Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie

Zowel blastocyst biopsie en vitrification zijn een revolutie in IVF, in vitro fertilisatie, waardoor embryologen uit de hele wereld preimplantatie genetische testen op menselijke embryo's met een minimaal risico voor het embryo uit te voeren. Trophectoderm biopsie heeft het ophalen van ongeveer zeven cellen uit een volgroeid embryo mogelijk gemaakt, waardoor robuuste downstream genetische analyse mogelijk werd. Bovendien is tot op heden geen effect op deze aanpak aangetoond.

De klinische efficiëntie van deze workflow stelt patiënten met monogene aandoeningen en al die patiënten met een verhoogd risico op chromosomale afwijkingen binnen hun blastocyst in staat om te profiteren van preimplantatie genetische tests. Er is nog ruimte voor het verbeteren van de huidige strategieën van embryoselectie. MiRNomic en proteomische profilering vormen bijvoorbeeld intrigerende opties om preimplantatiegeneticatesten op één trophectodermbiopsie aan te vullen.

Onervaren operators worstelen vaak met het openen en penetreren van de zona pellucida. Het is gewoon een kwestie van focus. De blastocyst, laser doelstelling, en pipetten moeten op hetzelfde brandpuntsvlak.

Na het labelen van de biopsie schotel met de gegevens van de patiënt, met een permanente, niet-toxische marker, nummer elke 10-microliter druppel van HEPES-gebufferd medium met het embryo en de cyclus ID.Using een 300-micrometer strippen pipet, breng een levensvatbare, volledig uitgebreide blastocyst naar de eerste druppel van de biopsie schotel en spoel de druppel om de overtollige cultuur medium te verwijderen, voordat u de blastocyst in de tweede druppel in de schotel. Plaats de schotel onder een omgekeerde microscoop, en prime de biopsie pipet met medium uit de derde druppel van de biopsie schotel. Onder een 20 keer vergroting, oriënteren van de blastocyst om een duidelijk zicht op de binnenste cel massa te verkrijgen op zeven uur, en zet het embryo op het bedrijf pipet.

Focus op de zona pellucida, zodat zowel de pipetten als de blastocyst zich op hetzelfde brandpuntsvlak bevinden. Schakel over naar de laserdoelstelling en plaats de laseraanwijzer op de zona pellucida aan de andere kant van de binnenste celmassa. Boor de zona pellucida met twee tot drie laserpulsen en druk de biopsiepipet voorzichtig tegen de zona pellucida om het medium door de breuk te laten blazen om de trophectodermcellen los te maken van het interne oppervlak.

Wanneer het trophectoderm wordt losgemaakt, gaat u door het gat en zuigt zeven tot acht trophectodermcellen in de biopsiepipet met zachte zuigkracht. Terwijl u een matige zuigkracht toepast om de doelcellen uit te rekken, beweegt u de biopsiepipet lichtjes naar achteren en leidt u de laser naar het dunste deel van de aangezogen cellen. Vuur twee tot vijf laserpulsen af op de verbindingen tussen de cellen om de doelcellen te scheiden van het lichaam van het embryo.

Wanneer het trophectodermfragment is gescheiden van de blastocyst, laat u het fragment los in dezelfde biopsiedruppel ver van de blastocyst om te voorkomen dat het fragment weer in de biopsiepipet wordt gezogen. Laat de blastocyst los van de houdpijp en hef beide pipetten onmiddellijk op om te voorkomen dat het fragment aan pipetten blijft plakken. Beeld vervolgens het gebiopte fragment voor kwaliteitscontroledoeleinden.

Wanneer alle blastocysten zijn biopten zoals net aangetoond, verplaats de biopsie schotel terug naar de laminaire flow kap en label de post-biopsie cultuur schotel met het paar ID en elke druppel met het embryo en cyclus ID's. In aanwezigheid van een getuige, spoel de blastocyst in schoon IVF-medium en verplaats de blastocyst naar de overeenkomstige daling in de post-biopsie schotel. Plaats vervolgens de post-biopsie schotel tot een 37-graden Celsius, 6%kooldioxide, en 5% zuurstof incubator.

In aanwezigheid van de getuige en in een laminaire stroomkap bij kamertemperatuur, label de PCR-buizen met een permanente, niet-toxische marker. Label het deksel van een 60 x 15-millimeter buizenkweekschotel met de biopsied embryo-id's en voeg twee 10-microliter druppels biopsiewasoplossing toe aan de schotel. Prime een 140-micrometer strippen pipet met biopsie wassen oplossing van de tweede druppel van de buisschotel onder de stereo microscoop om de trophectoderm fragmenten visualiseren.

Laat voorzichtig een biopsiewasoplossing los op het trophectodermfragment en laad het fragment in de strippijp. Verplaats het fragment naar de tweede druppel biopsiewasoplossing en spoel het weefsel twee tot drie keer zorgvuldig af. Breng het trophectodermfragment met de punt van de strippijp naar de bodem van de juiste gelabelde PCR-buis, waarbij u ervoor zorgt dat de wanden van de buis niet met de punt van de strippipet raken.

Wanneer alle fragmenten zijn toegevoegd aan hun buizen, draai alle buizen in een mini-centrifuge voor een paar seconden om sediment de fragmenten. Bewaar de monsters vervolgens op min 20 graden Celsius totdat ze worden verzonden naar het verwijzende genetische laboratorium voor het testen. Label binnen 30 minuten na trophectodermbiopsie een vitrificatieplaat met de gegevens van de patiënt en de id's van de blastocysten die moeten worden verglaasd.

Met behulp van speciale koude temperatuur-resistente cryolabels, label de vitrificatie ondersteunt met de naam van de patiënt en achternaam, paar ID, ID van het embryo dat zal worden geladen op het, en de datum van de procedure. Bij kamertemperatuur, 300 microliter van evenwichtsoplossing voor elke blastocyst die zal worden verglaasd en, in aanwezigheid van een getuige, gebruik maken van een 300-micrometer strippen pipet om de blastocyst te verplaatsen in een volume van evenwicht oplossing. Laat de blastocyst 13 tot 15 minuten in de evenwichtsoplossing.

Na een eerste krimp van het volume zal een geleidelijke heruitbreiding worden waargenomen. Voeg aan het einde van de evenwichtsoplossing 300 microliter vitrificatieoplossing toe aan de tweede put van de vitrification-plaat en breng de volledig opnieuw uitgebreide blastocyst gedurende één minuut over naar de vitrificatieoplossing. Spoel aan het einde van de incubatie de blastocyst af om de evenwichtsoplossing te verdunnen en laad de blastocyst in aanwezigheid van een getuige op de vitrificatieondersteuning.

Verwijder de overmaat aan vitrificatieoplossing. Een subtiele film van oplossing moet de blastocyst omringen. Dompel de vitrificatiesteun in vloeibare stikstof en verplaats de steun krachtig om het risico op bellenvorming dicht bij het monster te verminderen.

Plaats vervolgens de beschermkap op de steun, terwijl de vitrification-ondersteuning nog steeds onder water staat in vloeibare stikstof. Van de 1, 544 trophectoderm biopsie procedures uitgevoerd over deze representatieve periode van twee jaar, tussen de een tot vier blastocysten werden biopsied per procedure voor tussen de drie tot 22 minuten per procedure. In deze percelen wordt de gemiddelde timing van de biopsie voor elke operator langs de studietristers weergegeven, met een gemiddelde totale waarde van 8,24 minuten.

Het is nuttig om een beeld van elk gebiopt fragment te verkrijgen voor kwaliteitscontroledoeleinden om te beoordelen of de oorzaak van niet-overtuigende diagnoses te maken had met de dimensie en/of kwaliteit van het fragment, aan de slang of aan enkele problemen bij de verwerking van het monster in het genetische laboratorium. In deze studie werden 572 euploïde blastocysten opgewarmd om een embryotransfer te ondergaan na een diagnose van euploidy. Alle blastocysten verglaasd binnen 30 minuten, met 2,4% van de blastocysten niet opnieuw uit te breiden tussen 31 en 90 minuten en 4,9%niet opnieuw uit te breiden dan 90 minuten na het opwarmen.

Vooral voor slechte kwaliteit en/of dag zeven blastocys, lijkt de timing tussen biopsie en vitrificatie cruciaal om na opwarming opnieuw uit te breiden. Zorg ervoor dat u zich concentreert voordat u de zona pellucida opent bij het blootstellen van de kruising tussen de trophectodermcel en het afvuren, en zorg er ook voor om blastocyst re-expansie voor vitrification te voorkomen. Twee andere blastocyst biopsie benaderingen bestaan, zowel met zona pellucida openen en wachten op een spontane aartsvijand van de trophectoderm cellen.

Deze benaderingen zijn gemakkelijker, maar vereisen meer manipulaties en zijn tijdrovender. De werkzaamheid van deze workflow maakt de implementatie van moleculaire technologieën in IVF mogelijk om te proberen de blastocyst te selecteren met de hoogste kans om te implanteren vóór de embryotransfer. Vergeet niet geen apparaat of oplossing te gebruiken die giftig kan zijn voor de embryo's en om DNA-besmetting te voorkomen met behulp van DNA-vrije materialen.