Name: Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een reproduceerbaar protocol voor het identificeren en valideren van microRNA-doelwitten in kankercellen. Deze methode omvat transfectie, SRB-proliferatie-assay, real-time PCR en luciferase-reporterassay.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door het basisprogramma voor wetenschappelijk onderzoek via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2017R1D1A3B03035662); en Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

<ol><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs-103%2F107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li>
<li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%2C+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li>
<li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+miR-155%2FFOXO3a+and+miR-222%2FPTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li>
<li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+miR-107%2C+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+%28pHGGs%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li>
<li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunting+of+targets%3A+challenge+in+miRNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis%3A+not+all+kits+are+created+equal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents%2C+5-Aza-CdR+and+FK228%2C+in+Human+Gastric+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li>
<li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li>
<li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47(2015).</li>
<li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202(2010).</li>
<li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+me+count+the+ways%3A+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li>
<li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li>
<li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li>
<li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li>
<li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+%28SRB%29+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li>
<li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li>
<li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li>
<li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li>
<li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Strategieën voor de bepaling van bonafide miRNA-doelen met de functies van een miRNA van belang zijn onmisbaar voor het begrijpen van meerdere rollen van miRNAs. Identificatie van de doel genen van miRNA kan een leid waarde zijn voor het interpreteren van de cel signalering van gebeurtenissen die door miRNAs in een cel worden gemoduleerd. Een ontveiling van functioneel belangrijke doel genen van miRNAs kan de fundamentele kennis bieden om een op miRNA gebaseerde therapie in kanker te ontwikkelen.
<p class="jove_conte...

MicroRNAs (miRNAs) zijn de kleine regelgevende Rna's die voornamelijk het proces van vertaling en afbraak van boodschapper Rna's (Mrna's) moduleren door te reageren op de 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) in bonafide doel genen1. De expressie van miRNAs kan worden gereguleerd door transcriptionele en post-transcriptionele mechanismen. De onevenwichtigheid van dergelijke regelgevende mechanismen brengt ongecontroleerde en onderscheidende miRNAs-uitdrukkings niveaus in tal van ziekten, waaronder kanker2. Eén enkele miRNA kan meerdere interacties met diverse Mrna's hebben. Dienovereenkomstig kan een individuele mRNA worden bestuurd door verschillende Mirna's. Daarom, intracellulaire signalering netwerken worden ingewikkeld beïnvloed door duidelijk uitgedrukt miRNAs waardoor fysiologische aandoeningen en ziekten kunnen worden geïnitieerd en verslechterd2,3,4, 5 , 6. Hoewel de veranderde expressie van miRNAs is waargenomen in verschillende soorten kankers, zijn de moleculaire mechanismen die de manieren van kankercellen in combinatie met miRNAs moduleren nog steeds grotendeels onbekend.
Accumulerend bewijsmateriaal toont aan dat de oncogene of tumor suppressieve rollen van miRNAs afhangen van de soorten kanker. Door bijvoorbeeld te richten op Forkhead Box O3 (FOXO3) bevordert miR-155 de celproliferatie, metastase en chemoresistance van colorectale kanker7,8. Daarentegen wordt de beperking van glioom celinvasie geïnduceerd door miR-107 via de regulatie van neurogene Locus notch homo Protein 2 (NOTCH2) expressie9. De beoordeling van miRNA-target interacties in verband met miRNA-functies is een onmisbaar onderdeel om beter te begrijpen hoe miRNAs verschillende biologische processen regelt in zowel gezonde als zieke Staten10. Bovendien kan de ontdekking van het bonafide doelwit (en) van miRNAs verder een nauwkeurig afgestemde strategie bieden voor een op miRNA gebaseerde therapie met verschillende anti-kankergeneesmiddelen. De belangrijkste uitdaging op het gebied van miRNAs is echter de identificatie van directe targets van miRNAs. Hier worden gedetailleerde methoden gepresenteerd als reproduceerbare experimentele benaderingen voor de doelbepaling van het miRNA-doelwit. Succesvol experimenteel ontwerp voor de doel identificatie miRNA omvat verschillende stappen en overwegingen (Figuur 1). Vergelijking van volwassen miRNA-niveaus in tumorcellen en normale cellen kan een van de gebruikelijke procedures zijn om een miRNA van belang te selecteren (Figuur 1a). De functionele studie van een geselecteerde miRNA om de effecten van een miRNA op celproliferatie op te sporen is belangrijk om de lijst van de beste potentiële kandidaatdoelen van een miRNA van belang te verfijnen (Figuur 1b). Op basis van de experimenteel gevalideerde functies van miRNAs is een systematische beoordeling van literatuur en database in bedrijf met een miRNA target Voorspellings programma vereist om de meest relevante informatie over genfuncties te doorzoeken (figuur 1c). De identificatie van reële doel genen van een Mirna van belang kan worden bereikt door het uitvoeren van experimenten zoals de plaats-assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen, real-time PCR en Western blotting (figuur 1d). Het doel van het huidige protocol is om uitgebreide methoden te bieden voor belangrijke experimenten, de op sonde gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay na een nabootsen van de miRNA-transactie, het genereren van dosis-responscurve, en plaats assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen. Het huidige protocol kan nuttig zijn voor een beter begrip van de functies van individuele miRNAs en de implicatie van een miRNA bij kankertherapie.

<table><tbody><tr><td>15 mL conische buis</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>24-wells plaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische buis</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>6-wells plaat</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA loading dye</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>RD006</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>8-cap strip</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010535</td><td>Voor cDNA synthese</td></tr><tr><td>8-buisjes strip</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010580</td><td>Voor cDNA synthese</td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>A6283-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Agarose A</td><td>Bio Basic</td><td>D0012</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Alkaline fosfatase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Bio basic Canada Inc</td><td>AB0028</td><td>25 g</td></tr><tr><td>AriaMx 96 buisjes strips</td><td>Agilent Technologies</td><td>401493</td><td>Voor real time PCR</td></tr><tr><td>AriaMx real-time PCR systeem</td><td>Agilent Technologies</td><td>G8830A</td><td>qPCR versterking, detectie en gegevensanalyse</td></tr><tr><td>AsiSI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0630</td><td>10.000 units/mL</td></tr><tr><td>CAPAN-1 cellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-79</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur kap</td><td>Labtech</td><td></td><td>Model: LCB-1203B-A2</td></tr><tr><td>Tellingkamers met V-streep</td><td>Paul Marienfeld</td><td>650010</td><td>Celteller</td></tr><tr><td>CutSmart buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>10X concentratie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DNA gel extractie kit</td><td>Bionics</td><td>DN30200</td><td>200 voorbereidingen</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>NIPPON Genetics EUROPE</td><td>MWD1</td><td>1 Kb ladder</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>100 eenheden</td></tr><tr><td>Dual-luciferase reporter assay systeem</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>100 tests</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HIT competente cellen</td><td>Real Biotech Corporation(RBC)</td><td>RH617</td><td>Competente cellen</td></tr><tr><td>HPNE cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-4023</td><td></td></tr><tr><td>LB agar bouillon</td><td>Bio Basic</td><td>SD7003</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>0,75 mL</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td>0,75 mL</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td></td><td>Model: E5311</td></tr><tr><td>Microcentrifuge buisje</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Microplaat reader</td><td>TECAN</td><td></td><td>Infinite F50</td></tr><tr><td>miRNA controle mimic</td><td>Ambion</td><td>4464058</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>miRNA-107 mimic</td><td>Ambion</td><td>4464066</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>50 voorbereidingen</td></tr><tr><td>Mupid-2plus (elektroforese systeem)</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>Model: AD110</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td>20.000 units/mL</td></tr><tr><td>Oligo explorer programma</td><td>GeneLink</td><td></td><td>Voor primer ontwerp</td></tr><tr><td>Optische buisjes strip caps (8x Strip)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td>Voor real time PCR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>500 Ml</td></tr><tr><td>PANC-1 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing</td><td>Gibco</td><td>14040117</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>Plasmid DNA miniprep S&amp; V kit</td><td>Bionics</td><td>DN10200</td><td>200 voorbereidingen</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA polymerase</td><td>TaKaRa</td><td>R050A</td><td>250 eenheden</td></tr><tr><td>Schudler</td><td>TECAN</td><td></td><td>Schudplatform</td></tr><tr><td>Schudbroodbak</td><td>Labtech</td><td></td><td>Model: LSI-3016A</td></tr><tr><td>Sigmaplot 14 software</td><td>Systat Software Inc</td><td></td><td>Voor het genereren van dosis-responscurves</td></tr><tr><td>Sulforodamine B poeder</td><td>Sigma</td><td>S1402-5G</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SYBR groen master mix</td><td>Smobio</td><td>TQ12001805401-3</td><td>Binding fluorescerende kleurstof voor dsDNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td>25.000 U</td></tr><tr><td>TaqMan master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>200 reacties, geen AmpErase UNG</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>TaqMan miR RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>1.000 reacties</td></tr><tr><td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>37 &deg;C en 5% CO2 incubatie</td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T4661-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Ultrapuur water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Veriti 96 wells thermische cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Voor versterking van DNA (of cDNA)</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>20.000 units/mL</td></tr></tbody></table>

een in vitro protocol voor het evalueren van microrna-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine regelgevende Rna's die worden erkend voor het moduleren van talrijke intracellulaire signalering trajecten in verschillende ziekten, waaronder kankers. Deze kleine regelgevende Rna's communiceren voornamelijk met de 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) van hun doel Messenger RNAs (Mrna's), wat uiteindelijk resulteert in de remming van decoderings processen van Mrna's en de augmentatie van doel mRNA-degraderingen. Op basis van de uitdrukkings niveaus en intracellulaire functies zijn miRNAs in staat om te dienen als regelgevende factoren van oncogene en tumor suppressieve Mrna's. Identificatie van bonafide doel genen van een miRNA tussen honderden of zelfs duizenden computationeel voorspelde doelen is een cruciale stap om de rollen en elementaire moleculaire mechanismen van een miRNA van belang te onderscheiden. Verschillende miRNA target Voorspellings Programma's zijn beschikbaar om te zoeken naar mogelijke interacties van miRNA-mRNA. De meest uitdagende vraag is echter hoe je directe doel genen van een miRNA van belang moet valideren. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare strategie van belangrijke methoden om miRNA-doelen te identificeren die verband houden met de functie van een miRNA. Dit protocol presenteert een praktische gids over stapsgewijze procedures om miRNA-niveaus,-functies en gerelateerde doel-Mrna's te achterhalen met behulp van de sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), sulforhodamine B (SRB)-assay na een miRNA-nabootsen transfectie , dosis-responscurve generatie, en plaats assay samen met het klonen van 3 ' UTR van een gen, die nodig is voor een goed begrip van de rollen van individuele miRNAs.

Een geslaagde en nauwkeurige bevestiging van miRNA-niveaus is belangrijk voor de interpretatie van gegevens waarmee de classificatie van miRNAs mogelijk is op basis van de verwachte rollen van miRNAs in de ontwikkeling en progressie van een ziekte. De niveaus van miRNA-107 en miRNA-301 werden gemeten in drie pancreas cellijnen met behulp van de op sonde gebaseerde kwantitatieve PCR. De synthese van Cdna's van zowel een specifieke miRNA als een referentie-gen in dezelfde reactie kan de reproduceerbaarheid van gegevens ver...

Dit protocol maakt gebruik van een sonde-gebaseerde real-time polymerase kettingreactie (PCR), een sulforhodamine B (SRB) Assay, 3 ' onvertaalde gebieden (3 ' UTR) klonen, en een plaats assay om de doel genen van een Mirna van belang te controleren en om de functies van miRNAs te begrijpen.

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Om toegang te krijgen tot neurale microRNA doelinteracties met MicroRNA-functies is van cruciaal belang om te begrijpen hoe MicroRNAs verschillende biologische processen reguleren in zowel gezonde als zieke toestanden. Dit protocol beschrijft de reproduceren door middel van strategie om microRNA doelen en de functionele microRNAs te identificeren als de validatie van directe doelstelling van microRNAs is een uitdaging. Ons protocol kan inzicht geven in de functie van individuele microRNAs en de implicatie van een microRNA in kankertherapie.Berekening van de half-maximale remmende concentratie is een belangrijke methode, niet alleen voor microRNA-studies, maar voor de effectieve evaluatie van andere anti-kankermedicijnen. Ons protocol zal nuttig zijn voor nieuwe onderzoekers, omdat we de fundamentele methode beschreven om het niveau van microRNAs in een cel te begrijpen. Als u het protocol wilt starten, telt u de cellen met de celteller.Plaat de cellen in een 96 put plaat. De volgende dag, bereiden een set van transfectie mengsels om de cellen transfect in verschillende uiteindelijke concentraties van microRNA controle na te bootsen, en microRNA-107 na te bootsen. Uit een voorraad van 25 micromolar microRNA controle na te bootsen, of microRNA-107 na te bootsen, verdunnen en toe te voegen controle na te bootsen of microRNA-107 na te bootsen in de verminderde serum media samen met de transfectie reagentia in microcentrifuge buizen.Meng de oligo-bevattende mengsels voorzichtig met behulp van een micropipet. Na een incubatie van 10 minuten in de celkweekkap, meng voorzichtig de oligo-bevattende mengsels opnieuw, en voeg dan 50 microliters van de mengsels in elke put toe. Bewaar de doorfecteerde cellen in een celkweek incubator.Zorgvuldig aspirate de cel cultuur media in elke put van de plaat en onmiddellijk vullen 100 microliters van 10% trichloorazijnzuur, of TCA, in elke put. Houd de plaat met 10% TCA op vier graden Celsius gedurende een uur. Was vervolgens de plaat meerdere malen door het onder te dompelen in een bad met kraanwater.Verwijder overtollig water uit de binnenkant van de putten door op de plaat te tikken totdat er geen water meer over is en droog de plaat. Pipette 50 microliters van 0,4%SRB oplossing in elke put inclusief de lege putten. Schud de plaat voorzichtig totdat de 0,4%SRB-oplossing de onderkant van de putten gelijkmatig bedekt.Vervolgens, incubeer de plaat voor 40 tot 60 minuten. Na incubatie, was de plaat met 1%azijnzuur totdat de ongebonden kleurstof volledig is weggespoeld. Pipette 100 microliters van 10 millimolar Tris basisoplossing in de overeenkomstige putten, inclusief lege putten.Houd de plaat 10 minuten op een shaker. Meet de absorptie op 492 nanometer. Bereken het percentage van de gemiddelde absorptie en de standaarddeviatie van elke groep met behulp van absorptiewaarden van de SRB-test.Importeer de ruwe gegevens, waaronder behandelingsconcentraties, gemiddelde absorptie en standaarddeviatie in de software door de gegevens verticaal uit te lijnen. Klik op het tabblad Grafiek maken en kies de foutbalken Eenvoudige spreiding. Selecteer werkbladkolommen als symboolwaarden en klik op volgende.Selecteer X-Y-paren in het deelvenster Gegevensindeling en klik vervolgens op Volgende. Selecteer overeenkomstige gegevenskolommen in het deelvenster Gegevens selecteren. Klik op voltooien om de plot te maken.Dubbelklik op de X-as om het type schaal in de schaling van de as te wijzigen. Wijzig het type schaal van lineair naar logboek. Wijzig het begin- en eindbereiknummer naar respectievelijk 0,01 en 200.Klik met de rechtermuisknop op een spreidingsplot, kies Curve Fit en ga naar de subcategorie Gebruiker gedefinieerd. Selecteer de curve voor dosisrespons. Klik op de volgende knoppen en klik vervolgens op voltooien.Ga naar het tabblad rapport en controleer de waarden n, k en R. Voer de PCR uit zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Ga vervolgens over op dubbele spijsvertering door het combineren van de reactie mengsels, met inbegrip van de beperking enzymen Exo1 en Not1 een in een buis.Incubeer de mengsels gedurende drie tot vier uur in een 37 graden Celsius waterbad. Voer de dubbel verteerde producten uit op een 1%agarose gel. Snijd vervolgens de banden onder UV-licht.Zuiver de dubbel verteerde PCR-producten en luciferase vectoren uit de uitgesneden banden. Ga verder met ligatie van de PCR-producten in de luciferase vectoren door 20 microliters ligatiereactiemengsels te bereiden, waaronder de DNA-ligase. Vercentrifugeren de buis kort gedurende 10 tot 15 seconden.Incubeer de ligatie op 16 graden Celsius 's nachts met behulp van een thermische cycler. De volgende dag, voer transformatie uit door de ligatiemengsels in de buis toe te voegen die bekwame cellen bevat. Tik voorzichtig op de buis en houd hem 20 minuten op ijs.Breng de buis snel en voorzichtig gedurende 30 seconden tot één minuut over naar een warmteblok bij 42 graden Celsius. Na een hitteshock zet u de buis 20 minuten op ijs. Verspreid competente cellen op een LB agar plaat.Kweek competente cellen in een couveuse bij 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, kies een individuele kolonie en resuspend E.coli in een van de 8-strip buizen met ultrazuiver water, en herhaal deze stap naar E.coli resuspend van vier tot acht willekeurig geselecteerde kolonies. Breng 25 microliter E.coli suspensie over in een andere set 8-stripbuizen.Voer de kolonie PCR uit met de E.coli-suspensie. Bereid de luciferase test in een 24 put plaat. Voeg een tot twee keer tien aan de vier cellen in een 500 microliter cel cultuur media voor elke put.Na nachtelijke incubatie, transfect 50 nanogram luciferase vectoren in de cellen met controle na te bootsen of een specifieke microRNA na te bootsen met behulp van een transfectie reagens. De volgende dag, was de binnenkant van de putten twee keer met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing. Breng 200 microliter lysisreagens aan in de putten en voer voldoende cellyse uit voordat u de luciferaseactiviteit meet.Houd de plaat minstens 15 minuten schudden. Breng vijf tot 10 microliter cellysaat over in de nieuwe buis, voeg 100 microliter reagens toe en meng de oplossing onmiddellijk door pipetting. Lees dan de vuurvlieg luciferase activiteit met behulp van illuminometer voor 10 tot 15 seconden.Voeg 100 microliter reagens twee in dezelfde buis en meng door twee keer te pipetten. Tot slot, lees de renilla luciferase activiteit gedurende 10 tot 15 seconden met behulp van illuminometer. RTPCR toont een aanzienlijke vermindering van microRNA-107 en PANC-1 en CAPAN-1 cellen in vergelijking met HPNE cellen.De niveaus van microRNA-301 werden aanzienlijk opgevuld in PANC-1 en CAPAN-1 cellen, vergeleken met HPNE cellen. De SRB-test in deze studie toont duidelijk aan dat de proliferatie van PANC-1 cellen afnam na een microRNA-107 transfectie nabootsen. De screening van 11 potentiële voorspelde doelen van microRNA-107 toont duidelijk aan dat alleen synuclein gamma, of SNCG, een positieve regulator van tumorcelgroei direct interageert met microRNA-107 en PANC-1 cellen, wat aangeeft dat microRNA-107 de proliferatie van PANC-1-cellen negatief kan reguleren door de SNCG-expressie te moduleren.Volwassen celproliferatietesten die de op tetra hydroleum gebaseerde entiteit en CFSE gebruiken, zijn van toepassing om het effect van dergelijke microRNA-nabootsingen te screenen, afhankelijk van de celtypen. Op basis van de experimenteel gevalideerde functie van microRNAs is een systematische beoordeling van database- en doelvoorspellingsprogramma's nodig om de lijst van kandidaat-doelen te beperken voordat luciferase-tests worden getest. Voor de evaluatie van de combinatie-efficiëntie van microRNAs met geneesmiddelen tegen kanker, is het voordelig om aangepaste IC-waarden te berekenen op basis van ons protocol voor de beoordeling van de combinatie-index.

an-vitro-protocol-for-evaluating-microrna-levels-functions-associated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

This video demonstrates the in vivo delivery of miRNA inhibitors as therapeutic agents against tumor growth in orthotopic mouse models. The intratumoral administration of synthetic miRNA inhibitors or antagomiRs allows them to bind and inhibit endogenous miRNAs, thereby causing mRNA upregulation and suppression of tumor growth.

Modelling Intratumoral Treatment with miRNA Inhibitors: A Method to Analyze the Effect of miRNA Inhibitors on Tumor Growth in Murine Model

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Hier presenteren we een protocol om miRNA-expressie in monsters van borstkankerpatiënten te detecteren met behulp van miRNA in situ hybridisatie.

Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridisatie

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Presenteren we een protocol om te evalueren van de expressie niveaus van circulerende microRNA (miRNAs) in plasma monsters van kankerpatiënten. In het bijzonder, hebben we gebruikt een verkrijgbare kit voor circulerende miRNA extractie en omgekeerde transcriptie. Ten slotte, geanalyseerd wij een panel van 24 geselecteerde miRNAs met behulp van real-time vooraf gevlekte sonde aangepaste platen.

Detectie van een circulerende MicroRNA Custom Panel bij patiënten met uitgezaaide darmkanker

Dit protocol beschrijft xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen van menselijke schildklier tumorvorming als een platform voor het testen van microRNA-gebaseerde remmer behandelingen. Deze aanpak is ideaal voor het bestuderen van de functie van niet-coderende Rna's en hun potentieel als nieuwe therapeutische doelen.

In vivo remming van MicroRNA te verminderen tumor groei bij muizen

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer een reproduceerbaar protocol voor het identificeren en valideren van microRNA-doelwitten in kankercellen. Deze methode omvat transfectie, SRB-proliferatie-assay, real-time PCR en luciferase-reporterassay.

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

Meer video's verkennen