Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Het protocol wordt gebruikt voor verzadiging mutagenesis van een eiwitbindende site. Als uw eiwitbindende site niet bekend is, kan deze worden geïdentificeerd met behulp van dit protocol. De techniek is relevant voor ziektediagnose en -therapie.

Ik denk dat het volledige potentieel in de biomedische wetenschappen nog volledig moet worden benut. Deze methode kan in grote lijnen worden toegepast op elk eiwit of reactie waar de gewenste moleculen kunnen worden gescheiden van ongewenste moleculen. Zorg ervoor dat de bibliotheek goed is gerandomiseerd, en zorg ervoor dat tijdens elke binding en scheiding stap vouw verrijking van de gewenste moleculen hoog is.

Het gaat om verschillende stappen en veel details die beter worden aangetoond, in plaats van uitgelegd in woorden. Na het bekijken van deze video, moet u comfortabel zijn met hoe u een willekeurige bibliotheek voor te bereiden, synthetiseren een beginnende RNA-pool, en het uitvoeren van een bindende reactie op afzonderlijke gewenste en ongewenste moleculen om hoge affiniteit en specifieke bindmiddelen te verkrijgen. Synthetiseer eerst de voorwaartse primer en de omgekeerde primer door chemische synthese op een DNA-synthesizer.

Synthetiseer ook een willekeurige bibliotheek oligonucleotide sjabloon met 31 gerandomiseerde posities. In een PCR-buis, meng een-micromolar DNA willekeurige bibliotheek sjabloon, one-micromolar forward primer met T7 RNA polymerase promotor en reverse primer, 20-millimolar Tris at pH eight, 1.5-millimolar magnesiumchloride, 50-millimolar kaliumchloride, 1-microgram-per-milliliter acetylated runderserum albumine, twee eenheden Taq polymerase, en 200 micromolar elk van dNTPs. Stel de PCR-machine op met vijf cycli van denaturatie, annealing en uitbreidingsstappen, gevolgd door één cyclus van uitbreiding om de promotor aan de DNA-bibliotheek te bevestigen.

Stel een 100-microliter transcriptiereactie op die T7 transcriptiebuffer, een micromolar random library pool DNA, vijf millimolar DTT, twee millimolar GTP, één millimolar elk van ATP, CTP en UTP bevat, en twee-eenheden-per-microliter T7 RNA polymerase. Trek nu een acrylglas schild en handschoenen aan. Introduceer radioactiviteit door 5 microliters of minder van alpha-32P UTP toe te voegen aan de transcriptiereactie voor autoradiografie.

Incubeer het reactiemengsel in een microcentrifugebuis gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Om RNA te gelzuiveren, bereid je een 10%denaturerende polyacrylamide gel. Laad monsters in de putten van de gel.

Stel de gel bloot aan een röntgenfilm en identificeer de locatie van de transcripties op de gel en knip de gelschijf uit. Plaats de gel plak in een centrifuge buis en breken in kleinere stukken met een homogenizer tip. Voeg proteinase K buffer toe om de gelstukken onder te dompelen.

Laat de buis minstens twee uur op een nutator staan bij kamertemperatuur. Draai vervolgens vijf minuten lang in een snelle microcentrifuge bij kamertemperatuur om het gelpuin te verwijderen en de bufferoplossing te herstellen. Voeg een gelijk volume fenol-chloroform in de buis met de supernatant, vortex, en centrifuge.

Herhaal de extractie met fenol-chloroform nog een keer en dan met chloroform nog een keer. Meng vervolgens de waterige fase van de proteinase K-buffer met 1/10 volume natriumacetaat van drie kies bij pH 5,2, 10 microgram tRNA of 20 microgram glycogeen en twee tot drie hoeveelheden ethanol opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Laat de buis op min 80 graden Celsius gedurende een uur.

Draai de buis met de oplossing vijf tot tien minuten bij vier graden Celsius in een microcentrifuge. Gooi de supernatant voorzichtig weg en voeg 70% ethanol toe om de RNA-pellet te spoelen. Draai twee tot vijf minuten.

Aspirate de ethanol zorgvuldig, en lucht-droog de RNA pellet. Voeg vervolgens 50 microliter water toe dat met DEPC is behandeld om de RNA-pellet op te nemen. Laat het monster bij min 20 graden Celsius voor opslag.

Om eiwit en RNA te binden in een reactievolume van 100 microliters, bereid eerst 10-millimolar Tris hydrochloride voor op pH 7.5 met 50 millimolar kaliassiumchloride, één millimolar DTT, 09-microgram-per-microliter runder serum albumine, 5-eenheden-per-microliter RNAsin, 15 microgram-per-microliter tRNA, en één-millimolar EDTA. Voeg vervolgens 30 microliter recombinant eiwit PTB en 10 microliter RNA uit de juiste pool toe. Plaats de buizen met de bindingsreacties ongeveer 30 minuten in een temperatuurblok op 25 graden Celsius.

Fractioneer vervolgens het gebonden RNA van het niet-gebonden RNA door middel van vier selectie- en versterkingsrondes. Filtreer eerst het monster van 100 microliter bij kamertemperatuur door een nitrocellulosefilter dat aan een vacuümspruitstuk is bevestigd. Het RNA-eiwitcomplex blijft op het filter.

Hak met een steriel scheermesje het filter in fragmenten en steek deze in een centrifugebuis. Dompel de filterstukken onder in de Proteinase K-buffer en leg deze minimaal drie uur of 's nachts op een beker om het RNA te herstellen. Om het RNA-monster te deproteiniseren, voeg je een gelijk volume fenolchloroform, vortex en centrifuge vervolgens vijf minuten op hoge snelheid bij kamertemperatuur.

Verkrijg de waterige fase en haal opnieuw uit met chloroform. Meng daarna het supernatant met 1/10 volume natriumacetaat van drie kies bij pH 5.2 en twee tot drie volumes absolute ethanol. Laat de buis in een min 80-graden Celsius vriezer voor 30 minuten, en dan centrifugeren op hoge snelheid gedurende 10 minuten.

Herhaal de was- en droogstappen met 70% ethanol en verlos het RNA in MET DEPC behandeld water. Na de eerste ronde van filterbinding test, voer nog drie rondes. Voer vervolgens twee rondes transcriptie, binding en versterking uit om de eiwitgebonden RNA-fracties te scheiden van de niet-gebonden fracties.

Prefab een native 5%polyacrylamide gel met 60-op-1 acrylamide-bis-acrylamide verhouding in 5x TBE buffer. Stel vervolgens de RNA-eiwitbindingsreactie op. Plaats de gel in een elektroforese apparaat gevuld met 5x TBE buffer in een koude kamer op vier graden Celsius.

Breng 250 volt gedurende 15 minuten aan en pipet de bindingsreactie in verschillende putten. Fractioneer vervolgens het gebonden RNA van het niet-gebonden RNA verder door de elektroforese gedurende één tot twee uur op 250 volt uit te voeren. Stel vervolgens de gel bloot aan een röntgenfilm en identificeer de locatie van het gebonden RNA met behulp van autoradiografie.

Knip de gelschijf met het gebonden RNA uit en steek deze in een buis. Plet de gelschijf en broed gedurende drie uur of 's nachts in de proteinase K-buffer. Herhaal de extractie met fenol-chloroform en chloroform zoals eerder beschreven.

Synthetiseer cDNA uit het opgeloste RNA. Bereid 20 microliter van de reactie, met inbegrip van twee microliters van 10x RT buffer, twee microliters van AMV omgekeerde transcriptase, een microliter van omgekeerde primer, vijf microliter water, en 10 microliter van het opgeloste RNA. Incubeer bij 42 graden Celsius gedurende 60 minuten.

Versterk de cDNA met behulp van 20 tot 25 PCR cycli zoals eerder beschreven. Herhaal het proces van RNA synthese, eiwitbinding, en scheiding van eiwitgebonden en niet-gebonden fracties. Om de eiwitbinding te analyseren, gebruikt u de gelmobiliteitsverschuivingsanalyse of de filterbindingstest om bindende affiniteit en specificiteit te bepalen voor geselecteerde pools of afzonderlijke sequenties binnen elke pool.

Gebruik autoradiografie of een fosforafbeeldingsaar om banden in de gebonden breuk en niet-gebonden fractie te detecteren en te kwantificeren. Ga verder met het protocol met klonen en sequentieuitlijning. In deze studie werd een succesvolle selectie-versterking bereikt.

De zoogdier polypyrimidine-tract bindende eiwit met 300-voudige hogere eiwitconcentratie toont nauwelijks detecteerbare binding aan het zwembad nul sequentie, maar hoge affiniteit voor de geselecteerde sequentie pool. Selectie-versterking met succes geïdentificeerd op RNA-bindende eiwitten met voorkeur of consensusbindingsplaats. Toevoeging van de recombinant PTB, die zich bindt aan een upstream drie-prime splice site, leidt tot activering van de alternatieve of downstream drie-prime splice site.

Daarentegen leidt toevoeging van recombinant hnRNP C tot onderdrukking van beide drie-prime splice sites. Toevoeging van de recombinant algemene splicing factor U2AF65 keerde de hnRNP C-gemedieerde drie-prime splice site repressie. Het is belangrijk om te onthouden dat een goede gerandomiseerde bibliotheek en de juiste bindende voorwaarden die een hoge vouwverrijking geven bij elke bindende stap nodig zijn voor succes.

Geschikte functionele tests en in vivo tests kunnen worden gebruikt om de uitkomst van deze aanpak te valideren. Op het gebied van genexpressie zijn met behulp van deze techniek functies van talrijke eiwitten bestudeerd. Het is belangrijk om handschoenen en radioactieve afdichting te gebruiken voor bescherming tijdens het werken met polyacrylamide en radioactiviteit.