voor elke toepassing en voor elk celtype optimaliseren en vaststellen. Het nauwkeurigere alternatief, indien beschikbaar, is het gebruik van timelapse-microscopie.</li>
	<li>Gebruik ImageJ13om het eerste cel vrije gebied te kwantificeren (100%) en het resterende gebied na 6, 10 en 30 h (Figuur 1). Het percentage van het scratch gebied dat wordt herbevolkt door migrerende cellen wordt vervolgens berekend ten opzichte van het oorspronkelijke Scratch gebied.</li>
</ol>3. analyse van de ScratchArea
<ol><li>Open ImageJ-software13.</li>
	<li>Upload de eerste afbeelding als JPEG (bijvoorbeeld 24-bits RGB-afbeeldingen 1360x1024) door de afbeelding in de ImageJ-menubalk te laten vallen.</li>
	<li>Selecteer de knop vrije hand selecties en markeer het gebied van de cel vrij</li>
	<li>Klik op analyseren en selecteer meten. Er verschijnt een venster met de resultaten met de waarde van het gebied.</li>
	<li>Deze waarde overbrengen naar een Analysis spreadsheet.</li>
	<li>Herhaal stap 3.2-3.5 voor elke afbeelding vanaf tijdpunt 0 uur en start opnieuw voor de volgende keer punten 6, 10 en 30 h.</li>
	<li>Bereken het percentage van het scratch gebied dat door de migratie van cellen na 6, 10 en 30 h voor elke kras wordt herbevolkt met behulp van de volgende vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59608/59608eq1.jpg"> a = cel vrij gebied van de eerste scratch, b = cel vrij gebied na 6 h</li>
	<li>Bereken het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.) voor het percentage van het scratch gebied dat wordt herbevolkt door migrerende cellen na 6 uur. gegevens weergeven als een kolom staafdiagram of een spreidingsdiagram.</li>
</ol>4. in vivo huid wondgenezing assay
Opmerking: C57BL/6 wild-type mannetjes (8-12 weken oud met 22-26 g lichaamsgewicht) en Cavβ3-deficiënte muizen als een controle worden gebruikt voor deze studie.
<ol><li>Op een dag voor aanvang van het experiment, autoclaaf alle chirurgische instrumenten, schroeven, moeren en Titanium frames te gebruiken voor de huidplooi kamer preparaat. Opmerking: het titanium frame bestaat uit twee symmetrische complementaire helften en het heeft een circulair observatie venster waar de wond wordt aangebracht en gevolgd door microscopie (Zie Figuur 2a).</li>
	<li>Anesthetiseer een wild-type of β3-deficiënte muis (22-26 g lichaamsgewicht) door intraperitoneale (i.p.) injectie van 0,1 mL zoutoplossing/10 g lichaamsgewicht met een mengsel van ketamine (75 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (25 mg/kg lichaamsgewicht). Controleer de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op een teen knijpen. Opmerking: deze injectie geeft ongeveer 30 min chirurgische anesthesie en de diepte van de anesthesie moet worden gecontroleerd door middel van de chirurgische ingreep, door het controleren van de reflexen van de muis.</li>
	<li>Om droogheid of beschadiging van de ogen te voorkomen, breng oftalmische zalf aan op beide ogen en herhaal de toepassing indien nodig.</li>
	<li>Scheer voorzichtig de muis dorsum, met behulp van een elektrisch scheerapparaat gevolgd door de toepassing van een ontharingscrème op het geschoren gebied om elk resterend haar te verwijderen. Zorg dat u de huid van de muis niet verwonden. Laat de Ontharingscrème ongeveer 10 min om alle haren volledig te verwijderen.</li>
	<li>Bereid de Titanium kamer voor door een deel van het symmetrische Titanium kamer frame te nemen en bevestig de verbindings schroeven met moeren aan één kant. Deze moeren dienen als spacer om 400-500 μm tussen de twee symmetrische delen van de kamer te houden om compressie van bloedvaten in de huid te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder de crème van de achterkant van de muis en reinig de haarvrije regio met warm (35-37 °C) kraanwater.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de plaats om een operatie uit te voeren schoon, warm (37 °C) en bevoficeerd is.</li>
	<li>Desinfecteer het haar vrije gedeelte van de muis met een desinfecterende huid. Neem een vouw van de achterste huid van de muis voor een lichtbron en plaats de middelste lijn van de dubbele laag van de huid waar de Titanium kamer zal worden geïmplanteerd. Daarna Fixeer je de huidplooi met een polypropyleen hechting op een craniaal en caudally en draai je aan de andere kant van de hechtdraad op een metalen rek om de gefold muis te tillen. Pas de hoogte van het rek aan zodat de muis comfortabel kan zitten.</li>
	<li>Implantaat de Titanium kamer in de plooi van de achterste huid van de muis op een manier naar sandwich de gevouwen rughuidlaag tussen de twee symmetrische helften van het titanium frame. Bevestig de eerste helft van het titanium frame door polypropyleen hechtingen op zijn superieure rand aan de achterkant van de dorsale huidplooi. Opmerking: op het titanium frame zijn er 8 gaten op de superieure rand (Figuur 2a) en de gevouwen huid moet goed worden bevestigd door polypropyleen hechtingen op elk van de acht gaten.</li>
	<li>Voordat u naar de volgende stap, Controleer de reflexen van de muis om ervoor te zorgen dat de diepte van de anesthesie wordt gehandhaafd.</li>
	<li>Aan de basis van de huidplooi passeren de twee verbindings schroeven, bevestigd aan de eerste helft van de Titanium kamer, om de huidplooi van achteren naar de voorzijde te penetreren. Maak kleine incisies op de huid (met behulp van fijne schaar) om een soepele penetratie van de verbindings schroeven te helpen.</li>
	<li>Maak de muis los van het rek en plaats deze op een laterale positie. Plaats de tweede complementaire helft van de Titanium kamer bovenop de 3 verbindings schroeven (Zie Figuur 2a) en breng lichte druk met de vingers aan om deze schroeven door de tweede helft van het titanium frame te passeren. Bevestig dan beide symmetrische delen met roestvrijstalen moeren.</li>
	<li>Let goed op de dichtheid van de schroeven bij deze stap, omdat het kan loskoppelen, als het te los is. In tegenstelling, als het te strak, het zal knijpen de huidplooi, verminderen van de bloedtoevoer en kan leiden tot weefselbeschadiging en necrose. Noot: noten bereid in stap 4,5 dienen als een afstandhouder om een afstand van 400-500 μm tussen de twee symmetrische helften van de Titanium kamer te houden. De moeren moeten worden vastgezet totdat een lichte weerstand wordt gevoeld.</li>
	<li>Knip het overgebleven deel van de schroeven met een tang. Opmerking: bij deze stap is het noodzakelijk om een veiligheidsbril voor oogbescherming te gebruiken voor het geval de schroef op de verkeerde manier komt.</li>
	<li>Markeer het wondgebied door een gestandaardiseerde biopsie Punch (2 mm in diameter), in het midden van de huid binnen het observatie venster (Zie Figuur 2a) van de huidplooi kamer om te zorgen voor reproduceerbare wond groottes.</li>
	<li>Met behulp van fijne Tang en schaar, maak een cirkelvormige wond binnen het gemarkeerde gebied door het verwijderen van de volledige huid met epidermis en dermis. Het laatste wondgebied zal ongeveer 3.5-4.5 mm2zijn, Zie Figuur 2b. Reinig de wond met 0,5 mL steriele zoutoplossing (0,9% NaCl, 37 °C).</li>
	<li>Bedek de wond met een glazen dekglaasje en bevestig deze glazen afdekplaat met een modulering met behulp van de snap ring Plier op de Titanium kamer.</li>
	<li>Onmiddellijk na het voltooien van de chirurgische ingreep, plaats de muis op de Imaging fase van een stereomicroscoop uitgerust met een camera en nemen beelden (dag 0) onder verlichting. Gebruik de 40X vergroting en sla de beelden op voor toekomstige off-line analyse. Opmerking: de onderzoeker moet de beelden direct na het vangen onderzoeken om ervoor te zorgen dat de kwaliteit voldoende is voor toekomstige off-line analyses. De bereiding van de huidplooi kamer en de prestaties van de huid wond duurt ongeveer 30 minuten.</li>
	<li>Houd de muis op een warme plek tijdens het herstel van de anesthesie voor ten minste 2 h. Breng vervolgens muizen in afzonderlijke kooien terug naar de dieren faciliteit (12 uur licht/donker cyclus) en zorg ervoor dat muizen toegang hebben tot voedsel en water.</li>
	<li>Drie dagen na het verwonden plaats de muis in een muis-fixator en bevestig de fixator bovenop de beeldvormings fase.</li>
	<li>Plaats het podium onder een stereomicroscoop uitgerust met een camera. Maak afbeeldingen onder verlichting met 40x vergroting, noteer alle Foto's en sla ze op voor toekomstige off-line analyses</li>
	<li>Herhaal de stappen 4,20 en 4,21 opnieuw op dag 6, 10 en dag 14 post-Wounding.</li>
	<li>Gebruik de wond beelden, voor off-line analyse in ImageJ13. Het wondgebied op dag 0 wordt beschouwd als 100% en de wondsluiting na verloop van tijd wordt uitgezet ten opzichte van het initiële wondgebied. Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 2c, d.</li>
	<li>Bereken het percentage (%) van het wondgebied op elk tijdspunt met behulp van de volgende vergelijking: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59608/59608eq2.jpg"> x: tijdpunt (dag 0, 3, 10 of 14), a: wondgebied op dag 0, b: wondgebied op tijdpunt x</li>
</ol>

<ol><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+actin+cytoskeleton+during+early+endothelial+regeneration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro.</a> Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).</li>
<li>Belkacemi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3+Receptor-Dependent+Cytoplasmic+Ca%282%2B%29+Signals+Are+Tightly+Controlled+by+Cavbeta3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3.</a> Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).</li>
<li>Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+of+partial+thickness+porcine+skin+wounds+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment.</a> Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).</li>
<li>Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wounds+in+the+MRL%2FMPJ+mouse+heal+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar.</a> Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).</li>
<li>Vagesjo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+in+mice+by+on-site+production+and+delivery+of+CXCL12+by+transformed+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria.</a> Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).</li>
<li>Eming, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+closure+in+mice+deficient+for+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10.</a> American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).</li>
<li>Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+insights+in+skin+wound+healing+using+the+mouse+dorsal+skin+fold+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber.</a> Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).</li>
<li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+skinfold+chamber%3A+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cell+and+Materials%22%5BJournal%5D)">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).</li>
<li>Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Alternative+Functions+for+the+Auxiliary+Subunits+of+the+Voltage-Gated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels.</a> Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+4.1G+Regulates+Cell+Adhesion%2C+Spreading%2C+and+Migration+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts+through+the+beta1+Integrin+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).</li>
<li>Dewor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+%28MIF%29+promotes+fibroblast+migration+in+scratch-wounded+monolayers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro.</a> FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).</li>
<li>Handly, L. N., Wollman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-induced+Ca%282%2B%29+wave+propagates+through+a+simple+release+and+diffusion+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism.</a> Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).</li>
<li>Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+In+Vitro+Wound+Healing+Assay+to+Evaluate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), 56825(2018).</li>
<li>Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+and+Affordable+Time-Lapse+Imaging+and+Incubation+System+Based+on+3D-Printed+Parts%2C+a+Smartphone%2C+and+Off-The-Shelf+Electronics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics.</a> PLoS One. 11, 0167583(2016).</li>
<li>Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell adhesion and migration.</a> Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).</li>
<li>Treloar, K. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+edge+detection+methods+for+quantifying+cell+migration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays.</a> PLoS One. 8, 67389(2013).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physioliology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).</li>
<li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li>
<li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265(2013).</li>
<li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1%2FCdc42%2FPAK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit manuscript beschrijven we een in vitro en in vivo wond genezings test en correleren we de verkregen resultaten. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire muizen fibroblasten4,14,15 die een belangrijke rol spelen in wondgenezing en weefsel remodellering11. Andere aanhangend celtypen die groeien als monolagen (bijv. epitheliale cellen, endotheel cellen, keratinocyten) kunnen ook worden gebruikt. ...

Huid wondgenezing begint onmiddellijk na de huidletsel om de integriteit van de huid te herstellen en het organisme te beschermen tegen infecties. Het wond genezingsproces doorloopt vier overlappende fasen; coagulatie, ontsteking, nieuwe weefselvorming en weefsel remodellering1. Celmigratie is cruciaal tijdens deze fasen. Ontstekingscellen, immuuncellen, keratinocyten, endotheel cellen en fibroblasten worden op verschillende tijdstippen geactiveerd en dringen het wondgebied2binnen. Methoden om de wondgenezing in vitro en in vivo te onderzoeken zijn niet alleen van groot belang om de onderliggende mechanismen te begrijpen, maar ook om nieuwe geneesmiddelen te testen en nieuwe strategieën te ontwikkelen om huid wondgenezing te verbeteren en te versnellen.
Voor het bewaken en analyseren van Celmigratie kan de Scratch Migration test worden gebruikt. Het wordt vaak aangeduid als in vitro wondgenezing assay. Deze methode vereist een cel cultuur faciliteit3. Het is een eenvoudige procedure, er is geen behoefte aan high-end apparatuur en de assay kan worden uitgevoerd in de meeste cel biologie laboratoria. In deze test wordt een cel vrij gebied gecreëerd door de mechanische verstoring van een confluente celmonolayer, bij voorkeur epitheel-of endotheel achtige cellen of fibroblasten. Cellen aan de rand van de Scratch worden gemigreerd om de gemaakte kloof opnieuw te vullen. Kwantificering van de afnemende cel-vrije gebied na verloop van tijd lijkt op de migratiesnelheid en geeft de tijd, die de cellen nodig hebben om de kloof te sluiten. Voor dit doel kunnen onderzoekers ofwel acuut geïsoleerde cellen gebruiken van WT muizen of muizen die geen gen van belang4hebben, of vereeuwigd cellen die beschikbaar zijn via betrouwbare celopslagplaatsen. De Scratch assay maakt het bestuderen van de invloed van farmacologisch actieve verbindingen of het effect van gegeneerde Cdna's of Sirna's op Celmigratie mogelijk.
In vivo is wondgenezing een complex fysiologisch proces, waarbij verschillende celtypen nodig zijn, waaronder keratinocyten, ontstekingscellen, fibroblasten, immuuncellen en endotheel cellen om de fysieke integriteit van de huid zo snel mogelijk te herstellen1 . Verschillende methoden om te studeren in vivo wondgenezing zijn ontwikkeld en gebruikt in de afgelopen5,6,7,8. De in dit artikel beschreven dorsale huidplooi kamer werd eerder gebruikt voor wondgenezing testen9. Het wordt gebruikt als een gemodificeerde dorsale huidplooi kamer preparaat voor muizen. Het model met de aangepaste huidplooi kamer heeft verschillende voordelen. 1) het minimaliseert de contractie van de huid, die het observeren van het wond genezingsproces verhindert en de wond reparatie bij muizen kan beïnvloeden. 2) deze kamer maakt gebruik van het bedekken van de wond met een glazen dekglaasje, het verminderen van weefsel infecties en uitdroging, waardoor het genezingsproces kan vertragen. 3) doorbloeding en vascularisatie kan direct worden bewaakt. 4) het maakt repetitieve actuele toepassing van farmacologisch actieve verbindingen en reagentia mogelijk om de wond te behandelen en de genezing te versnellen9,10.
We identificeerden de β3 subeenheid van hoogspannings-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om huid wondgenezing te beïnvloeden met behulp van twee onafhankelijke protocollen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Voor de in vitro assay gebruikten we primaire fibroblasten, deze cellen uiten het Cacnb3 gen dat het cavβ3-eiwit codeert, maar gebrek aan depolarisatie-geïnduceerde CA2 + toestroom of spanning-afhankelijke CA2 + stromingen. We beschrijven een nieuwe functie van Cavβ3 in deze fibroblasten: Cavβ3 bindt aan de inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) en beperkingen calcium afgifte uit het endoplasmische reticulum. Deletie van het Cacnb3 gen in muizen leidt tot een verhoogde gevoeligheid van de IP3R voor IP3, verbeterde Celmigratie en verhoogde huid wond reparatie4.

<table><tbody><tr><td>0.9 % NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuiten</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>6 wel plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie punch</td><td>Kai Industries</td><td>48201</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Cacnb3 Muis siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td><td>Origene</td><td>SR415626</td><td></td></tr><tr><td>Ontharingscreme</td><td></td><td></td><td>elke ontharingscreme</td></tr><tr><td>Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN)</td><td>Bayer</td><td>3400935940179.00</td><td>(BEPANTHEN)</td></tr><tr><td>Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine)</td><td>Bayer Health Care</td><td></td><td>Rompun 2%</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Hexagon volle moer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Zoetis</td><td></td><td>KETASET</td></tr><tr><td>Lichtmicroscoop</td><td>Keyence, Osaka, Japan</td><td>BZ-8000</td><td>Vergelijkbare microscopen kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfectiereagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Micro-tang</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis fixeervoorziening</td><td>Huisgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normale schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectief</td><td>Nikon</td><td>plan apo 10x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen hechtingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schroevendraaier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huidontsmettingsmiddel (octeniderm)</td><td>Sch&uuml;lke &amp; Mayr GmbH</td><td>118212</td><td></td></tr><tr><td>Groefschroef</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sperring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sperringstang tang</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch microscoop met camera</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>Titanium frames voor de huidplooi kamer</td><td>IROLA</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>Draad splijter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

scratch migration assay en dorsale skinfold chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Verminderde cutane wondgenezing is een belangrijke zorg voor patiënten die lijden aan diabetes en ouderen, en er is behoefte aan een effectieve behandeling. Geschikte in vitro en in vivo benaderingen zijn essentieel voor de identificatie van nieuwe doel moleculen voor medicamenteuze behandelingen om het huid wond genezingsproces te verbeteren. We identificeerden de β3-subeenheid van voltage-gated calcium kanalen (cavβ3) als een potentieel doelwit molecuul om de wondgenezing te beïnvloeden in twee onafhankelijke testen, d.w.z. de in-vitro Scratch migratietest en het in vivo dorsale huidplooi Chamber model. Primaire muis embryonale fibroblasten (Mef's) acuut geïsoleerd van wild-type (WT) en CAVβ3-deficiënte muizen (CAVβ3 ko) of FIBROBLASTEN acuut geïsoleerd van WT muizen behandeld met siRNA naar beneden-reguleren de uitdrukking van het Cacnb3 gen , codering CAVβ3, werden gebruikt. Een kras werd aangebracht op een confluente celmonolayer en de spleet sluiting werd gevolgd door microscopische beelden op gedefinieerde tijdstippen te nemen tot volledige herbevolking van de kloof door de migrerende cellen. Deze beelden werden geanalyseerd en de Celmigratie snelheid werd voor elke aandoening bepaald. In een in vivo test hebben we een dorsale huidplooi kamer op WT-en Cavβ3 KO-muizen geïmplanteerd, een gedefinieerde cirkel wond van 2 mm diameter aangebracht, de wond bedekt met een glazen dekglaasje om het te beschermen tegen infecties en uitdroging, en de macroscopische wondsluiting bewaakt na verloop van tijd. Wondsluiting was significant sneller in Cacnb3-gen-deficiënte muizen. Omdat de resultaten van de in vivo en de in vitro assays goed correleren, kan de in vitro assay nuttig zijn voor de screening met hoge doorvoer voordat de in-vitro treffers worden valideerd door het in vivo wond genezings model. Wat we hier hebben laten zien voor wild-type en CAVβ3-deficiënte muizen of cellen kan ook toepasbaar zijn voor specifieke moleculen anders dan Cavβ3.

De kras test werd uitgevoerd op een confluente celmonolaag van wild-type en β3-deficiënte Mef's (Figuur 1c). Na het uitvoeren van de "Scratch" met een pipetpunt van 200 μL migreren cellen van beide genotypen naar het scratch gebied en sluiten de kloof. Beelden werden genomen na 6, 10 en 30 h (Figuur 1a). Celmigratie werd gekwantificeerd als het percentage (%) van het scratch gebied wordt opnieuw gevuld door de migratie van celle...

Hier presenteren we een protocol voor een in vitro Scratch assay met primaire fibroblasten en voor een in vivo huid wond genezings test bij muizen. Beide assays zijn eenvoudige methoden om te beoordelen in vitro en in vivo wondgenezing.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

De opstandige behoefte aan behandeling van huidwonden. Om uw doelmoleculen voor medicamenteuze behandelingen te identificeren, zijn in vitro- en in vivo testsystemen vereist. Geschikte systemen zijn de in vitro scratch test, en de in vivo dorsale huidplooikamer.Beide zijn rechttoe rechtaan procedures voor het monitoren van celmigratie en huidwondengenezing, bij afwezigheid en aanwezigheid van farmacologisch actieve verbindingen. Hoewel beide technieken zijn rechttoe rechtaan, onderzoekers moeten de praktijk van de kras applicatie. En de dorsale huidplooi kamer implantatie, en wond om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.Demonstratie van de procedures zal worden gedaan door Dr.Matthias Laschke, een chirurg en professor van het instituut voor klinische en experimentele chirurgie. Gebruik voor het begin van de procedure een ultra fijne permanente markering om één zes putplaat per celtype te markeren, met een horizontale lijn aan de onderkant van elke put om het krasgebied voor elke cultuur af te bakenen. Volgende plaat primaire vezel ontploffing geïsoleerd van wilde type en beta 3 gebrekkige muizen, in een zes put plaat op een 5 keer 10 tot de vijfde vezel ontploffi

scratch-migration-assay-dorsal-skinfold-chamber-for-vitro-vivo

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het vermogen om te migreren is een belangrijke functie van veel verschillende celtypen, inclusief mesenchymale stromale cellen (MSC's). Het kwantificeren van veranderingen in migratievermogen na schade is echter een uitdaging. Dit protocol beschrijft een eenvoudig aanpasbare migratietest die rigoureuze statistiek gebruikt om veranderingen in het migratievermogen van MSC's na schade te kwantificeren.

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Hier presenteren we een protocol bij een semi-high throughput celmigratie analyse uit te voeren op een 96-well celcultuur plaat. Dit protocol is een snelle, eenvoudige en economische methode om consistente kras wonden op een cel monolaag te creëren.

Een inrichting voor het uitvoeren van celmigratie / wondgenezing in een 96-putjesplaat

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.

Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Deze studie richt zich op een in vitro model voor wond genezing (kras assay) als een mechanisme om te bepalen hoe milieu aanwezige contaminanten zoals arsenicum invloed cellulaire migratie. De resultaten tonen aan dat deze in vitro -assay snelle en vroege aanwijzingen van wijzigingen in cellulaire migratie vóór in vivo experimenten biedt.

In Vitro Kras Assay om aan te tonen van de gevolgen van arsenicum huid cel migratie

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Hier worden twee murine wondgenezingsmodellen beschreven, een ontworpen om cellulaire en cytokinewondgenezingsreacties te beoordelen en de andere om de snelheid van wondsluiting te kwantificeren. Deze methoden kunnen worden gebruikt met complexe ziektemodellen zoals diabetes om mechanismen van verschillende aspecten van slechte wondgenezing te bepalen.

Beoordeling van acute wondgenezing met behulp van de dorsale subcutane polyvinyl alcohol spons implantatie en excisional Tail Skin Wound Models.

We presenteren een kosteneffectieve methode om de scratch migratie test die een nieuwe aanpak voor het bepalen van celmigratie biedt zonder het gebruik van apparatuur-intensieve methoden. Terwijl fibroblasten werden gebruikt in dit protocol, kan het worden aangepast en gebruikt om extra celtypen en invloeden op celmigratie te bestuderen.

Een kosteneffectieve en aanpasbare scratchmigratietest

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer de scratch-migratie-assay en dorsale huidkamer voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing bij muizen. Deze methoden helpen onderzoekers celmigratie en farmacologische effecten evalueren.

Scratch Migration assay en dorsale skinfold Chamber voor in vitro en in vivo analyse van wondgenezing

Meer video's verkennen