Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella
13 mei 2019
Deze moleculair gebaseerde aanpak voor het bepalen van bacteriële fitness vergemakkelijkt nauwkeurige en nauwkeurige detectie van micro-organismen met behulp van unieke genomische DNA-barcodes die worden gekwantificeerd via digitale PCR. Het protocol beschrijft de berekening van de concurrerende index voor salmonella stammen; de technologie is echter gemakkelijk aan te passen aan protocollen die absolute kwantificering van enig genetisch-smeedbaar organisme vereisen.
Deze techniek maakt nauwkeurige en nauwkeurige kwantificering van micro-organismen uit een gemengde populatie van zeer vergelijkbare stammen met behulp van snelle en hoge doorvoer moleculaire technieken. Uiteindelijk, in het mogelijk maken van vergelijkingen van fitness worden gemaakt tussen stammen. De mogelijkheid om tegelijkertijd veel stammen in één zwembad te beoordelen vermindert de goed-tot-welzijn of de variabiliteit van organismen aanzienlijk omdat alle stammen aan precies dezelfde omstandigheden worden blootgesteld.
Het aanpassingsvermogen van deze techniek maakt het mogelijk om te worden gebruikt voor bijna elk genetisch kneedbaar organisme en bijna elk experimenteel ontwerp dat nauwkeurige kwantificering van microben vereist. Begin deze procedure met de techniek van genetische markers op bacteriële chromosomen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak een pool van genomisch DNA dat elke barcode bevat, behalve één.
Gebruik deze pool als verdunningswater om een verdunningsreeks uit te voeren met genomisch DNA met de enkele resterende barcode. Bereid reacties voor digitale PCR in tweevoud volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor het gebruik van een digitale PCR supermix ontworpen voor sonde-gebaseerde chemie. Gebruik het gepoolde genomische DNA als sjabloon-DNA.
Voeg ook de 20 X primer probe Master Mix toe zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid repliceren controlereacties voor digitale PCR volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De controlereacties voor elke sondemix mogen bestaan uit geen sjabloonbesturingselementen, negatieve besturingselementen en positieve besturingselementen.
Herhaal deze stappen om digitale PCR-reacties te maken voor elk genomisch DNA-monster met streepjescodes. Genereer druppels voor elke reactievoorwaarde met behulp van een druppelgenerator, volgens de instructies van de fabrikant. Breng nieuw gemaakte druppels in de juiste 96 putplaat.
Gebruik 200 microliter pipet tips op een 5 tot 50 microliter multi-channeled pipet. Nadat alle druppels zijn gegenereerd en overgebracht, verzegelt u de plaat met een folieplaatafdichter. Gebruik de fabrikant aanbevolen thermische cycler om de fietsomstandigheden uit te voeren.
Terwijl thermocycling wordt uitgevoerd, programmeert u de gegevensanalysesoftware met de plaatopzetinformatie, zoals voorbeeldnaam, experimenttype en Supermix gebruikt. Ook target 1 naam en Doel 1 type, evenals Target 2 naam en Target 2 type. Nadat thermocycling is voltooid, breng de voltooide reacties naar de druppellezer en start het leesproces, volgens de instructies van de fabrikant.
Wanneer alle putten zijn gelezen en de run is voltooid, opent u het QLP-gegevensbestand met behulp van de software voor gegevensanalyse. Selecteer alle putten die gebruik maken van dezelfde primer probe Mastermix. Bekijk op het tabblad Druppels het aantal druppels dat in elke put wordt geanalyseerd, inclusief zowel positieve als negatieve druppels.
Sluit elke put die minder dan 10.000 totale druppels is, uit van een analyse. Ga naar het tabblad 1D Amplitude en onderzoek de amplitudes van positieve en negatieve druppels. Zorg ervoor dat ze bestaan uit 2 verschillende populaties.
Binnen de software, gebruik maken van de thresholding functie om een cutoff tussen positieve en negatieve druppels voor elke sonde die werd gebruikt. Zodra de juiste drempels op alle putten zijn toegepast, berekent de software het aantal DNA-kopieën in elke reactie. Gegevens exporteren naar een spreadsheet om verdere analyse te vergemakkelijken.
Bereken met deze waarden het oorspronkelijke exemplaarnummer van elke unieke genomische streepjescode in het monster. Bepaal het gemiddelde vals-positieve percentage van de negatieve controlereacties en trek deze waarde af van de waarden die in experimentele reacties worden verkregen. Vermenigvuldig de waarden indien nodig, op basis van de verdunningen die zijn uitgevoerd bij het instellen van elk experiment.
Bepaal nu de relatieve geschiktheid van een organisme door de concurrerende index te berekenen of de concurrerende index uit digitale PCR-gebaseerde kwantificering van de barcodestam te berekenen. Voer deze stap uit voor elke barcodespanning op alle tijdstippen. Genomic DNA met de AA barcode werd verdund in een achtergrond van alle andere barcoded genomic DNA.
Kanaal 1 vertegenwoordigt de FAM-sonde voor de AA-streepjescode, terwijl Kanaal 2 de HEX-sonde voor de AO-streepjescode vertegenwoordigt. De resultaten van elke sonde worden gepresenteerd als zowel individuele druppel fluorescerende amplitude als een histogram dat de frequentie van fluorescerende intensiteit van alle druppels in de geselecteerde putten vertegenwoordigt. Voor elke aandoening moeten positieve en negatieve druppels 2 verschillende populaties vormen.
De populaties moeten worden gescheiden met behulp van de drempelwaarden functie om positieve en negatieve druppels te definiëren. Drempelwaarden variëren afhankelijk van de sondes die werden gebruikt, maar alle putten die dezelfde sondemix gebruiken, moeten identieke drempels hebben. In het geval van AA dat werd verdund, lijkt het histogram alleen de enkele populatie weer te geven omdat positieve druppels aanzienlijk in de minderheid zijn door negatieve druppels.
Echter, 2 verschillende populaties zijn nog steeds zichtbaar door het onderzoeken van druppel fluorescerende amplitude in de linker panelen. Aangezien het AA barcoded genomic DNA werd verdund, was er een daling van positieve druppels, terwijl het aantal positieve AO druppels constant blijft. Zodra de juiste drempels zijn toegepast op alle putten zal de software het aantal DNA-kopieën in elke reactie berekenen.
Als u regelmatig PCR uitvoert als onderdeel van uw onderzoek, u deze techniek uitvoeren om de geschiktheid van uw modelorganisme te beoordelen. Deze procedure zou normaal gesproken worden gebruikt om eindresultaten van upstream-experimenten te bepalen. Het ware nut is het bevorderen van gemak en veelzijdigheid voor alle experimenten die afhankelijk zijn van bacteriële kwantificering.
We gebruiken deze techniek om salmonella fitness te beoordelen in een murine model van infectie. Bovendien wordt deze techniek aangepast voor gebruik met andere pathogene micro-organismen in ons laboratorium.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze moleculaire benadering maakt een nauwkeurige kwantificering van micro-organismen uit gemengde populaties van vergelijkbare stammen mogelijk met behulp van genomische DNA-barcodes. Het protocol faciliteert vergelijkingen van de fitness tussen stammen en is aanpasbaar voor diverse genetisch manipuleerbare organismen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Moleculaire biologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Kwantificering van micro-organismen is essentieel voor het begrijpen van de competitieve fitheid.
- Traditionele methoden kunnen variabiliteit tussen stammen introduceren.
- Digitale PCR biedt een high-throughput oplossing voor nauwkeurige metingen.
- Genomische DNA-barcoding maakt unieke identificatie van stammen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor de nauwkeurige kwantificering van bacteriële fitness.
- Om de variabiliteit in experimentele condities tussen verschillende stammen te verminderen.
- Om een flexibel protocol te bieden dat toepasbaar is op diverse experimentele ontwerpen.
Gebruikte Methoden
- Het technisch invoegen van genetische markers in bacteriële chromosomen.
- Het creëren van een pool van genomisch DNA met unieke barcodes.
- Het gebruik van digitale PCR voor de kwantificering van micro-organismen.
- Het beoordelen van competitieve indices tussen verschillende Salmonella-stammen.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een nauwkeurige kwantificering van micro-organismen bereikt.
- Er werd een verminderde variabiliteit waargenomen bij fitness-vergelijkingen.
- De methode bleek aanpasbaar voor diverse genetisch kneedbare organismen.
- High-throughput mogelijkheden werden aangetoond.
Conclusies
- Deze techniek verhoogt de nauwkeurigheid van de microbiële kwantificering.
- Het maakt betekenisvolle vergelijkingen van de fitness tussen stammen mogelijk.
- Het protocol is veelzijdig inzetbaar voor verschillende experimentele behoeften.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze op digitale PCR gebaseerde methode voor de competitieve index pakt een belangrijk knelpunt in de beoordeling van de bacteriële fitness aan door hoogdoorvoerende, simultane kwantificering van meerdere stammen in één enkele competitieve assay mogelijk te maken. Door variabiliteit tussen wells te verminderen en de afhankelijkheid van fenotypische markers te elimineren, vergroot deze benadering het voorspellend vertrouwen in workflows voor targetvalidatie en leadidentificatie. De aanpasbaarheid aan genetisch kneedbare organismen ondersteunt de translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische risicoreductie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door fitnessverschillen tussen wildtype- en mutantstammen onder identieke omstandigheden te kwantificeren.
- Operationele waarde: Vermindert experimentele variabiliteit door stammen te poolen, waardoor verschillen tussen wells en tussen organismen worden geminimaliseerd.
- Voorspellende waarde: Maakt gevoelige detectie mogelijk van zowel varianten met een hoge als een lage fitness, wat bijdraagt aan een nauwkeurige prioritering van stammen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, barcode-specifieke uitslagen die een nauwkeurige vergelijking van de microbiële abundantie onder verschillende condities mogelijk maken.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van digitale PCR om absolute kwantificering te leveren met een hoge gevoeligheid en precisie over een breed dynamisch bereik.
- Klaarheid voor assay: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde, gebarcodeerde stammenpools voor reproduceerbare high-throughput fitness-screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt extrapolatie van in vitro competitie naar in vivo modellen, zoals aangetoond in murine Salmonella-infectiestudies.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt fitnessbeoordeling in complexe biologische contexten mogelijk, waardoor onzekerheid in studies naar virulentie en pathogenese wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Gemakkelijk aanpasbaar aan andere pathogenen en experimentele opzetten waarbij absolute microbiële kwantificering vereist is.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinische fase, waardoor fitnessbeoordeling mogelijk is na strain engineering en vóór lead-optimalisatie, in het bijzonder bij de validatie van antimicrobiële targets en virulentietargets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door de competitieve fitness van isogene stammen in gecontroleerde omgevingen te meten.
- Screening: Maakt gemultiplexte fitness-profilering van stammenbibliotheken mogelijk via barcode-gebaseerde kwantificering.
- Analytics: Genereert absolute DNA-kopiegetallen die worden gebruikt voor berekeningen van de competitieve index voor fitness-rangschikking.
- Translational Research: Verbindt in vitro fitnessgegevens met in vivo pathogenese-modellen, zoals aangetoond in toepassingen voor murine infecties.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar genomisch barcodingsplatform dat toepasbaar is op meerdere bacteriële targets en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in fitnessmetingen door technische ruis en beperkingen van markers te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid via gestandaardiseerde digitale PCR-workflows en gepoolde stamformaten.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door betrouwbare fitnessgegevens te leveren met minder replicaten.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van stammen mogelijk op basis van kwantitatieve fitnessprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in genetische manipulatie om unieke DNA-barcodes chromosomaal te integreren zonder de fitness te beïnvloeden.
- Afhankelijk van toegang tot digitale PCR-instrumentatie en een compatibiele supermix voor sonde-gebaseerde detectie.
- Vereist gestandaardiseerde drempelwaardebepaling en protocollen voor druppelanalyse over putjes en experimenten heen.
- Vereist een zorgvuldig ontwerp van verdunningsreeksen en aftrek van het percentage fout-positieven uit controle-reacties.
- Aanpassing aan nieuwe organismen is afhankelijk van de efficiëntie van chromosomale modificatie en de neutraliteit van de barcode-insertieplaats.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Validate the Sensitivity and Specificity of Each Primer-probe Set for Each Genomic Barcode Using Digital PCR
3:09
Analyze Digital PCR Data and Calculate Absolute Copy Numbers
4:52
Results: Representative Digital PCR Results of Diluted AA-barcoded gDNA
6:28
Conclusion
