Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

In deze video beschrijven we een reeks procedures die zijn ontworpen om de impact van een virale infectie en de daaruit voortvloeiende immunologische respons te ondervragen met behulp van een Murine-model van Zika-infectie. Dit protocol is belangrijk omdat het ons in staat stelt om een mechanistisch begrip van infectie en immuniteit te ontwikkelen door te bepalen in hoeverre een virus zich door het hele lichaam heeft verspreid, fysieke barrières omvormt en toegang heeft tot weefsels. Deze technieken maken een gedetailleerd begrip van virale pathogenese mogelijk en bieden de mogelijkheid om het beschermingsmechanisme van vaccins of therapieën te ontleden.

Hier tonen we deze methode met behulp van Zika virus infectie van muizen, maar deze methode kan worden toegepast op een scala van virale infecties, waaronder andere flavivirussen zoals Dengue virus en alfavirussen zoals Chikungunya virus. Het oogsten van de organen van het centrale zenuwstelsel kan een uitdaging zijn, dus het is belangrijk voor een persoon om een klein experiment te plannen en bereid te zijn om de technieken vooraf te oefenen. Dit protocol zorgt voor de snelle dissectie van virale verspreiding binnen kleine diermodellen met de mogelijkheid om experimentele gegevens te visualiseren, vast te leggen en op te slaan.

Het is belangrijk om deze methode visueel aan te tonen, zodat de onderzoeker kan begrijpen hoe de organen van het centrale zenuwstelsel te oogsten. Het is ook belangrijk om het niveau van cel samenvloeiing en de intensiteit van de virale foci te zien. Gebruik om te beginnen met tangen om de pels van de geïnfecteerde muis te verwijderen.

Onthoofd het hoofd van de muis met een schaar, gevolgd door het verwijderen van de armen en benen. Om de hersenen te oogsten, gebruik gekartelde La Grange schaar om de schedel door de foramen magnum te snijden. Pel de schedel af met tangen en schep de hersenen eruit met een spatel.

Met behulp van sterke afgestompte schaar, verwijder het bot rond de wervelkolom, dan snijd over het bekken om de wervel foramen bloot op het niveau van de lendenen. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk spieren rond de wervelkolom. Plaats voorzichtig de schuine punt van de naald in de wervelstipamen, vermijd overmatige druk om te voorkomen dat de naald het wervellichaam overtreedt.

Houd sterk om druk uit te oefenen op het wervellichaam en de naald, en druk op de spuitzuiger om het koord in de petrischaal te verdrijven. Breng het ruggenmerg onmiddellijk over in de gelabelde buis en plaats in het droogijsbad voor verdere homogenisatie. Voor homogenisatie, voeg een milliliter DMEM en homogeniseren het monster in een BeadBeater.

Na ervoor te zorgen organen worden gehomogeniseerd, centrifuge en aliquot monsters op ijs en op te slaan in de min 80 graden Celsius totdat dat nodig is. Op de dag van de test, verwijder de gehomogeniseerde monsters uit de min 80 graden Celsius vriezer, en laat ze ontdooien. Met de monsters op ijs verdunnen Zika virus vertienvoudigd in de eerste put van de verdunningsplaat en gebruik een multichannel pipet om tienvoudige seriële verdunningen van de plaat te doen, waarbij telkens tips worden gewijzigd.

Door het toevoegen van 20 microliter van het monster in 180 microliters van groeimedia, veranderen pipet tips tussen elke verdunning. Bereid de focusvormingsplaat voor door de media uit de voorbereide platte bodem 96-putplaat te verwijderen die virocells bedekt. Om te voorkomen dat de monolaag uitdroogt, voegt u onmiddellijk 100 microliter van de virusverdunning toe aan elke put in de viroplate.

Gebruik dezelfde set tips om toe te voegen van de laagste naar de hoogste concentratie. Rotsplaat van links naar rechts twee tot vier keer en incubeer bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende een tot twee uur. Warm 2%methylcellulose op tot kamertemperatuur.

Verdun vervolgens de 2%methylcelluloseoplossing in groeimedia bij een verhouding van ongeveer twee tegen één. Voeg na incubatie 125 microliter van de methylcellulose groeimedia toe aan elke put van de 96-putplaten. Incubeer opnieuw bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende 32 tot 40 uur.

Om de virocells te repareren, voeg in een bioveiligheidskast 50 microliter van 5% paraformaldehyde toe over de bovenkant van de methylcelluloselaag in elke put van de 96-putplaten. Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. U ook de platen bedekken met Parafilm en ze 's nachts op vier graden Celsius plaatsen.

Gebruik daarna een pipet om overlay en media uit cellen te verwijderen in een wegwerpcontainer in de bioveiligheidskast. Was voorzichtig met 150 microliter PBS per put. Haal PBS van de platen en verwijder de plaat uit de bioveiligheidskast.

Herhaal de PBS wassen tweemaal, voeg dan 150 microliters per put een keer FFA wasbuffer en laat op kamertemperatuur gedurende vijf tot 10 minuten om de vaste cellen te permeabiliseren. Gebruik vervolgens primair Zika-antilichaam om infectie op te sporen. Bereid het primaire antilichaam 4G2 voor met een concentratie van één microgram per milliliter in FFA-kleuringsbuffer.

Flick FFA wasbuffer van de platen, en voeg 50 microliters van het primaire antilichaam in FFA kleuring buffer aan elke put. Sluit vervolgens de platen af met Parafilm, of plastic folie, en broed 's nachts uit op vier graden Celsius. Bereid de secundaire go anti-muis HRP gelabeld antilichaam bij een concentratie van een tot 5.000 in FFA kleuring buffer.

Na het verwijderen van de antilichaamoplossing, was cellen drie keer met 150 microliters FFA wasbuffer per put. Verwijder de wasbuffer door telkens in de gootsteen te vegen. Bevlek de cellen met het secundaire antilichaam in FFA-kleuringsbuffer bij 50 microliters per put en broed één tot twee uur bij kamertemperatuur uit.

Daarna, cellen wassen drie keer met FFA wasbuffer, nogmaals, het verwijderen van de wasbuffer door flicking in de gootsteen elke keer. Voeg 50 microliter van het TrueBlue Substraat toe aan elke put. Wacht twee tot 15 minuten tot de vlekken volledig zijn gedefinieerd met een minimale achtergrond.

Nadat de vlekken zichtbaar zijn, was voorzichtig met water met behulp van een hand om de monolaag te beschermen tegen de kracht van het stromende water. Tik droog op papieren handdoeken. Kort daarna, gebruik maken van een ontleden bereik om handmatig te tellen van de vlekken in elke put, of gebruik een geautomatiseerde spot teller.

Selecteer in de ImmunoCapture-software een verdunning met gemakkelijk te onderscheiden foci tussen 20 tot 200 per put voor elk monster en bereken titer in focusvormende eenheden per millimeter met behulp van het gemiddelde van dubbele putten. In dit experiment, virale last werd getoond in de perifere en centrale zenuwstelsel weefsels na Ifnar muizen werden gegeven Zika virus onderhuids. De detectiegrens lag tussen de 100 en 500 FFU per gram, gebaseerd op orgel.

Bij het uitvoeren van de focusvormende test kunnen technische fouten leiden tot suboptimale resultaten. Orgaantoxiciteit, gedreven door een hoge concentratie van de lever, veranderde de gevoeligheid van de test. Toen de virale titer in het orgaan lager was dan de toxiciteit, kon de FFA de virale titers niet nauwkeurig registreren.

Niercellen illustreerden toxiciteit met een hoge orgaanconcentratie, maar werden overwonnen door de virale titer bij lage orgaanconcentraties. Krachtige pipetting of wassen kan de monolaag verwijderen, wat leidt tot verloren gegevens onjuiste rapportage van titer resultaten. Vezels of haren die aanwezig zijn in lab bank absorberend papier, kan besmetten individuele putten en veroorzaken aanzienlijke fouten bij het gebruik van een geautomatiseerd tellen programma.

Celdichtheid is een ander probleem, dat het succes van een focusvormende test drastisch kan beïnvloeden. Cellen bij ongeveer 60%-samenvloeiing aan het begin van de test, vergeleken met cellen verguld met 90%-samenvloeiing, vertoonden een dramatisch verschil dat van invloed was op de focusvormingstest. Het plannen van de omvang en omvang van het experiment, zodat de orgaanoogst efficiënt wordt voltooid, is het belangrijkste onderdeel van de procedure, gevolgd door het starten van de focusvormende test met cellen van hoge kwaliteit.

Deze procedure is gebruikt om het virus te kwantificeren voor meerdere virale families. Dit protocol kan ook worden aangepast aan het scherm voor therapeutische verbindingen en neutraliseren neutraliseren antilichaam titers. Deze technieken worden gebruikt om levend virus te kwantificeren en passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen volgens de richtlijnen van de BMBL.