Name: In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer een luciferase-reporterassay om vertaalregulatie in pokkenvirus-geïnfecteerde cellen te bestuderen met behulp van in vitro getranscribeerd RNA. Deze methode onderzoekt cis-elementen zoals 5'UTR en 3'UTR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het project werd gefinancierd door de nationale instituten van gezondheid (AI128406 www.nih.gov) aan ZY en gedeeltelijk door het onderzoekscentrum van de kanker van Johnson (http://cancer.k-state.edu) in de vorm van gediplomeerde student de zomer toelage aan PD.

1. voorbereiding van DNA-Template door PCR voor in vitro transcriptie
<ol><li>Om het malplaatje van DNA door PCR voor te bereiden, ontwerp inleidingen. Bij het ontwerpen van primers overwegen cruciale kenmerken zoals primer lengte, gloeien temperatuur (Tm), GC-inhoud, 3 ' eindigen met G of C, enz. Opmerking: Uitvoerig besproken in deze literatuur25,26,27.</li>
	<li>De inleidingen van het ontwerp om PCR amplicon te produceren die de volgende elementen in 5 ' tot 3 ' richting bevatten: de-promotor, de poly (A) leider, Firefly Luciferase ORF en een poly (A) staart hierna aangeduid als T7_12A-Fluc. Ontwerp primers (vooruit en achteruit) om alle extra elementen te omvatten die niet aanwezig zijn in het sjabloon DNA (Figuur 2a). Opmerking: De opeenvolging van alle elementen is te vinden in tabel 1.
</li>
	<li>Voeg een aantal extra nucleotiden in voorwaartse primer (5 '-3 ')28, gevolgd door de voor-promotor, poly (a) leider of gewenste 5 '-UTR sequentie en ongeveer 20 nucleotiden, aan te passen op basis van Tm, overeenkomt met de 5 ' einde van de verslaggever Gene Orf. Zorg ervoor dat de overeenkomstige regio in de primer identiek is aan de Sense streng (+ streng) van het gen. Opmerking: Voor de lange 5 '-UTR, synthetiseren twee DNA-fragmenten: een met de promotor, gevolgd door een lange 5 '-UTR en de tweede met de ORF verslaggever Gene. Word lid van deze twee fragmenten met behulp van overlap uitbreiding PCR29.</li>
	<li>Design reverse primer (5 '-3 ') om poly (A) staart en ongeveer 20 nucleotiden, aan te passen op basis van Tm, overeenkomt met de 3 ' einde van de reporter gene ORF. Zorg ervoor dat de overeenkomstige regio in de primer is identiek aan de Anti-sense streng (-streng) van het gen en een in-frame stop codon aanwezig is voor de poly (A) staart. Opmerking: De gewenste lengte van een in een poly (A) leider of poly (A) staart kan worden aangepast in de primers. Bijvoorbeeld, om 50 A in de poly (A) staart toe te voegen, zou de omgekeerde Inleiding 50 T's moeten met zich meebrengen. Evenzo, tot en met 20 A in de poly (A) leider toe te voegen, moet de voorwaartse primer met zich meebrengen 20 A 's.</li>
	<li>Voor interne controle, ontwerp een andere set van primers met de volgende elementen in 5 ' tot 3 ' richting: de promotor, een willekeurige 5 '-UTR codering sequentie met Kozak sequentie, Renilla Luciferase ORF en poly (a) staart hierna aangeduid als T7_ Kozak-Rluc.</li>
	<li>In een PCR buis, voeg de reagentia in de volgende orde toe: DNase vrij water, 2x High-Fidelity polymerase van DNA, inleidingen, en opeenvolging bevestigde Luciferase malplaatje DNA (lijst 2). Opmerking: De hoeveelheden afzonderlijke componenten in het mengsel moeten worden aangepast naargelang het reactievolume.</li>
	<li>Gebruik een standaard 3-stap (denaturatie, gloeien, uitbreiding) PCR-cyclus voor het genereren van een DNA-sjabloon zoals weergegeven in tabel 3. Opmerking: De gloeiende temperatuur X °C hangt van de inleidingsreeks af die wordt gebruikt en de uitbreidings tijd T min hangt van de PCR amplicon grootte en de gebruikte polymerase van DNA af.</li>
	<li>Ontdek het PCR product door 5-10% van PCR reactie in 1% agarose tris-acetate-EDTA (TAE) te lopen de Elektroforese van het gel (bevattend 0.1 µ g/ml ethidium bromide) samen met commercieel beschikbaar moleculair gewichts norm. Visualiseer de gel onder een UV illuminator om de grootte van het PCR product te bepalen.</li>
	<li>Na het bepalen van de correcte grootte van het PCR product, ~ 1,7 KB voor T7_12A-Fluc en ~ 1,0 KB voor T7_Kozak-Rluc, zuivert het gebruikend een commercieel beschikbare PCR reinigings uitrusting. Elueer het DNA met behulp van 100 µ L Nuclease vrij water (Figuur 2b).</li>
	<li>Eenmaal gezuiverd, controleer dan de concentratie van het DNA met behulp van een spectrofotometer en bepaal de A260/A280 ratio (~ 1.8-2.0 is aanvaardbaar).</li>
	<li>Opslag gezuiverd DNA bij-20 °C of gebruik voor in vitro transcriptie onmiddellijk.</li>
</ol>2. Genereer mRNA door in-vitro transcriptie
<ol><li>
Synthetiseren RNA van het PCR product in vitro, gebruikend een in-vitro transcriptie uitrusting (Figuur 3a). Nota: T7_12A-Fluc en T7_Kozak-Rluc de malplaatjes van DNA worden gebruikt om 12a-Fluc en Kozak-Rluc mRNAs, respectievelijk te synthetiseren.<ol>
<li>Om dit te doen, neem een micro centrifugebuis en voeg de reagentia in de volgende volgorde: DNase-ASE gratis water, NTP buffer mix, Cap analoog, template PCR product, tempels-RNA polymerase mix (tabel 4). Opmerking: Andere het afdekken systemen kunnen ook aan GLB RNA opeenvolgend na in-vitro transcriptie na de instructie van de fabrikant worden gebruikt.</li>
		<li>Meng grondig en Incubeer bij 37 °C voor 2 uur.</li>
		<li>Overgaan tot de zuivering van de gesynthetiseerde RNA met behulp van een RNA zuivering Kit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Looppas gezuiverd RNA in 1,5% agarose tris-borate-EDTA (TBE) gel (bevattend 0,5 µ g/mL ethidium bromide) om RNA te controleren. Visualiseer de gel onder een UV-verlichter (Figuur 3b).</li>
	<li>Controleer de concentratie van RNA gebruikend een spectrofotometer en bepaal de A260/A280 verhouding (~ 1.8-2.0 is aanvaardbaar).</li>
	<li>Hoeveelheid gezuiverd RNA en opslag bij-80 °C.</li>
</ol>3. Transfect mRNA aan cellen
<ol><li>Zaad HeLa cellen in een 24-Well plaat (tot ca. ~ 80-90% Confluent volgende dag) en broeden 's nachts in een incubator op 37 ° c met 5% CO2.</li>
	<li>Infecteren HeLa cellen met Vaccinia virus (VACV) op een multipliciteit van de infectie (MOI) van 5 of houden niet-geïnfecteerde HeLa cellen voor de vergelijking. Opmerking: MOI is het aantal besmettelijke virale deeltjes per cel.</li>
	<li>MOI van X = {[(aantal cellen * X)/virus titer] * 1000} µ l van virus per 1 mL medium.</li>
	<li>
Na gewenste h post besmetting (HPI) (in dit experiment bij 10-12 HPI), transfect mRNA (500 ng van totaal mRNA per put van 24-goed platen) gebruikend een kationische lipide transfectie reagens zoals aangetoond in figuur 3c.
	<ol>
<li>Voor één goed van een 24-goed plaat, mengeling 480 ng van 12A opeenvolging die Firefly Luciferase (12A-Fluc) mRNA en 20 ng van Kozak opeenvolging dragende Renilla Luciferase (Kozak-Rluc) mRNA in één micro centrifugebuis draagt. In een andere micro centrifugebuis toe te voegen 1,1 µ L van kationische lipide transfectie reagens.</li>
		<li>Voeg 55 µ L van verminderd serum middel in beide buizen toe. Meng en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min.</li>
		<li>Na 5 min van incubatie, voeg 55 µ L kationische lipide transfectie reagens met verminderde serum medium in mRNA met buis.</li>
		<li>Meng voorzichtig, maar grondig, en Incubeer bij kamertemperatuur voor 15 minuten.</li>
		<li>Tijdens de incubatie, verwijder de cel kweekmedium en Voeg 400 µ L van verminderde serum medium per put van 24-Well platen.</li>
		<li>Na incubatie, voeg 100 µ L van het mengsel dropwise en gelijk aan één goed van 24-goed platen toe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. maatregel Luciferase activiteiten
<ol><li>Vijf-uren post-co-transfectie van 12A-Fluc en Kozak-Rluc mRNA, maatregel Luciferase activiteit gebruikend een Luciferase assay systeem geschikt om twee verslaggever analyses uit te voeren (b.v., Dubbele Luciferase reporter assay kit).</li>
	<li>Verwijder de verminderde serum medium en Lyse de cellen door toevoeging van 150 µ L 1x lysis buffer, een component van de Luciferase assay kit.</li>
	<li>Na 10 min incubatie bij kamertemperatuur, het verzamelen van de lysate door de sloop van de cellen en de overdracht aan een micro centrifugebuis.</li>
	<li>Centrifugeer de lysate bij 12.000 x g voor 10 min bij 4 °c aan korrelcellen puin.</li>
	<li>Voeg 30 µ L van bovendrijvende in ondoorzichtige-ommuurde 96 goed witte assay plaat met een stevige bodem.</li>
	<li>Meet de dubbele luminescentie met behulp van de Luciferase assay kit en een multimode plaat lezer luminometer.</li>
	<li>Voer de meting met behulp van de kinetica functie (op een per-well basis) met behulp van de instellingen beschreven in tabel 5. Opmerking: De lezing kan ook worden genomen gebruikend hand luminometer. Voeg een gelijk volume van lysate en substraat voor Fluc in een Cuvette. Wacht tot 2 s en meet voor 10 s met behulp van luminometer. Na Fluc meting, snel uit te nemen Cuvette van luminometer en voeg een gelijk volume van het substraat voor Rluc handmatig. Nogmaals, wacht op 2 s en maatregel voor 10 s met behulp van luminometer.</li>
	<li>Exporteer de luminescentie Lees gegevens naar een wenselijke bestandsindeling.</li>
	<li>Bepaal relatieve vertaling tarief van 12A-Fluc mRNA in niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde HeLa cellen door het delen van Fluc waarde door interne controle Rluc waarde. Opmerking: Aanvullende figuur 1 toont de stap-voor-stap analyse van de ruwe gegevens om de relatieve Fluc activiteit te krijgen.</li>
</ol>

<ol><li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li>
<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Dogma+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes%3A+Mechanisms+and+Biological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li>
<li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li>
<li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShchelkunov%2C+SN+%22Orthopoxviruses+Pathogenic+for+Humans%22">Orthopoxviruses Pathogenic for Humans</a>. , Springer US. (2005).</li>
<li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li>
<li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+Translation%3A+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351(2013).</li>
<li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+against+the+Tide%3A+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li>
<li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5%E2%80%99+noncoding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li>
<li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li>
<li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3%E2%80%B2+or+the+5%E2%80%B2+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li>
<li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li>
<li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+poly%28A%29+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li>
<li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Review.+RNA%22%5BJournal%5D)">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li>
<li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+poly%28A%29+leaders+of+variable+lengths+at+the+5%E2%80%99+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li>
<li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5%E2%80%99+poly%28A%29+leader+on+its+early+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li>
<li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5%E2%80%B2+poly%28A%29+leader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li>
<li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+initiation+and+3%E2%80%B2+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li>
<li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%E2%80%99-poly%28A%29+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602(2017).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li>
<li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li>
<li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23(2005).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+the+5%E2%80%B2+and+3%E2%80%B2+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+Guide+to+Methods+and+Applications%22">PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li>
<li>Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+JA+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci%3A+Methods+and+Protocols%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).</li>
<li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II%E2%80%93associated+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li>
<li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific%2C+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li>
<li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862(2018).</li>
<li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

De auteurs willen geen concurrerend financieel belang verklaren.

Alle vier-kern stappen zijn essentieel voor het succes van de in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Speciale aandacht dient te worden besteed aan Primer design, met name voor de "propromotor" sequentie. De polymerase van RNA van 5' begint transcriptie van de onderstreepte eerste G (gGG-UTR-aug-) in de promotor van de voor de 5 '-UTR opeenvolging toegevoegd. Hoewel de transcriptie Startsite (TSS) begint vanaf de eerste G aan de 5 ' einde, het verminderen van het aantal van G minder dan drie...

Volgens het centrale dogma, de genetische informatiestromen van DNA aan RNA en dan tenslotte aan proteïne1,2. Deze stroom van genetische informatie is hoogst geregeld op vele niveaus met inbegrip van mRNA vertaling3,4. Ontwikkeling van verslaggever assays om regulering van genexpressie te meten zal het begrijpen van de regelgevende mechanismen die betrokken zijn bij dit proces te vergemakkelijken. Hier beschrijven wij een protocol om mRNA vertaling te bestuderen gebruikend een in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde Luciferase verslaggever assay in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen.
Poxviruses bestaat uit vele zeer gevaarlijke menselijke en dierlijke pathogenen5. Net als alle andere virussen, poxviruses uitsluitend beroepen op host Cell machines voor de eiwitsynthese6,7,8. Om efficiënt te synthetiseren virale eiwitten, virussen geëvolueerd vele strategieën om mobiele translationele machines te kapen om het te omleiden voor de vertaling van virale mRNAs7,8. Een algemeen werkend mechanisme door virussen is het gebruik van CIS-Acting elementen in hun transcripten. Bekende voorbeelden zijn de interne ribosoom entry site (IRES) en Cap-Independent Translation Enhancer (cite)9,10,11. Deze CIS-elementen maken de virale transcripten een translationeel voordeel door het aantrekken van translationele machines via diverse mechanismen12,13,14. Meer dan 100 familie pokkenvirus mRNAs heeft een evolutionair behouden CIS-handelend element in 5 '-onvertaald gebied (5 '-UTR): een 5 '-poly (a) leider bij de zeer 5 ' einden van deze mRNAs15,16. De lengtes van deze 5 '-poly (a) leiders zijn heterogeen en door ontsporing van de familie pokkenvirus-gecodeerde polymerase van RNA tijdens transcriptie17,18geproduceerd. Wij, en anderen, ontdekten onlangs dat de 5 '-poly (a) leider een Vertaal voordeel aan mRNA in cellen verleent die met Vaccinia virus (VACV) worden besmet, het prototypic lid van poxviruses19,20.
De in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay werd in eerste instantie ontwikkeld om de rol van 5 '-poly (a) leider in mRNA vertaling te begrijpen tijdens familie pokkenvirus infectie19,21. Hoewel de plasmide op DNA-gebaseerde Luciferase verslaggever analyses wijd zijn gebruikt, zijn er verscheidene nadelen die de resultaat interpretatie in familie pokkenvirus-besmette cellen zullen compliceren. Eerst, kunnen de plasmiden in VACV-besmette cellen repliceren22. Ten tweede, cryptische transcriptie komt vaak uit plasmide DNA18,23,24. Ten derde, VACV promotor-gedreven transcriptie genereert poly (A)-leider van heterogene lengtes waardoor het moeilijk is om de poly (A)-Leader lengte controle in sommige experimenten18. Een in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay omzeilt deze kwesties en de gegevensinterpretatie is eenvoudig.
Er zijn vier belangrijke stappen in deze methode: (1) de Kettingreactie van de polymerase (PCR) om het malplaatje van DNA voor in-vitro transcriptie te produceren; (2) in-vitro transcriptie voor het genereren van mRNA; (3) transfectie om mRNA in cellen te leveren; en (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling (Figuur 1). Resulterende PCR amplicon bevat de volgende elementen in 5 ' aan 3 ' richting: de-promotor, poly (A) leider of gewenste 5 '-UTR opeenvolging, Firefly Luciferase open lezings kader (ORF) gevolgd door een poly (A) staart. PCR amplicon wordt gebruikt als malplaatje om mRNA door in-vitro transcriptie te synthetiseren gebruikend de polymerase van tempels. Tijdens in vitro transcriptie, m7G GLB of andere GLB Analog is opgenomen in nieuw gesynthetiseerde mRNA. De afgetopte transcripten zijn transfected in niet-geïnfecteerde of VACV-geïnfecteerde cellen. De cel lysate wordt verzameld op de gewenste tijd na transfectie om Luciferase activiteiten te meten die op eiwitproductie van transfected mRNA wijzen. Deze verslaggever analyse kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-element te bestuderen aanwezig in 5 '-UTR, 3 '-UTR of andere gebieden van mRNA. Voorts kan de in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde analyse worden gebruikt om verschillende mechanismen van Vertaal initiatie met inbegrip van GLB-afhankelijke initiatie, GLB-onafhankelijke initiatie, re-initiatie en interne initiatie zoals IRES te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>High-Fidelity DNA Polymerase gebruikt in PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Anti reverse Cap analog of ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Opaque walled 96 well witte plaat met stevige bodem</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>PCR zuiveringskit</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Microplate Luminometer</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Referreert als multimode plate reader luminometer</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Vitro transcriptiekit</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Cationisch lipide transfectie reagens</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Gebruikt om DNA- en RNA-concentratie te meten</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Media met verminderd serum</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>Vaccinia Capping System</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080</td><td>Capping systeem</td></tr></tbody></table>

in vitro getranscribeerd rna-based luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Elke familie pokkenvirus mRNA die na virale replicatie van DNA wordt getranscribeerd heeft een evolutionair behouden, niet-malplaatjed 5 '-poly (A) leider in 5 '-UTR. Om de rol van 5 '-poly (A) leider in mRNA vertaling tijdens familie pokkenvirus besmetting te ontleden ontwikkelden wij een in vitro getranscribeerde RNA-based Luciferase reporter assay. Deze reporter assay bestaat uit vier kern stappen: (1) PCR om de DNA-template voor in vitro transcriptie te versterken; (2) transcriptie in vitro om mRNA te produceren gebruikend de polymerase van RNA (3) transfectie om in vitro getranscribeerd mRNA in cellen te introduceren; (4) detectie van Luciferase activiteit als indicator van de vertaling. De RNA-based Luciferase reporter assay beschreven hier omzeilt kwesties van plasmide replicatie in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen en cryptische transcriptie van de plasmide. Dit protocol kan worden gebruikt om Vertaal regelgeving door CIS-elementen in een mRNA met inbegrip van 5 '-UTR en 3 '-UTR in andere systemen dan familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen te bepalen. Bovendien kunnen verschillende vormen van vertaling initiatie zoals Cap-afhankelijke, Cap-onafhankelijke, re-initiatie, en interne initiatie worden onderzocht met behulp van deze methode.

De vier stappen van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay: PCR voor het genereren van DNA-sjabloon voor in vitro transcriptie, in vitro transcriptie te genereren mRNA, mRNA transfectie, en Luciferase meting, kan worden gezien in het schematische diagram ( Figuur 1). Het ontwerpen van inleidingen voor beide malplaatjes van DNA (Fluc en Rluc) en het algemene schema van de uitbreiding PCR van de overhang wordt geïllustreerd in het schemati...

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Ons protocol voor een in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde luciferase test helpt bij het bestuderen van vertaalregulatie in pokkenvirus geïnfecteerde cellen. Bovendien maakt een aangepaste lengte van de Poly(A)-liter het mogelijk om de regulerende effecten op de vertaling te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor de studie van de vertaalregulatie door Cis-elementen zoals 5'UTR en 3'UTR in mRNA en breed spectrum van vertaalinitiatie.De in vitro getranscribeerde RNA-gebaseerde luciferase reporter test kan worden aangepast aan modificatie aan cap en andere modificatie op te nemen en gebruikt om het effect op de vertaling te testen. Om te beginnen, ontwerp naar voren en omgekeerde primers om PCR amplicon te genereren met de volgende elementen in 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF in een Poly (A)tail aangeduid als T7_12A-Fluc, omvatten een aantal extra nucleotiden in voorwaartse primer, gevolgd door T7-Promotor Poly (A)liter of gewenste 5'UTR sequentie en ongeveer 20 nucleotiden die overeenkomen met de 5'end van de off van het reportergen. Pas de primerlengte aan op basis van de smelttemperatuur die overeenkomt met de 5'end van de ORF van het reportergen, zodat het overeenkomstige gebied in de primer identiek is aan de zinstreng van het gen.Ontwerp vervolgens omgekeerde primer om Poly(A)tail en ongeveer 20 nucleotiden op te nemen. Pas aan op basis van de smelttemperatuur die overeenkomt met de 3'end van de ORF van het reportergen, zodat het overeenkomstige gebied van de primer identiek is aan de antisense streng van het gen en een in-frame stop codon aanwezig is voor de Poly(A)staart. Voor interne controle, ontwerp een andere reeks primers met de volgende elementen in 5'to 3'direction:T7-Promoter, een willekeurige 5'UTR codering sequentie met Kozak sequentie, Renilla Luciferase ORF, en Poly (A) staart, aangeduid als T7_Kozak-Rluc.Om de reactie in te stellen, voeg reagentia in de volgende volgorde toe aan een PCR-buis: DNase vrij water, 2X high-fidelity DNA polymerase, primers en sequentie bevestigd luciferase template DNA. Na een standaard drie-staps PCR-cyclus om een DNA-sjabloon te genereren, detecteert u het PCR-product door 5-10% van de PCR-reactie uit te voeren in een 1%agarose TAE gel elektroforese samen met een moleculaire gewichtsnorm. Visualiseer de gel onder een UV-verlichting om de grootte van het PCR-product te bepalen.Na het bepalen van de juiste grootte van het PCR-product, zuiveren met behulp van een commercieel verkrijgde PCR zuivering kit met behulp van 100 microliters van nuclease gratis water om het DNA te ontlenen. Controleer de concentratie van het gezuiverde DNA met behulp van een spectrofotometer en bewaar deze op min 20 graden Celsius voor gebruik voor in vitro transcriptie onmiddellijk. Om RNA uit het PCR-product te synthetiseren, voegt u de volgende reagentia toe aan een microcentrifugebuis: DNase-RNase gratis water, NTP-buffermix, capanaloog, PCR-productsjabloon en T7-RNA polymerasemix van in vitro transcriptiekit.Meng. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende twee uur en ga dan over tot de zuivering van de gesynthetiseerde RNA met behulp van een RNA zuivering kit. Om het gezuiverde RNA te controleren, verwarmt u RNA gedurende vijf minuten op 70 graden om de secundaire structuur te verwijderen en op 1,5 agarose TBE-gel uit te voeren.Visualiseer vervolgens de gel onder een UV-verlichting. Controleer de concentratie van het gezuiverde RNA met behulp van een spectrofotometer. Aliquot het en op te slaan op min 80 graden Celsius.Seed HeLa cellen in een 24 put plaat tot 80-90% samenvloeiing te bereiken de volgende dag en 's nachts in een incubator in te broeden op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Infecteer HeLa-cellen met het Vaccinia-virus bij een veelheid aan infectie van vijf en houd niet-geïnfecteerde HeLa-cellen ter vergelijking. Vervolgens incubeer de plaat op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide voor 10 tot 12 uur.Na de gewenste uren na infectie, meng 480 nanogram van 12A sequentie met Firefly Luciferase mRNA en 20 nanogram van Kozak sequentie met Renilla Luciferase mRNA in een microcentrifuge buis. In een andere microcentrifuge buis, voeg 1,1 microliter van kationische lipide transfectie reagens. Voeg 55 microliter verlaagde serummedia toe aan beide buizen, meng en broed vijf minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens 55 microliter cationic lipide transfection reagens met verminderde serummedia toe aan mRNA met buis. Meng voorzichtig maar grondig met een pipet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Verwijder tijdens de incubatie het celkweekmedium uit de cellen en voeg 400 microliter met verlaagd serummedium per put toe.Wanneer incubatie is voltooid, voeg 100 microliters van het mengsel drop verstandig en gelijkmatig per put van de 24 put plaat. Vijf uur na co-transfectie met 12A Fluc en Kozak Rluc mRNA, verwijder het verlaagde serummedium uit de cellen en lyse de cellen door het toevoegen van 150 microliters 1X lyse buffer van de Luciferase test kit geschikt voor het uitvoeren van twee reporter testen. Schraap na 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur de cellen met rubber en steriele spuit en breng deze over naar een microcentrifugebuis.Om celpuin te pellen, centrifugeer het lysaat op 12.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng 30 microliter supernatant per put van een ondoorzichtige ommuurde 96 goed witte testplaat met een stevige bodem. Gebruik de Luciferase-testkit en een multi-mode plaatlezer luminometer om de dubbele luminescentie te meten met behulp van kinetiekfunctie zoals beschreven in het manuscript.Na het exporteren van de luminescentieleesgegevens in een wenselijk bestandsformaat, bepaal je de relatieve vertaalsnelheid van 12A Fluc mRNA in niet-geïnfecteerde en MET VACV geïnfecteerde HeLA-cellen door fluc-waarde te delen door de waarde van interne controle Rluc. Deze test werd gebruikt om de vertaalefficiëntie van een Fluc mRNA te testen die een 5'Poly(A)liter bevat in niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde cellen. Zowel niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde cellen werden met succes mede-transfected met Fluc en Rluc mRNA.Het delen van Fluc door Rluc normaliseerde de transfectie-efficiëntie in RNA-stabiliteit in cellen. 5'Poly(A)liter met mRNA heeft een translationeel voordeel tijdens VACV-infectie in vergelijking met niet-geïnfecteerde cellen. Dit was niet te wijten aan differentiële transfectie efficiëntie of mRNA stabiliteit als het RNA-niveau was vergelijkbaar in niet-geïnfecteerde en VACV geïnfecteerde cellen vijf uur na mRNA transfectie.Wees extra voorzichtig bij het ontwerpen van primers, omdat dit niet alleen de efficiëntie van de PCR-reactie kan beïnvloeden, maar ook alle downstreamprocessen die het versterkte DNA vereisen. Deze methode is een belangrijke test om de vertaalverordening snel te testen op Cis-elementen. Indien mogelijk moet deze methode worden bevestigd door andere aanvullende experimenten.Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het gebruik van het Vaccinia-virus en blootstelling aan chemische stoffen zoals ethidiumbromide en fenol voorkomen.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze methode beschrijft de hoge opbrengst in vitro synthese van zowel gecapte als ongecapte mRNA vanuit een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase (GLuc) gen bevat. Het RNA wordt gezuiverd en een fractie van het ongecapte RNA wordt enzymatisch gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia virus. In de laatste stap wordt het mRNA getransfecteerd in HeLa-cellen en worden de supernatanten van de celcultuur geanalyseerd op luciferase-activiteit.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

This video demonstrates an assay to study the translation regulation in poxvirus-infected cells. Uninfected and virus-infected cells were co-transfected with mRNAs encoding for firefly luciferase (Fluc) and Renilla luciferase (Rluc), with the Fluc mRNA containing a 5' Poly(A) leader sequence. Upon adding bioluminescent substrates on lysed cells, measure the signal from both the luciferases to identify the translational advantage of the Fluc mRNA in virus-infected cells, conferred by the leader...

A Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-Infected Cells

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Transfectie in de macrofagencellijn, RAW264.7, is moeilijk vanwege de natuurlijke reactie van de cel tegen vreemde materialen. We beschrijven hier een zachte maar robuuste procedure voor het transfecteren van luciferase-reportergenen in RAW264.7-cellen.

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Een in vitro bioluminescentie test om te bepalen van cellulaire circadiane ritme in de borstklier epitheliale cellen wordt gepresenteerd. Deze methode maakt gebruik van zoogdiercellen verslaggever plasmiden gedestabiliseerd luciferase onder de controle van de periode 2 gen promotor uitdrukken. Het kan worden aangepast aan andere celtypes te evalueren orgel-specifieke effecten op de circadiane ritme.

In Vitro Bioluminescentie Assay te karakteriseren Circadian Rhythm in borstklier epitheliale cellen

Hier presenteren we de protocollen om te identificeren 1) virus-gecodeerde immunomodulators ter bevordering van arbovirus replicatie en 2) eukaryotische gastheer factoren die arbovirus replicatie beperken. Deze fluorescentie - en luminescentie gebaseerde methoden toestaan onderzoekers snel verkrijgen van kwantitatieve uitlezingen van arbovirus replicatie in simplistische testen met lage signaal-ruis verhouding.

Arbovirus infecties als Screening van hulpmiddelen voor de identificatie van de virale Immunomodulators en Host antivirale factoren

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Leer een luciferase-reporterassay om vertaalregulatie in pokkenvirus-geïnfecteerde cellen te bestuderen met behulp van in vitro getranscribeerd RNA. Deze methode onderzoekt cis-elementen zoals 5'UTR en 3'UTR.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen (Video) | JoVE Journal

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Meer video's verkennen