De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

Deze methode maakt het mogelijk om te manipuleren en te kwantificeren hoe de cellen zich collectief organiseren. Dit is belangrijk omdat we patroon kunnen modelleren in in vitro en disentangle cues strak gekoppeld in vivo. De techniek vereist minimale specialistische apparatuur, waardoor het kan worden vastgesteld in een standaard biologie lab, en het is kwantitatief, waardoor de ontdekking van sub-visuele patronen gebeurtenissen.

Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op elk celsysteem waar patronen kunnen ontstaan en om niet-willekeurige patronen van differentiatie, proliferatie en cel-tot-celconcurrentie te ontdekken. De belangrijkste met deze methode is de systematische optimalisatie van micropatterning parameters voor nieuwe celtypes. Bijvoorbeeld patroongrootte en vorm, type matrix en celhechtingstijd.

Het dragen van handschoenen, plaats een stuk laboratoriumfilm in de bodem van een 10-centimeter vierkante petrischaal. Gebruik een 12-millimeter gat punch om hydrofobe plastic glijbanen te snijden om 12-millimeter-rond deksel slips te creëren, en plaats de cover slips in een nieuwe Petri schotel. Gebruik een pincet om de beschermfolie voorzichtig uit de afdekslipjes te verwijderen.

Plaats het fotomasker op een schoon en stabiel oppervlak, chroom zij omhoog, en voeg een twee-microliter druppel van dubbel gedestilleerd water op de positie van de gewenste chip ontwerp. Druk voorzichtig een afslag op de druppel en plaats de houder bovenop de plastic glijbanen. Bevestig deze sandwich voorzichtig met klemmen om de plastic stukken in contact te houden met het fotomasker.

Plaats de montage in een ultraviolette ozonlamp ongeveer twee centimeter van de lichtbron voor een verlichting van 10 minuten. Aan het einde van de verlichtingsperiode, pak de sandwich met het fotomasker aan de onderkant en verwijder voorzichtig de klemmen met behoud van druk met één hand om te voorkomen dat de dia's bewegen tijdens het demonteren van de sandwich. Wanneer alle klemmen zijn verwijderd, verwijder de houder, zorg ervoor dat alle plastic stukken zijn nog steeds op het masker en niet vast te zitten aan de houder, en voeg dubbel gedestilleerd water aan de chips om voorzichtig los de chips van het fotomasker.

Plaats de chips met fotopatroon in de matrixafzettingskamer, verlicht naar boven, en voeg 200 microliter coatingoplossing toe aan elke chip. Voeg vervolgens 's nachts een petrischaal van drie centimeter gevuld met dubbelgedestilleerd water toe aan de kamer om verdamping bij vier graden Celsius 's nachts te beperken. Voor het zaaien van embryonale cellen op de chips, was de chips met twee ten minste vijf minuten wast in verse, steriele PBS per wasbeurt, alvorens een keer tien tot de vijfde cellen in 200 microliter van de juiste celkweek medium op elke chip.

Sluit vervolgens de zaaikamer. Een uur lang uitbroeden zodat de cellen zich aan de chips kunnen hechten. Wanneer de cellen zijn bevestigd, vul de putten van een multiwell plaat met 500 microliters van warm medium per put, en gebruik steriele pincet om de chips over te brengen in individuele plaat putten.

Schud de plaat krachtig om niet-aanhangende cellen los te maken en vervang de supernatant onmiddellijk door vers, warm medium. Controleer vervolgens onder de microscoop of patronen zichtbaar zijn. 48 uur na hun beplating moeten de cellen dichte kolonies vormen die de vorm van de patronen rigoureus volgen.

Laat de chips in de plaat, verwijder alles behalve net genoeg medium om te voorkomen dat de chips uitdrogen, en voeg ten minste 500 microliter van paraformaldehyde of PFA-gebaseerde fixatie oplossing per goed. Na tien minuten, kort wassen de putten drie keer met wasoplossing, gevolgd door een wasbeurt met 50-millimolar ammoniumchloride verdund in wasoplossing om resterende PFA crosslinking activiteit te blussen. Behandel de monsters na de laatste wasbeurt gedurende ten minste 30 minuten met een blokkeeroplossing.

Voor immunostaining van de chipculturen, breng de chips in een kleurkamercel naar boven en voeg onmiddellijk 100 microliters toe van de primaire antilichaamoplossing die van belang is voor elke chip. Na een uur op een roterend platform bij kamertemperatuur, was de chips drie keer met wasoplossing zoals aangetoond, en broed de chips met de juiste secundaire antilichamen gedurende een uur op het roterende platform. Aan het einde van de secundaire antilichaam incubatie, was de chips drie keer in wasoplossing en monteer de chip op een microscopie schuif met 20 microliters van een standaard montagemedium.

Als u de chips wilt beelden, past u eerst de scansnelheid, beeldresolutie, framemiddeling en detectorverding aan om een optimaal tussen de beeldkwaliteit en de beeldtijd te identificeren. Dan verwerven beelden van elke chip. Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, installeer en voer PickCells uit volgens de documentatie die online beschikbaar is, maakt u een nieuw experiment en importeert u de afbeeldingen in het programma.

Gebruik de Nessys module om de kernen te segmenteren op basis van het nucleaire envelopsignaal. Gebruik de basissegmentatiemodule om het autofluorescentiesignaal van het patroon te identificeren. Klik vervolgens op Voltooien en wacht tot alle afbeeldingen zijn verwerkt.

Als u nuclei-objecten wilt maken en basisobjectfuncties wilt berekenen, start u de module Intrinsieke functies vanaf de taakbalk en sluit u de deelvensters Ellipsoïde fitter en surface-afzuigpaneel om alleen het deelvenster Basisfuncties open te houden. Selecteer nucleus"als objecttype en selecteer het opgegeven voorvoegsel voor de gesegmenteerde afbeeldingen. Klik vervolgens op Compute" en wacht tot alle afbeeldingen zijn verwerkt.

In dit stadium moeten extra functies in kernen worden geschreven voordat de gegevens voor onze analyse worden geëxporteerd. Als u bijvoorbeeld de naam van de afbeelding wilt opslaan waartoe elke kern behoort als een nucleuskenmerk, klikt u op Gegevens en nieuw kenmerk en selecteert uker"in de pop-updialoog. Klik op OK"selecteer Gegevens verzamelen van andere objecten die zijn verbonden met het knooppunt" en klik op Volgende"Selecteer Afbeelding in het linkerdeelvenster en dubbelklik op het ondervragingsteken om het afbeeldingsknooppunt in te stellen als doel van het pad.

Vouw het deelvenster Bewerking Reductie uit en selecteer Eén ophalen:Het deelvenster Beschikbaar attribuut uitvouwen en selecteer het kenmerk Naam. Klik vervolgens op Wijzigen en Volgende"Afbeeldingsnaam invoeren, druk op de Tab-toets en klik op Voltooien"Exporteer de gegevens vervolgens naar een door tabbladen gescheiden waardebestand. Voor onze analyse worden de geëxporteerde gegevens herhaald naar de gegevensmap van de R-Script-map.

Open Onze studio en open de mapsjabloon R-Script binned"Stel vervolgens de werkmap in op de bronbestandslocatie en voer het script uit om dichtheidskaarten te genereren. Op een uur na celzaaien, de individuele celcultuur pattens kan niet volledig worden samengevoegd als de cellen vermenigvuldigen na verloop van tijd. Echter, de patronen zullen volledig gekoloniseerd met slechts zeer weinig cellen buiten de kleefoppervlakken.

Patroon dat niet duidelijk is tot twee uur na het zaaien duidt op een storing van de procedure. De ruimtelijke opsluiting van embryonale stamcellen van muizen op grote schijven of ringmicropatronen leidt de patronen van een subpopulatie cellen die de mesodermale brachyurymarker uitdrukken. Wanneer de embryonale stamcellen van de muis bijvoorbeeld worden gekweekt op micropatronen op grote schijven, zijn de brachyury-positieve cellen bij voorkeur beperkt tot de periferie van het patroon waar de lokale celdichtheid het laagst is.

Deze patroon wordt bevestigd door de kaart van de intensiteit van de hersenen-brachyury. Deze gegevens tonen aan dat de methode subvisueele informatie kan onthullen, aangezien de inspectie van één kolonie niet voldoende is om enige vorm van ruimtelijke organisatie in merker van interesseexpressie te identificeren. Dit wordt met name verklaard door de belangrijke variabiliteit van kolonie tot kolonie.

De techniek toont ook aan dat er geen detecteerbare patronen bestaan voor remmer van DNA-bindende die erop kan wijzen dat T-patroon niet wordt aangedreven door botmorfogenetische eiwitsignalering in deze context. Onthoud altijd welke kant van de cover slip heeft geëlimineerd en gecoat en ook zorg ervoor dat de cellen goed hebben gehecht voor het afwassen van de overtollige cellen. Deze methode maakt het mogelijk de studie van de milieu-signalen belangrijk in het begeleiden van zelf-organisatie van cellen en kan ook wiskundige modellen die ons helpen beter onder de rudimental patroon.