Name: Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Leer micro-injectietechnieken voor het bestuderen van Cryptosporidium parvum-infecties in menselijke darm- en luchtwegorganoids. Deze methode maakt precieze levering van sporozoïeten en visualisatie van infecties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Deborah A. Schaefer dankbaar van de school voor dier-en vergelijkende Biomedische Wetenschappen, het College voor landbouw en levenswetenschappen, de Universiteit van Arizona, Tucson, AZ, USA om ons te helpen met de productie en analyse van oocyste. We danken ook Franceschi Microscopy en Imaging Center en D.L. Mullendore aan de Washington State University voor tem-voorbereiding en beeldvorming van geïsoleerde organoïde-oöcysten.
D.D. is de ontvanger van een VENI-beurs van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. is de ontvanger van een VENI-subsidie van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO-ALW, 863.14.002) en werd gesteund door de Marie Curie-beurzen van de Europese Commissie (voorstel 330571 KP7-PEOPLE-2012-IIF). Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad onder ERC Advanced subsidie Agreement No. 67013 en van NIH NIAIH onder R21 AT009174 naar RMO. Dit werk maakt deel uit van het Oncode Institute, dat deels wordt gefinancierd door de Nederlandse Kankervereniging en werd gefinancierd door een subsidie van de Nederlandse Kankervereniging.

<ol><li>Checkley, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+global+burden%2C+novel+diagnostics%2C+therapeutics%2C+and+vaccine+targets+for+Cryptosporidium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium.</a> The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).</li>
<li>Bones, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+future+trends+of+Cryptosporidium+in+vitro+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research.</a> Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).</li>
<li>Muller, J., Hemphill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+systems+for+the+study+of+apicomplexan+parasites+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals.</a> International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).</li>
<li>Karanis, P., Aldeyarbi, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Cryptosporidium+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Cryptosporidium in vitro culture.</a> International Journal for Parasitology. 41 (12), 1231-1242 (2011).</li>
<li>Morada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+culture+of+Cryptosporidium+parvum+using+hollow+fiber+technology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology.</a> International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).</li>
<li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li>
<li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>O'Hara, S. P., Chen, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+Cryptosporidium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">The cell biology of Cryptosporidium infection.</a> Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).</li>
<li>Lendner, M., Daugschies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptosporidium+infections%3A+molecular+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Cryptosporidium infections: molecular advances.</a> Parasitology. 141 (11), 1511-1532 (2014).</li>
<li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li>
<li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cpgp40%2F15+in+Toxoplasma+gondii%3A+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li>
<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cultuur van Cryptosporidium parasieten in intestinale en luchtweg organoïden biedt een nauwkeurig model om gastheer-parasiet interacties10 te bestuderen, maar heeft ook veel andere toepassingen. De huidige methoden voor het selecteren en propageren van genetisch gemodificeerde Cryptosporidium parasieten vereisen bijvoorbeeld passage in muizen19 die geen isolatie van parasieten mogelijk maakt die modificaties hebben die essentieel zijn voor in-vivo-infectie...

Ontwikkeling van geneesmiddelen of vaccins voor de behandeling en preventie van Cryptosporidium infectie is belemmerd door het ontbreken van in-vitro systemen die de in vivo situatie bij de mens nauwkeurig nabootsen1,2. Veel van de momenteel beschikbare systemen alleen toestaan korte termijn infectie (< 5 dagen) of bieden geen ondersteuning voor de volledige levenscyclus van de parasiet3,4. Andere systemen die de volledige ontwikkeling van de parasiet mogelijk maken, zijn gebaseerd op vereeuwigd cellijnen of cellijnen van kanker die de fysiologische situatie bij de mens niet getrouw recapituleren5,6,7 . Organoïden of ' mini-orgels ' zijn 3D-weefsel afgeleide structuren die worden gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met verschillende weefsel specifieke groeifactoren. Organoïden zijn ontwikkeld uit verschillende organen en weefsels. Ze zijn genetisch stabiel en recapituleren de meeste functies van de organen van hun oorsprong en kunnen gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden. We hebben een methode ontwikkeld voor het infecteren van humane intestinale en Long organoïden met Cryptosporidium dat een nauwkeurig in vitro model biedt voor de studie van gastheer-parasiet interacties die relevant zijn voor intestinale en respiratoire Cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. In tegenstelling tot andere gepubliceerde cultuur modellen, het organoïde systeem is representatief voor Real-Life host parasiet interacties, maakt het mogelijk voor de voltooiing van de levenscyclus, zodat alle stadia van de parasiet levenscyclus kan worden bestudeerd, en onderhoudt parasiet propagatie tot 28 dagen10.
Cryptosporidium parvum is een apicomplexaanse parasiet die het epitheel van de Ademhalings-en darm tracten infecteert, waardoor een langdurige diarree ziekte ontstaat. De resistente milieu fase is de oocyste, gevonden in verontreinigd voedsel en water14. Eenmaal geconsumeerd of geïnhaleerd, de oocyste excysts en releases vier sporozoieten die hechten aan epitheliale cellen. Sporozoites glijden op hosts cellen en Engage host cel receptoren, maar de parasiet niet volledig de cel binnenvallen, en lijkt te induceren van de host cel om het te verzwelgen15. De parasiet, die binnen een intracellulair maar extracytoplasmisch compartiment geïnternationaliseerd is, blijft op het apicale oppervlak van de cel, repliceert binnen een parasitophoreuze vacuole. Het ondergaat twee ronden ongeslachtelijke voortplanting — een proces dat merogony wordt genoemd. Tijdens merogony ontwikkelen type I meronts die acht merozoïeten bevatten die vrijkomen om nieuwe cellen binnen te dringen. Deze merozoïeten binnenvallen nieuwe cellen te ontwikkelen tot type II meronts met vier merozoïeten. Deze merozoites, wanneer vrijgegeven, infecteren cellen en ontwikkelen tot macrogamonts en microgamonts. Microgameten worden vrijgegeven en bevruchten de macrogameten die zygoten produceren, die volwassen worden tot oöcysten. Volwassen oöcysten worden vervolgens in het lumen vrijgegeven. Oöcysten zijn ofwel dun-ommuurd die onmiddellijk excyst om het epitheel te reinfecteren, of dikke ommuurde die vrijkomen in het milieu om de volgende gastheer14infecteren. Alle stadia van de levenscyclus van Cryptosporidium zijn geïdentificeerd in het organoïde cultuur systeem dat eerder werd ontwikkeld door onze groep10.
Omdat menselijke organoïden getrouw de menselijke weefsels9,11,13nabootsen en alle replicatieve stadia van Cryptosporidium10ondersteunen, zijn ze het ideale weefselkweek systeem om te bestuderen Cryptosporidium biologie en gastheer-parasiet interacties. Hier beschrijven we de procedures voor het infecteren van organoïden met zowel Cryptosporidium oöcysten en excysted sporozoites, en het isoleren van de nieuwe oöcysten geproduceerd in dit weefselcultuur systeem.

<table><tbody><tr><td>Basement membrane extract (extracellular matrix)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Final Concentration = Gebruik 2-3 druppels/slide</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 15 rack</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 rack</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp;Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3&micro;m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fast green dye</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtojet 4i Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass capillaries of 1 mm diameter</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel (extracellular matrix)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microfuge tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro-loader tips</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette puller P-97</td><td>Shutter instrument</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Normal donkey Serum</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium hypoclorite (use 5%)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Super stick slides</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Taurocholic acid sodium salt hydrate</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vectashield mounting agent</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Finale hoeveelheid</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mL stock in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL stock in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 mL stock in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansiemedia)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Finale concentratie</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0.5 &micro;M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>aanmaken tot 100 mL</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>In house*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>P38 inhibitor (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL media</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>In house*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>In house*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>In house* - cellijnen worden op verzoek geleverd</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiatiemedia)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Om organoïden te differentiëren, werden kleine darmorganoïden uitgebreid en werden gedurende zes tot zeven dagen na splitsing in een Wnt-rijk medium gekweekt, en vervolgens in een differentiatiemedium gekweekt (intrekking van Wnt, nicotinamide, SB202190, in een differentiatiemedium (intrekking van Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandine E2 van een Wnt-rijk medium of OME)</td></tr><tr><td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiatiemedia)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Finale concentratie</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>aanmaken tot 100 mL</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Neem rechtstreeks contact op met het bedrijf</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro;M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &micro;m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Neem rechtstreeks contact op met het bedrijf</td><td>10%</td></tr><tr><td>Reducing buffer (voor resuspenderen van oocysten en sporozoieten voor injectie)</td><td>

het bestuderen van cryptosporidium infectie in 3d-weefsel-afgeleide menselijke organoid cultuur systemen door microinjection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum is een van de belangrijkste oorzaken van de ziekte van de mens diarree. Om de pathologie van de parasiet te begrijpen en efficiënte geneesmiddelen te ontwikkelen, is een in vitro cultuur systeem dat de omstandigheden in de gastheer recapitates nodig. Organoïden, die sterk lijken op de weefsels van hun oorsprong, zijn ideaal voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en parasiet. Organoïden zijn driedimensionale (3D) weefselstructuren die zijn afgeleid van adulte stamcellen en die gedurende langere tijd in cultuur groeien zonder genetische afwijkingen of transformatie te ondergaan. Ze hebben een goed gedefinieerde polariteit met zowel apicale als basolaterale oppervlakken. Organoïden hebben verschillende toepassingen in drug testing, bio Banking, en ziekte modellering en host-microbe interactiestudies. Hier presenteren we een stap-voor-stap Protocol van hoe de oöcysten en sporozoïeten van Cryptosporidium voor het infecteren van de menselijke intestinale en luchtweg organoïden voor te bereiden. Vervolgens laten we zien hoe micro-injectie kan worden gebruikt om de microben in de organoïde lumen te injecteren. Er zijn drie belangrijke methoden waarmee organoïden kunnen worden gebruikt voor host-microbe interactiestudies — micro Injection, mechanisch scheren en beplating, en door het maken van monolayers. Micro Injection maakt onderhoud van de 3D-structuur mogelijk en zorgt voor nauwkeurige controle van de parasiet volumes en direct apicaal zijcontact voor de microben. We bieden Details voor een optimale groei van organoïden voor Imaging of oocyste productie. Ten slotte tonen we ook aan hoe de nieuw gegenereerde oöcysten kunnen worden geïsoleerd van de organoïde voor verdere downstream verwerking en analyse.

De hier gepresenteerde protocollen resulteren in de efficiënte zuivering van oöcysten en sporozoïeten (Figuur 1a) klaar voor Microinjection. Het excystation protocol resulteert in de vrijlating van sporozoieten van ongeveer 70 – 80% van de oöcysten, daarom is het essentieel om de resterende oöcysten en schelpen te filteren door middel van een 3 μm filter. Filtratie resulteert in bijna 100% sporozoietzuivering (Figuur 1b). Bovendien zorgt de toevoeging van een gr...

We beschrijven protocollen voor het bereiden van oöcysten en zuiveren sporozoieten voor het bestuderen van infectie van menselijke intestinale en luchtweg organoïden door Cryptosporidium parvum. We demonstreren de procedures voor micro injectie van parasieten in het intestinale organoïde lumen en immunokleuring van organoïden. Tot slot beschrijven we de isolatie van gegenereerde oöcysten uit de organoïden.

Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Met behulp van deze sporozoite zuivering en micro-injectie procedure, in wezen elke gastheer microbe kan worden bestudeerd in elk weefsel-afgeleide orgaansysteem. Met behulp van deze techniek kunnen we de hoeveelheid zuivere sporozoïeten controleren die in het organoïde lumen of de apicale kant van de organoïde worden geïnjecteerd. Om C.parvum sporozoites te zuiveren, breng je de eicel over naar een buis van 15 milliliter en zet je de cellen één keer 10 tot de zevende oocyst per milliliter excystation medium concentratie opnieuw op.Meng na 60 tot 90 minuten bij 37 graden Celsius 14 milliliter van een geschikte wasoplossing met de eicellen en sedimenter de cellen door middel van centrifugatie. Aspirate de supernatant zorgvuldig om te voorkomen dat het verliezen van eicellen en resuspend de sporozoïsche pellet op een drie keer 10 tot de zevende oocyst per een tot twee milliliter van DMEM concentratie. Om de resterende eicellen en schelpen te verwijderen, plaatst u een spuitvat van 10 milliliter dat is uitgerust met een filterhouderapparaat van 47 milliliter dat is uitgerust met een polycarbonaatfilter van drie micrometergrootte in een buis van 15 milliliter bij vier graden Celsius.Voeg 7,5 milliliter sporozoite ophanging toe aan de filterassemblage. Wanneer het hele volume door de zeef is gegaan door de zwaartekracht, was dan de resterende cellen door de zeef met nog eens 7,5 milliliter DMEM. Wanneer alle van de was is doorgegeven door de zeef, het verzamelen van de gefilterde sporozoite suspensie door centrifugatie gedurende 10 minuten en label de pellet in 50 tot 100 microliter van een geschikte organoïde cultuur medium, aangevuld met 0,05% snelle groene kleurstof, en L-glutathion, betaïne, L-cysteïne, linolzuur, en taurine bevatten verminderen buffer.Om de parasieten in de apicale kant van een 3D-organoïde te microinjecten, gebruik je eerst een micropipettrekker om glazen injectie haarvaten voor te bereiden. Gebruik tangen om de punt van de capillaire te snijden tot een diameter van negen tot 12 micrometer om een gemakkelijke stroom van sporozoïsten of eicellen mogelijk te maken, als u ervoor kiest om eicellen rechtstreeks te injecteren, en gebruik micro-loader tips om elke capillair te vullen met een snelle groene kleurstof gelabeld oocyst of sporozoite suspensie. Laad vervolgens de eerste met sporozoiet gevulde capillair in een microinjector en gebruik een omgekeerde microscoop bij een 5x vergroting en een constante druk om 100 tot 200 nanoliter van de suspensie in elke organoïde te microinjecteren.Het excystation protocol resulteert in het vrijkomen van sporozoïesse van ongeveer 70 tot 80% van de eicellen. Daarom is het essentieel om de resterende eicellen uit te filteren door middel van een filtratie van drie micrometer. Verwijder bijna 100% van de niet-uitgeefde eicellen.Bovendien zorgt de toevoeging van een groene kleurstof voor de injectie van alle organoïden en maakt visualisatie van de geïnjecteerde organoïden gedurende ten minste 24 uur na de injectie mogelijk. Hoewel dit een goed beoefende methode is, kan scanning elektronenmicroscopie worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het excystationproces de sporozoïsten of de eicellen niet heeft beschadigd. De injectie van gelijke hoeveelheden eicellen in het organoïde lumen kan visueel worden bevestigd door eenvoudige microscopische beeldvorming.Immunofluorescentietesten kunnen ook worden gebruikt om de soorten cellen te verkennen die besmet zijn met Cryptosporidium. Nadat de gedifferentieerde organoïden vijf dagen zijn geïnfecteerd, kan de aanwezigheid van sporozoïsten in de eicellen worden bevestigd door een deel van de eicellen op een kleefglijbaan te drogen, de eicellen met methanol te bevestigen en DAPI-vlekken te combineren met een geschikt eicelspecifiek antilichaam. Voor maximale resultaten, gebruik verse eicellen, gebruik dezelfde capillaire voor alle injecties, en verander de media elke dag na injectie.Met behulp van deze techniek, verschillende laboratoria zijn nu beginnen met organoïden te gebruiken om host-microbe interacties te bestuderen. We bestuderen commensals evenals andere ziekteverwekkers in vergelijkbare organoïde microcultuur-instellingen. Aangezien Cryptosporidium een menselijke parasiet is, is het belangrijk om deze experimenten uit te voeren volgens de veiligheidsvoorschriften van niveau 2.

studying-cryptosporidium-infection-3d-tissue-derived-human-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate an in vitro method to purify sporozoites from thick-walled oocysts of the pathogenic parasite Cryptosporidium parvum. The isolated sporozoites can be used for infection studies.

In Vitro Sporozoite Isolation from Cryptosporidium parvum Oocysts

This video demonstrates a microinjection technique to develop a human intestinal organoid infection model. The infectious sporozoite stage of the parasite Cryptosporidium parvum is microinjected into the organoid lumen. Upon invading the epithelial cells of the organoid, it undergoes asexual and sexual reproduction to complete its life cycle and spreads the infection.

A Technique to Develop a Parasite Infection in Intestinal Organoids via Microinjection

Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch   modelsysteem.

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Uit stamcellen afgeleide culturen bevatten een enorm potentieel om infectieziekten te modelleren. Hier wordt de kweek van muis en menselijke gastrische organoïden, afgeleid van volwassen stamcellen, beschreven. De organoïden worden gemicro-injecteerd met het gastrische pathogeen Helicobacter pylori.

Organoids als model voor Infectieziekten: cultuur van de mens en muizen Maag Organoids en Micro-injectie van Helicobacter pylori

Dit protocol beschrijft de meting van epitheliale barrière permeabiliteit in real-time volgende farmacologische behandeling in menselijke intestinale organoids met behulp van fluorescentie microscopie en levende cel microscopie.

Real-time meting van epitheliale barrière permeabiliteit in menselijke intestinale Organoids

Human geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide intestinale organoids bieden spannende mogelijkheden om te modelleren van ziekten in vitro. We tonen de differentiatie van hiPSCs in intestinale organoids (iHOs), de stimulatie van deze iHOs met cytokines, en de microinjectie van salmonella typhimurium in de iHO lumen, waardoor de studie van een epitheel invasie door deze Pathogen.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide intestinale Organoids te bestuderen en te wijzigen epitheel cel bescherming tegen salmonella en andere pathogenen

Hier presenteren we twee protocollen die het modelleren van intestinale apicale-specifieke interacties mogelijk maken. Organoïde-afgeleide intestinale monolagen en Air-Liquid Interface (ALI) culturen vergemakkelijken de generatie van goed gedifferentieerde epithelia toegankelijk vanaf zowel luminale als basolaterale zijden, terwijl polariteit-omgekeerde intestinale organoïden hun apicale kant blootstellen en vatbaar zijn voor hoge doorvoertesten.

Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

De studie presenteert een methode voor in vitro onderzoek van bacteriële infecties met behulp van intestinale organoïden afkomstig van weefselstamcellen. Het protocol beschrijft hoe organoïden in twee dimensies kunnen worden gekweekt en onderscheiden, geïnfecteerd met adherent-invasieve Escherichia coli, en belangrijke metingen worden beoordeeld, waaronder het doorbreken van de epitheliale barrière, infectiebeeldvorming en de repitheliale RNA-respons.

Een tweedimensionale organoïde cultuur op invasine of basement membraanextract om gastheer-bacteriën interacties te bestuderen

Leer micro-injectietechnieken voor het bestuderen van Cryptosporidium parvum-infecties in menselijke darm- en luchtwegorganoids. Deze methode maakt precieze levering van sporozoïeten en visualisatie van infecties mogelijk.

Het bestuderen van Cryptosporidium infectie in 3D-weefsel-afgeleide menselijke Organoid cultuur systemen door Microinjection

Meer video's verkennen