Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

Om toegang te krijgen tot neurale microRNA doelinteracties met MicroRNA-functies is van cruciaal belang om te begrijpen hoe MicroRNAs verschillende biologische processen reguleren in zowel gezonde als zieke toestanden. Dit protocol beschrijft de reproduceren door middel van strategie om microRNA doelen en de functionele microRNAs te identificeren als de validatie van directe doelstelling van microRNAs is een uitdaging. Ons protocol kan inzicht geven in de functie van individuele microRNAs en de implicatie van een microRNA in kankertherapie.

Berekening van de half-maximale remmende concentratie is een belangrijke methode, niet alleen voor microRNA-studies, maar voor de effectieve evaluatie van andere anti-kankermedicijnen. Ons protocol zal nuttig zijn voor nieuwe onderzoekers, omdat we de fundamentele methode beschreven om het niveau van microRNAs in een cel te begrijpen. Als u het protocol wilt starten, telt u de cellen met de celteller.

Plaat de cellen in een 96 put plaat. De volgende dag, bereiden een set van transfectie mengsels om de cellen transfect in verschillende uiteindelijke concentraties van microRNA controle na te bootsen, en microRNA-107 na te bootsen. Uit een voorraad van 25 micromolar microRNA controle na te bootsen, of microRNA-107 na te bootsen, verdunnen en toe te voegen controle na te bootsen of microRNA-107 na te bootsen in de verminderde serum media samen met de transfectie reagentia in microcentrifuge buizen.

Meng de oligo-bevattende mengsels voorzichtig met behulp van een micropipet. Na een incubatie van 10 minuten in de celkweekkap, meng voorzichtig de oligo-bevattende mengsels opnieuw, en voeg dan 50 microliters van de mengsels in elke put toe. Bewaar de doorfecteerde cellen in een celkweek incubator.

Zorgvuldig aspirate de cel cultuur media in elke put van de plaat en onmiddellijk vullen 100 microliters van 10% trichloorazijnzuur, of TCA, in elke put. Houd de plaat met 10% TCA op vier graden Celsius gedurende een uur. Was vervolgens de plaat meerdere malen door het onder te dompelen in een bad met kraanwater.

Verwijder overtollig water uit de binnenkant van de putten door op de plaat te tikken totdat er geen water meer over is en droog de plaat. Pipette 50 microliters van 0,4%SRB oplossing in elke put inclusief de lege putten. Schud de plaat voorzichtig totdat de 0,4%SRB-oplossing de onderkant van de putten gelijkmatig bedekt.

Vervolgens, incubeer de plaat voor 40 tot 60 minuten. Na incubatie, was de plaat met 1%azijnzuur totdat de ongebonden kleurstof volledig is weggespoeld. Pipette 100 microliters van 10 millimolar Tris basisoplossing in de overeenkomstige putten, inclusief lege putten.

Houd de plaat 10 minuten op een shaker. Meet de absorptie op 492 nanometer. Bereken het percentage van de gemiddelde absorptie en de standaarddeviatie van elke groep met behulp van absorptiewaarden van de SRB-test.

Importeer de ruwe gegevens, waaronder behandelingsconcentraties, gemiddelde absorptie en standaarddeviatie in de software door de gegevens verticaal uit te lijnen. Klik op het tabblad Grafiek maken en kies de foutbalken Eenvoudige spreiding. Selecteer werkbladkolommen als symboolwaarden en klik op volgende.

Selecteer X-Y-paren in het deelvenster Gegevensindeling en klik vervolgens op Volgende. Selecteer overeenkomstige gegevenskolommen in het deelvenster Gegevens selecteren. Klik op voltooien om de plot te maken.

Dubbelklik op de X-as om het type schaal in de schaling van de as te wijzigen. Wijzig het type schaal van lineair naar logboek. Wijzig het begin- en eindbereiknummer naar respectievelijk 0,01 en 200.

Klik met de rechtermuisknop op een spreidingsplot, kies Curve Fit en ga naar de subcategorie Gebruiker gedefinieerd. Selecteer de curve voor dosisrespons. Klik op de volgende knoppen en klik vervolgens op voltooien.

Ga naar het tabblad rapport en controleer de waarden n, k en R. Voer de PCR uit zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Ga vervolgens over op dubbele spijsvertering door het combineren van de reactie mengsels, met inbegrip van de beperking enzymen Exo1 en Not1 een in een buis.

Incubeer de mengsels gedurende drie tot vier uur in een 37 graden Celsius waterbad. Voer de dubbel verteerde producten uit op een 1%agarose gel. Snijd vervolgens de banden onder UV-licht.

Zuiver de dubbel verteerde PCR-producten en luciferase vectoren uit de uitgesneden banden. Ga verder met ligatie van de PCR-producten in de luciferase vectoren door 20 microliters ligatiereactiemengsels te bereiden, waaronder de DNA-ligase. Vercentrifugeren de buis kort gedurende 10 tot 15 seconden.

Incubeer de ligatie op 16 graden Celsius 's nachts met behulp van een thermische cycler. De volgende dag, voer transformatie uit door de ligatiemengsels in de buis toe te voegen die bekwame cellen bevat. Tik voorzichtig op de buis en houd hem 20 minuten op ijs.

Breng de buis snel en voorzichtig gedurende 30 seconden tot één minuut over naar een warmteblok bij 42 graden Celsius. Na een hitteshock zet u de buis 20 minuten op ijs. Verspreid competente cellen op een LB agar plaat.

Kweek competente cellen in een couveuse bij 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, kies een individuele kolonie en resuspend E.coli in een van de 8-strip buizen met ultrazuiver water, en herhaal deze stap naar E.coli resuspend van vier tot acht willekeurig geselecteerde kolonies. Breng 25 microliter E.coli suspensie over in een andere set 8-stripbuizen.

Voer de kolonie PCR uit met de E.coli-suspensie. Bereid de luciferase test in een 24 put plaat. Voeg een tot twee keer tien aan de vier cellen in een 500 microliter cel cultuur media voor elke put.

Na nachtelijke incubatie, transfect 50 nanogram luciferase vectoren in de cellen met controle na te bootsen of een specifieke microRNA na te bootsen met behulp van een transfectie reagens. De volgende dag, was de binnenkant van de putten twee keer met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing. Breng 200 microliter lysisreagens aan in de putten en voer voldoende cellyse uit voordat u de luciferaseactiviteit meet.

Houd de plaat minstens 15 minuten schudden. Breng vijf tot 10 microliter cellysaat over in de nieuwe buis, voeg 100 microliter reagens toe en meng de oplossing onmiddellijk door pipetting. Lees dan de vuurvlieg luciferase activiteit met behulp van illuminometer voor 10 tot 15 seconden.

Voeg 100 microliter reagens twee in dezelfde buis en meng door twee keer te pipetten. Tot slot, lees de renilla luciferase activiteit gedurende 10 tot 15 seconden met behulp van illuminometer. RTPCR toont een aanzienlijke vermindering van microRNA-107 en PANC-1 en CAPAN-1 cellen in vergelijking met HPNE cellen.

De niveaus van microRNA-301 werden aanzienlijk opgevuld in PANC-1 en CAPAN-1 cellen, vergeleken met HPNE cellen. De SRB-test in deze studie toont duidelijk aan dat de proliferatie van PANC-1 cellen afnam na een microRNA-107 transfectie nabootsen. De screening van 11 potentiële voorspelde doelen van microRNA-107 toont duidelijk aan dat alleen synuclein gamma, of SNCG, een positieve regulator van tumorcelgroei direct interageert met microRNA-107 en PANC-1 cellen, wat aangeeft dat microRNA-107 de proliferatie van PANC-1-cellen negatief kan reguleren door de SNCG-expressie te moduleren.

Volwassen celproliferatietesten die de op tetra hydroleum gebaseerde entiteit en CFSE gebruiken, zijn van toepassing om het effect van dergelijke microRNA-nabootsingen te screenen, afhankelijk van de celtypen. Op basis van de experimenteel gevalideerde functie van microRNAs is een systematische beoordeling van database- en doelvoorspellingsprogramma's nodig om de lijst van kandidaat-doelen te beperken voordat luciferase-tests worden getest. Voor de evaluatie van de combinatie-efficiëntie van microRNAs met geneesmiddelen tegen kanker, is het voordelig om aangepaste IC-waarden te berekenen op basis van ons protocol voor de beoordeling van de combinatie-index.