Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Karakterisering van eiwitbinding aan RNA in vivo blijft een grote uitdaging vanwege de complexe aard van RNA en de vele factoren die de interactie met eiwitten beïnvloeden. RNA binding eiwit of RBP-RNA affiniteit wordt gemeten in levende bacteriële cellen. Aangezien de cellulaire omgeving zowel de structuur van RNA als de resulterende RBP-RNA binding beïnvloedt, is het meten van de affiniteit in vivo cruciaal voor het begrijpen van dergelijke interacties in natuurlijke systemen.

Het geheim van succes zit hem in het ontwerp van de plasmiden. Het ontwerp moet gebruik maken van verschillende golven van delta en voorkomen dat het inbrengen van stop codons en frameshift mutaties. Begin dit protocol door het ontwerpen van de binding site cassette.

Elk minigen bevat een EagI-beperkingsplaats, 40 basissen van het vijfste hoofdeinde van het kanamycine-resistentiegen, de pLac/Ara-promotor, de ribosoombindingsplaats, AUG van het mCherry-gen, een afstandsman, een RBP-bindingsplaats, 80 basen van het vijfste eind van het mCherry-gen en een ApaLI-beperkingsplaats. Om het slagingspercentage van de test te verhogen, ontwerpt u drie bindende sitecassettes voor elke bindingsplaats met afstandhouders bestaande uit ten minste één, twee en drie basissen. Dubbel verteren zowel de mini-genen en de doelvector met EagI HF en ApaLI voor het uitvoeren van kolomzuivering van de digesten.

Ligate de verteerde minigenen aan de bindingsplaats ruggengraat met de rest van de mCherry reporter gen, terminator en een kanamycine resistentie gen. Zet vervolgens de ligatieoplossing om in Escherichia coli top 10 cellen. Na het identificeren van positieve transformatoren via Sanger sequencing, op te slaan gezuiverde plasmiden in de 96 goed formaat op min 20 graden Celsius.

Ook op te slaan de bacteriële stammen als glycerol voorraden in de 96 goed formaat op min 80 graden Celsius. Aangepaste volgorde van de vereiste RBP sequentie ontbreekt een stop codon als een dubbelstrengs DNA mini-gen met beperking sites aan de uiteinden. Zet de voorbereide plasmiden om in chemisch bevoegde bacteriële cellen die al een RBP mCerulean plasmide bevatten.

Om tijd te besparen, plaat de cellen met behulp van een acht kanaal pipetter op acht baanplaten met Luria-Bertani agar met relevante antibiotica. Kolonies moeten verschijnen in 16 uur op 37 graden Celsius. Selecteer een enkele kolonie voor elke dubbele transformator en breng over op 48 putplaten met 1,5 milliliter LB met geschikte antibiotica.

Laat de cellen groeien over een periode van 18 uur bij 37 graden Celsius schudden bij 250 RPM. Bewaar de overnachtingen als glycerol voorraden op min 80 graden Celsius in 96 goed platen. In de ochtend programmeert u de robot om 180 microliters van semi-porie medium of SPM op te warmen in 96 putplaten.

Programmeer de robot om de inducerplaat voor te bereiden. In een schone 96 put plaat, bereiden putten met SPM bestaande uit 95%BA en 5%LB. Het aantal putten komt overeen met het gewenste aantal inducerconcentraties.

Voeg C4-HSL toe aan de putten in de inducerplaat die de hoogste inducerconcentratie zal bevatten. Programmeer vervolgens de robot om het medium van elk van de hoogste concentratieputten serieel te verdunnen in 23 lagere concentraties variërend van nul tot 218 nanomolar. Het volume van elke inducatorverdunning moet voldoende zijn voor alle stammen.

Om de nachtelijke stammen te verdunnen, programmeer de robot om te verdunnen met een factor 10 door 20 microliter bacteriën te mengen met 180 microliter SPM in 48 putplaten. Verdun vervolgens opnieuw met een factor 10 door 20 microliter uit de verdunde oplossing in de voorgeprepareerde stamplaat te brengen die geschikt is voor fluorescerende meting. Nu programma de robot om de verdunde inducer toe te voegen van de inducer plaat aan de 96 goed platen met de verdunde stammen volgens de uiteindelijke concentraties.

Schud de 96 goed platen op 37 graden Celsius gedurende zes uur. Gedurende die tijd, metingen van de optische dichtheid of OD op 595 nanometer evenals mCherry en mCerulean fluorescentie via een plaatlezer om de 30 minuten. Voor normalisatiedoeleinden meet u de groei van SPM zonder cellen.

Hier worden driedimensionale percelen getoond voor een positieve stam. De percelen tonen ruwe OD niveaus, mCerulean fluorescentie, en mCherry fluorescentie als functie van tijd en inducer concentratie. mCerulean steady-state expressie niveaus werden berekend voor elke inducer concentratie voor zowel de positieve als negatieve stammen.

De mCherry productiesnelheid werd ook berekend voor elke inducer concentratie voor zowel positieve als negatieve stammen. mCherry productiesnelheid werd uitgezet als een functie van gemiddelde mCerulean fluorescentie gemiddeld over twee biologische duplicaten voor twee stammen. De pasvorm KRBP met behulp van de montageformule wordt getoond voor de positieve stam die een specifieke bindende respons vertoont.

Voor de negatieve stam werd geen KRBP-waarde geëxtraheerd. Genormaliseerde dosisresponscurven werden bepaald voor 30 verschillende stammen op basis van twee RBPs als 10 bindingsplaatsen op verschillende locaties. Er worden drie soorten reacties waargenomen, hoge affiniteit, lage affiniteit en geen affiniteit.

Hier worden kwantitatieve KRBP-resultaten getoond voor twee RBPs, MS2-laageiwit en PP7-laageiwit met 10 verschillende bindingsitecassettes. Dosisresponscurven voor MS2-laageiwit met een gemuteerde bindingsplaats op vier verschillende locaties worden hier getoond om het effect van de mutante afstand op de productie van mCherry aan te tonen. De volgorde van de geteste gemuteerde bindingsplaats wordt weergegeven.

Het is belangrijk om een structurele techniek te gebruiken, zoals vormzoeken om chemisch sonde van de structuur van het eiwit-RNA complex en te visualiseren welke mRNA-regio's worden beïnvloed door RNA binding. Onlangs hebben we deze techniek op een hoge doorvoermanier gebruikt om tegelijkertijd de affiniteit van de RBP's te meten op 10.000 bindingssites.