Name: In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer een indirecte ELISA-sandwichmethode om de potentie van rabiësvaccins te evalueren met behulp van monoklonale antilichamen. Deze in vitro-techniek biedt een snel en betrouwbaar alternatief voor dierproeven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Sylvie Morgeaux en Dr. Jean-Michel Chapsal moeten worden erkend voor hun belangrijkste deelname aan de ELISA-test op vaccinbatches vast te stellen en internationale workshops en samenwerkingsstudies te organiseren. Wij danken Sabrina Kali voor het kritisch lezen van het manuscript. Dr. Pierre Perrin was verantwoordelijk voor de isolatie en karakterisering van mAb-D1. Dit werk werd voornamelijk ondersteund door de financiering van het Institut Pasteur.

1. Veiligheidsmaatregelen
OPMERKING: Deze methode is van toepassing op zowel levend RABV als geïnactiveerd vaccin.
<ol><li>Gebruik goede laboratoriumpraktijken en veiligheidsprocedures.</li>
	<li>Draag adequate persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s), waaronder wegwerpjas, handschoenen, masker, bril, enz.</li>
	<li>Wanneer het levende virus wordt getitreerd, gebruik dan een biologische veiligheidskast van klasse II.<ol>
<li>Beschouw elk materiaal dat in contact komt met de monsters (reagentia, wasoplossingen, enz.) als besmettelijk materiaal.</li>
		<li>Behandel het verontreinigde materiaal door het in de bleekoplossing (2,5% natriumhypochloriet) gedurende 30 min in te dompelen voor ontsmetting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Behandel chemicaliën in overeenstemming met de Good Laboratory Practice.</li>
</ol>2. Voorbereiding
<ol><li>Gebruik waar mogelijk reagentia van analytische kwaliteit.</li>
	<li>Bereid nieuwe oplossingen voor van de coatingbuffer/carbonaatbuffer, passivatiebuffer, verdunnings- en kletteringsbuffer (tabel 1), filter door 0,45 of 0,22 μm filters en bewaar op 4 °C gedurende een dag voorafgaand aan het gebruik om hun analytische zuiverheid te behouden.</li>
	<li>Laat reagentia tot de kamertemperatuur komen (+18 °C tot +25 °C) 30 min voor het gebruik en homogeniseren door vóór het gebruik voorzichtig te mengen.</li>
</ol>3. Microplaatsensibilisatie
OPMERKING: Gebruik 96 goed adsorptie immunoassay platen die zijn geoptimaliseerd om hoge hoeveelheden immunoglobulinen te binden (bijvoorbeeld, zie Tabel van materialen).
<ol><li>Voeg aan elke put 200 μL van het monoklonale antilichaam (mAb-D1) verdund toe in de carbonaatbuffer. OPMERKING: Een optimale concentratie van ongeveer 1 μg/mL is experimenteel bepaald en komt overeen met een geschatte verdunning van de gezuiverde mAb-D1. Deze aanbevolen concentratie wordt aangegeven voor elke mAb-D1-batch en moet periodiek worden geverifieerd met de positieve controle.</li>
	<li>Bedek de plaat met een kleeffolie en incubeer de microplaat gedurende 3 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer.</li>
	<li>Voorzichtig aanzuigen en breng de put inhoud in een ontvanger met 2,5% natriumhypochloriet oplossing.</li>
	<li>Draai de microplaat om en laat het 5 min drogen op een adsorbentpapier bij kamertemperatuur.</li>
</ol>4. Microplate passivation
<ol><li>Voeg aan elke put 300 μL van de passivationbuffer toe.</li>
	<li>Bedek de plaat met een kleeffolie en incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.</li>
	<li>Zuig voorzichtig aan en breng het putgehalte over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.</li>
	<li>Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min. LET OP: De microplaat kan tot 3 maanden tot gebruik onmiddellijk worden gebruikt of verzegeld bij -20 °C.</li>
</ol>5. ELISA-test
OPMERKING: Voor het vaststellen van de controlecurve van het referentievaccin is stap 5.3 niet vereist; om het geteste vaccin te titreren zijn alle stappen 5.1 tot en met 5.6 noodzakelijk.
<ol><li>Wassen van de gesensibiliseerde microplaat<ol>
<li>Voeg aan elke put 300 μL van de wasbuffer toe.</li>
		<li>Zuig voorzichtig aan en breng het putgehalte over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.</li>
		<li>Herhaal de stappen 5.1.1 en 5.1.2 nog vijf keer om de gesensibiliseerde plaat uitgebreid te wassen.</li>
		<li>Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdunningen van het referentievaccin voor de controlecurve<ol>
<li>Reconstrueren van het referentievaccin (validatieantigeen Lot 09) in 1 mL gedestilleerd water dat overeenkomt met een concentratie van 10 μg/mL van het glycoproteïnevirus van rabiës.</li>
		<li>Bereid een tienvoudige verdunning van het gereconstitueerde referentievaccin in het verdunningsmiddel voor om 1 μg/mL van het glycoproteïnevirus van rabiës te bereiken.</li>
		<li>Bereid 6 seriële tweevoudige verdunningen van dit referentievaccin voor in het verdunningsmiddel zoals aangegeven in tabel 1.</li>
		<li>Verdeel 200 μL van het verdunningsmiddel in duplicaat (putten 1H/2H) om te dienen als een blanco controle.</li>
		<li>Verdeel 200 μL per put van elk referentievaccin verdunning in duplicaat (putten G1/G2 tot A1/A2).</li>
	</ol></li>
	<li>Verdunningen van het geteste vaccin voor de titratie<ol>
<li>Bereid een tienvoudige verdunning van het geteste vaccin in het verdunningsmiddel.</li>
		<li>Bereid 7 tweevoudige seriële verdunningen van het geteste vaccin in verdunningsmiddel zoals aangegeven in tabel 2.</li>
		<li>Verdeel 200 μL per put van elke geteste vaccinverdunning in duplicaat (putten H3/H4 tot A3/A4).</li>
	</ol></li>
	<li>Incubatie/wassen van de ELISA plaat<ol>
<li>Bedek de microplaat met een kleeffolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Verwijder de folie, spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.</li>
		<li>Voeg aan elk goed 300 μL wasbuffer toe.</li>
		<li>Spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.</li>
		<li>Herhaal de stappen 5.4.3 en 5.4.4 vijf keer om het ongebonden antigeen te verwijderen en de G-eiwittrimers die aan het gecoate antilichaam gebonden zijn (mAb D1) te conserveren.</li>
		<li>Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Binding van de peroxidase geconjugeerde mAb-D1<ol>
<li>Verdeel 200 μL per put van de aanbevolen verdunning (1/2000) van peroxidase-label mAb-D1 in verdunning (geschatte concentratie van 1μg/mL). Voor elke mAb-D1-batch wordt een aanbevolen concentratie aangegeven en moet periodiek met de positieve controle worden geverifieerd.</li>
		<li>Bedek de microplaat met een kleeffolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Verwijder de folie, spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.</li>
		<li>Voeg aan elke put, 300 μL van de wasbuffer.</li>
		<li>Spoel voorzichtig aan en breng de inhoud van elke put over in een ontvanger met 2,5% natriumhypochlorietoplossing.</li>
		<li>Herhaal de stappen 5.5.4 en 5.5.5 vijf keer om ongebonden peroxidase-gelabeld antilichaam (mAb D1) te verwijderen.</li>
		<li>Draai de microplaat om en laat het drogen op een adsorbent papier bij kamertemperatuur gedurende 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Openbaring met behulp van een substraat-chromogen<ol>
<li>Verdeel 200 μL per put van substraat-chromogen oplossing.</li>
		<li>Sluit de microplaat af met een film en broed in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Een geel-oranje kleur ontwikkelt de intensiteit waarvan evenredig is met de hoeveelheid gebonden peroxidase-gelabeldantilichaam (mAb D1).</li>
		<li>Stop de reactie door 50 μL stopoplossing per put toe te voegen.</li>
		<li>Veeg voorzichtig de bodem van de microplaat af en plaats deze in een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) te bepalen op 492 nm van alle gebruikte putten: negatieve controle (blanco), referentievaccin en getest vaccin.</li>
		<li>Od-gegevens verzamelen als .xls- of .xlsx-bestandsindeling voor analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Teken de referentievaccincurve, het trimeric glycoproteïnegehalte, als functie van optische dichtheid (492 nm)<ol>
<li>Bereken de gemiddelde OD op 492 nm voor elk duplicaat bij de verschillende verdunningen van het referentievaccin (putten G1/G2 tot A1/A2 in tabel 2)</li>
		<li>Trek de gemiddelde OD van de Blanco (putten, H1/H2 in tabel 2)af van elk berekend gemiddelde OD.</li>
		<li>Plot de resulterende OD-waarden op de verticale as (lineaire schaal) en de overeenkomstige concentratie in glycoproproteïne-trimers (ng/mL) op de horizontale as (logaritmische schaal).</li>
		<li>Teken de referentiecurve door punten(figuur 1)samen te voegen.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het epitoop dat door de mAb-D1 wordt erkend, bevindt zich in de antigene plaats III van het RABV-glycoproteïne, dat niet alleen immunodominant is voor de inductie van VNAbs, maar ook betrokken is bij neurovirulence, pathogeniteit40,41 en receptorherkenning42. Er is nog een andere belangrijke antigene site langs het glycoproteïne, site II43, waartegen verschillende MAbs zijn geïsoleerd, zoals mAb-WI-1112<sup class="x...

Sinds meer dan 50 jaar wordt de NIH-test1 gebruikt als een gouden standaardmethode om de potentie van het rabiësvaccin vóór de batchrelease te evalueren. Deze test bestaat uit een intraperitoneale immunisatie van groepen muizen met het te testen vaccin, gevolgd door een intracerebrale (IC) uitdaging 14 dagen later met de Challenge Virus Standard (CVS) stam van rabiësvirus (RABV). De potentie wordt geëvalueerd vanuit het aandeel muizen dat de IC-uitdaging overleeft. Hoewel who2 en European Pharmacopeia3 nog steeds de NIH-test vereisen voor de beoordeling van de vaccinpotentie, lijdt deze test aan verschillende hindernissen: de resultaten zijn zeer variabel4; besmettelijke RABV wordt gebruikt tijdens de uitdaging en dit vereist zowel technische vaardigheid als strikte bioveiligheidsmaatregelen; grote aantallen dieren worden gebruikt, en de ernst van de uitdaging roept ernstige ethische bezwaren op5. Een minder ernstige variatie van deze test is ontwikkeld: twee weken na de intra-peritoneale immunisatie worden muizen niet uitgedaagd door IC, maar gebloed en getest op de aanwezigheid van specifieke RABV neutraliserende antilichamen (VNAbs) in hun serum met behulp van een in vitro neutralisatietest. Deze test vereist echter nog steeds het opofferen van een groot aantal laboratoriummuizen, hoewel deze al wordt gebruikt voor de veterinaire vaccins6,7 en in aanmerking is genomen voor menselijke vaccins8.
Vanaf nu moedigen zowel internationale9- als Europese10-aanbevelingen fabrikanten en nationale controlelaboratoria (Official Medicine Control Laboratories - OL's) aan om de vervanging, vermindering en verfijning van laboratoriumdierproeven uit te voeren, de zogenaamde 3Rs-strategie. De Europese Richtlijn 2010/63/EU (die sinds 2013/01/01 van kracht is) met betrekking tot de bescherming en het welzijn van dieren heeft ook de beperkingen versterkt voor vaccinfabrikanten en laboratoria die betrokken zijn bij de kwaliteitscontrole van rabiësvaccins en bij onderzoek naar rabiës11. Als gevolg hiervan zijn de ontwikkeling, validatie en het gebruik van alternatieve in vitro benaderingen nu een prioriteit geworden. Deze zijn niet alleen ethisch verantwoord, maar kunnen ook de kosten voor batchtesten verlagen en de tijd voor resultaten verkorten tot uren in plaats van weken3.
Aan het oppervlak van het RABV-deeltje neemt het glycoproteïne een trimeric vormaan 12,13,14,15,16. In rabiësvaccin vormt deze inheemse trimeric vorm de belangrijkste immunogen inducerende VNAbs17, terwijl de monomeric, oplosbare of gedenatureerde glycoproteïnen slecht immunogene18,19zijn. Zo is het behoud van trimers van het glycoproteïne langs het vaccinproductieproces een goede indicator voor het behoud van een optimaal immunogeen potentieel. Verschillende immunochemische methoden, zoals de antilichaambindingstest20,21,de enkelvoudige radiale immunodiffusie (SRD) test22 en de ELISA-test23,24,25,27,27 worden aanbevolen door de WHO Technical Report Series2 en de Europese monografie3 om het antigeengehalte in rabiësvaccins te kwantificeren. Deze worden gebruikt door fabrikanten om de consistentie van de productie van vaccins te controleren en door de OMCL om de consistente formulering van partijen menselijke vaccins28tebeoordelen, zelfs als de NIH-test nog steeds in aanmerking komt voor de potentie.
Echter, al deze immunochemische methoden zijn niet gelijkwaardig. De SRD-test vereist een voorbehandeling die de membraanverankerde trimers kan veranderen en kan resulteren in een oplosbare of gedenatureerde vorm van het glycoproteïne222,29. Daarom is SRD niet veel efficiënt in het discrimineren tussen immunogene en niet-immunogene glycoproteïnen wat resulteert in een onvolmaakte beoordeling van de immunogeniciteit van een vaccinpartij. Daarentegen is de ELISA-test gevoeliger22, behoudt de oorspronkelijke structuur van het glycoproteïne en is het beter om de inhoud van de native gevouwen trimers van glycoproteïne te bepalen. De ELISA-test kan gebruik maken van konijnenpolyklonale of muismonoklonale anti-glycoproteïneantilichamen gezuiverd of geconcentreerd met ammoniumsulfaat. Studies hebben aangetoond goede overeenstemming tussen de NIH-test en het antigeengehalte geëvalueerd door ELISA in vaccins en concludeerde dat ELISA-methoden geschikt zijn voor de in vitro potentie test. Dit pleit ervoor dat ELISA-tests op zijn minst de NIH-test4,26,27,30,31,32,33kunnen aanvullen of zelfs vervangen ., Vandaag beveelt de Europese Farmacopee het gebruik aan van gevalideerde serologische of immunochemische tests als alternatief voor de NIH-test3. Het volledig vermijden van dierlijk gebruik voor vaccinpotentie is een realistisch perspectief geworden.
De onderstaande methode is gebaseerd op een indirecte ELISA sandwich immunocapture met behulp van een muis monoklonale antilichaam kloon (mAb-D1) die de antigene sites III (aa 330 tot 338) van de trimeric RABV glycoproteïne15,34herkent. Deze methode werd in eerste instantie ontwikkeld aan het Institut Pasteur26,30 vervolgens geoptimaliseerd en gevalideerd door de Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) laboratorium, dat wil zeggen, de Franse OMCL4,33. De mAb-D1 wordt zowel gebruikt voor het sensibiliseren van de plaat als vervolgens voor het detecteren van het gevangen antigeen. Dit maakt de specifieke kwantificering van de glycoproproteïne trimers mogelijk, d.w.z. het immunogene RABV-antigeen. De mAb-D1 die voor de detectie wordt gebruikt, is gelabeld met peroxidase, wat wordt onthuld in aanwezigheid van het substraat en chromogen. Vergelijking van de voor het geteste vaccin gemeten absorptiemiddel en het referentievaccin maakt de bepaling van het immunogene glycoproteïnegehalte mogelijk. Het is van belang dat hetzelfde type test kan worden toegepast voor verschillende mAbs herkennen verschillende antigene sites van de RABV glycoproteïne35. De methode om met ammoniumsulfaat anti-glycoproteïne polyklonkonijn immunoglobulinen G (IgG) of monoklonale muisglobuline te verkrijgen en te zuiveren of te concentreren, is eerder uitgebreid beschreven36 samen met de methode om antilichamen met peroxidase37te vervoegen..

<table><tbody><tr><td>Class II Biological Safety Cabinet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10445753</td><td>indien titratie van levend virus</td></tr><tr><td>Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 &micro;L, MAXISORP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>439454</td><td>goed voor binding aan het geladen antilichaam</td></tr><tr><td>Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12576606</td><td>voor de bereiding van zwavelzuur</td></tr><tr><td>Immunology Plate Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96</td><td>Dutscher</td><td>55303</td><td>goed voor binding aan het geladen antilichaam</td></tr><tr><td>Microplate Sealing Tape(100 vellen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Microplate&nbsp; single mode reader Sunrise</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate shaker-incubator</td><td>Dutscher</td><td>441504</td><td></td></tr><tr><td>Microplate washer Wellwash</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5165000</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (30-300 &micro;L) 12 kanalen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0,2-2 &mu;L micro, 2-20 &mu;L, 20-200 &mu;L &amp; 100-1000 &mu;L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4700880</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro elisa-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

De groeiende wereldwijde zorg voor het dierenwelzijn moedigt fabrikanten en de Nationale Controlelaboratoria (OL's) aan om de 3Rs-strategie voor de vervanging, vermindering en verfijning van het laboratoriumdierproeven te volgen. De ontwikkeling van in vitro benaderingen wordt aanbevolen op het WHO- en Europees niveau als alternatieven voor de NIH-test voor de evaluatie van de potentie van rabiësvaccin. Aan het oppervlak van het rabantievirus (RABV) vormen trimers van glycoproteïne de belangrijkste immunogen die virale neutraliserende antilichamen (VNAbs) veroorzaken. Een ELISA-test, waarbij monoklonale antilichamen (mAb-D1) de trimeric vorm van het glycoproteïne herkennen, is ontwikkeld om de inhoud van het inheemse gevouwen trimeric glycoproteïne samen met de productie van de vaccinbatches te bepalen. Deze in vitro potentie test toonde een goede overeenstemming met de NIH-test en is geschikt bevonden in gezamenlijke proeven door RABV vaccin fabrikanten en OL's. Het vermijden van dierlijk gebruik is een haalbaar doel in de nabije toekomst.
De gepresenteerde methode is gebaseerd op een indirecte ELISA sandwich immunocapture met behulp van de mAb-D1 die de antigene sites III (aa 330 tot 338) van het trimeric RABV glycoproteïne herkent, d.w.z. het immunogene RABV-antigeen. mAb-D1 wordt gebruikt voor zowel coating als detectie van glycoproproproteïne trimers die aanwezig zijn in de vaccinbatch. Aangezien het epitoop wordt herkend vanwege zijn conformatie-eigenschappen, kan het potentieel gedenatureerde glycoproteïne (minder immunogeen) niet worden opgevangen en gedetecteerd door de mAb-D1. Het te testen vaccin wordt geïncubeerd in een plaat die is gesensibiliseerd met de mAb-D1. Gebonden trimeric RABV glycoproteïnen worden geïdentificeerd door het toevoegen van de mAb-D1 opnieuw, gelabeld met peroxidase en vervolgens onthuld in de aanwezigheid van substraat en chromogen. Vergelijking van de voor het geteste vaccin gemeten absorptiemiddel en het referentievaccin maakt de bepaling van het immunogene glycoproteïnegehalte mogelijk.

In het volgende voorbeeld wordt het referentievaccin Lot 09, bestaande uit gezuiverde geïnactiveerde rabiësvirusdeeltjes (PV-vaccinstam), gebruikt. Het glycoproproteïne-gehalte (10 μg/mL) hierin is vastgesteld na de bepaling van de totale hoeveelheid virale eiwitten (BCA-test) en de evaluatie van het percentage van het glycoproteïne door SDS-polyacrylamidegelelektrofore. Als alternatief kan een gekalibreerd referentievaccin, bijvoorbeeld de WHO6th International Standard (IS) vo...

Hier beschrijven we een indirecte ELISA sandwich immunocapture om de immunogene glycoproproteïnegehalte in rabiësvaccins te bepalen. Deze test maakt gebruik van een neutraliserende Monoclonal Antibody (mAb-D1) herkennen glycoproproproteïne trimers. Het is een alternatief voor de in vivo NIH-test om de consistentie van de potentie van het vaccin tijdens de productie te volgen.

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Om dierproeven te verminderen en vanwege de variabiliteit van de NH-test, moedigt de WHO aan om in vitro benaderingen te ontwikkelen voor de evaluatie van de potentie van rabiësvaccins. Deze ELISA-test toont een goede overeenstemming met een klassieke NH-test bij het herkennen van de immunogene vorm van de glycoproteïne, toont een hoge gevoeligheid en kan binnen slechts één dag worden uitgevoerd. Evaluatie van rabiës vaccin potentie in vitro door ELISA is een alternatief voor de in vivo NH test.Het wordt bevorderd door de fabrikanten en de nationale controlelaboratoria. Het is van cruciaal belang om voor-sized volumes te verdelen in tweevoud voor elke verdunning en om goed droog de plaat op absorberend papier na wasbeurten om te voorkomen dat om deze procedure te beginnen, op adequate persoonlijke bescherming apparatuur met inbegrip van wegwerp jas, handschoenen, masker, en glazen. Behandel de verontreinigde materialen door het onder te dompelen in een oplossing van 2,6% natriumhypochloriet gedurende 30 minuten voor ontsmetting.Stel vervolgens een 96-well immunoassay plaat en voeg 200 microliter van de monoklonale antilichaam verdund in de carbonaat buffer aan elke put. Bedek de plaat met kleeffolie en broed de microplaat drie uur lang in een bevochtigde omgeving op 37 graden Celsius. Dan zorgvuldig aspirate en breng de put inhoud in een ontvanger met een oplossing van 2,6% natrium hypochloriet.Keer de microplaat om en laat het vijf minuten drogen op absorberend papier bij kamertemperatuur. Voeg eerst 300 microliters van de passivatiebuffer toe aan elke put. Bedek de plaat met kleeffolie en incubeer 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Breng hierna de inhoud van de put over naar een oplossing van 2,6% natriumhypochloriet. Om de plaat te wassen, voeg 300 microliter van de wasbuffer aan elke put. Dan zorgvuldig aanzuigen en de putinhoud overbrengen naar een ontvanger met een oplossing van 2,6% natriumhypochloriet.Herhaal dit wasproces nog vijf keer om de gesensibiliseerde plaat uitgebreid te wassen. Omkeren de microplaat daarna om en laat het één minuut drogen op een stuk absorberend papier bij kamertemperatuur. Reconstitueer het referentievaccin in één milliliter gedestilleerd water zodanig dat de uiteindelijke concentratie van rabiësvirus glycoproteïne 10 microgram per milliliter bedraagt.Bereid een 10-voudige verdunning van het gereconstitueerde referentievaccin in het verdunningsmiddel voor om een glycoproteïneconcentratie van een microgram per milliliter te bereiken. Voer vervolgens zes seriële tweevoudige verdunningen van dit referentievaccin uit in het verdunningsontwerp zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Verdeel 200 microliter van het verdunningsmees in dubbele putten om te dienen als een blinde controle en 200 microliter per put voor elke verdunning van referentievaccins in tweevoud.Bereid vervolgens een 10-voudige verdunning van het geteste vaccin in het verdunningsmetje en bereid zeven tweevoudige seriële verdunningen van het geteste vaccin in verdunningsvat zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol. Verdeel 200 microliter van elke geteste vaccinverdunning in tweevoud tot elke put van de microplaat. Bedek de microplaat met kleeffolie en broed gedurende een uur in op 37 graden Celsius.Verwijder hierna de film. Breng de inhoud van elke put zorgvuldig over naar een ontvanger met een natriumhypochlorietoplossing van 2,7%. Om de plaat te wassen, voeg 300 microliter wasbuffer aan elke put, aspirate zorgvuldig en breng de inhoud van elke put in een ontvanger met een 2,6% natrium hypochloriet oplossing.Herhaal het wasproces nog vijf keer om het niet-gebonden antigeen te verwijderen en de G-eiwittrimiers te behouden die gebonden zijn aan het gecoate antilichaam. Keer de gewassen microplaat om en laat het één minuut drogen op een stuk absorberend papier bij kamertemperatuur. Verdeel vervolgens 200 microliter van de aanbevolen verdunning van peroxidase met het label D1 monoklonale antilichaam in verdunningsstof naar elke put.Bedek de microplaat met kleeffolie en broed gedurende een uur in op 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de film, aspirate zorgvuldig, en breng de inhoud van elke put in een ontvanger met een 2,6% natrium hypochloriet oplossing. Om de microplaat te wassen, voeg 300 microliter wasbuffer aan elke put.Breng de inhoud van elke put zorgvuldig over naar een ontvanger met een natriumhypochlorietoplossing van 2,6%. Herhaal dit wasproces nog vijf keer om het niet-gebonden peroxidasegelabelde antilichaam te verwijderen. Keer de gewassen microplaat om en laat het één minuut drogen op een stuk absorberend papier bij kamertemperatuur.Verdeel vervolgens 200 microliter substraatchromogene oplossing in elke put. Verzegel de microplaat met folie en incubbate bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 50 microliter van het stoppen van oplossing in elke put om de reactie te stoppen.Veeg de onderkant van de microplaat voorzichtig af en plaats deze in de spectrofotometer. Bepaal de optische dichtheid op 492 nanometer voor alle gebruikte putten. Verzamel deze gegevens in een spreadsheetbestand voor analyse.Maak hierna plots voor zowel de referentievaccincurve als de optische dichtheidswaarden zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt de in vitro ELISA-test gebruikt om de potentie van rabiësvaccins te evalueren. Representatieve optische dichtheidswaarden van een typisch experiment worden hier weergegeven.Deze waarden worden gebruikt om de referentievaccincurve te trekken door de gemiddelde optische dichtheid in kaart te brengen voor de verschillende verdunningen van het referentievaccin op de verticale as en de concentratie van de glycoproteïne op de horizontale as. Het glycoproteïnegehalte van het geteste vaccin wordt vervolgens geschat met behulp van deze curve. De evaluatie is nauwkeurig voor verdunningen met een gemiddelde optische dichtheidswaarde in het linergebied van de referentievaccincurve.Rekening houdend met de verdunning van één tot 40, komt de verticale projectie van OD 1534 op de x-as overeen met 500 nanogram per milliliter. Het geteste vaccin wordt geschat op 20 microgram per milliliter glycoproteïne. Wanneer de in vitro potentie is vastgesteld, is het noodzakelijk om het geteste vaccin te vergelijken met de referentie zes WHO internationale standaard gekalibreerd in internationale eenheden.Dezelfde methode kan worden gebruikt met andere antilichamen om de detectie van meer vaccinstammen te vergroten, waaronder die welke worden gebruikt in veterinaire vaccins die klassiek variabeler zijn. Antilichamen kunnen ook worden gebruikt in de concurrentie voor titratie van antirabies antilichamen in paarden of menselijk serum. Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen met vaccins die niet geïnactiveerd zijn of met virussen.Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen gebruikt, handschoenen draagt en alles goed ontsmet. Wees ook voorzichtig met tabletten van als ze kankerverwekkend en met de zure natrium hypochloriet oplossing.

in-vitro-elisa-test-to-evaluate-rabies-vaccine-potency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates immunohistochemistry staining for rabies virus antigen detection in infected mouse brain tissue. The process includes deparaffinization and alcohol treatment, followed by proteolytic treatment to enhance antigen accessibility. Immunohistochemistry staining reveals red precipitates, confirming the presence of rabies antigens in the tissue section.

An Immunohistochemistry Staining for the Detection of Rabies Virus Antigens

This video showcases an indirect enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA sandwich immunocapture assay designed to assess immunogenic glycoprotein levels in vaccines. The assay plate, containing glycoprotein-specific antibodies, is incubated with serially diluted vaccine samples, including reference and test vaccines, followed by immunoassay to quantify glycoprotein content in the test vaccine.

Using a Sandwich ELISA to Determine the Immunogenic Glycoprotein Content in a Vaccine

Deze studie beschrijft een hoog debiet, imaging gebaseerde micro-neutralisatie test om te bepalen van de titer van neutraliserende antilichamen specifiek voor respiratoir syncytieel virus (RSV). Deze bepaling-indeling is getest op verschillende monster typen.

Een verbeterde en hoge doorvoer respiratoir syncytieel Virus (RSV) Micro-neutralisatie Assay

De directe Rapid immunohistochemische test (DRIT) biedt een Wereldorganisatie voor diergezondheid en Wereldgezondheidsorganisatie (OIE/WHO) erkend alternatief voor de direct fluorescent antilichaam (DFA) test voor de diagnose van rabiës. Deze test maakt het mogelijk voor veld-gebaseerde toepassingen die kunnen worden uitgevoerd in ongeveer 1 h na hersen vertoningen met behulp van Lichtmicroscopie.

Verbeterde bewaking van rabiës met behulp van een directe snelle immunohistochemische test

Een pan-Lyssavirus geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie is ontwikkeld om specifiek te detecteren alle bekende lyssaviruses. Validatie met behulp van rabiës hersenen monsters van verschillende diersoorten bleek dat deze methode een gevoeligheid en specificiteit gelijkwaardig is aan de gouden standaard fluorescerende antilichaam test en kan worden gebruikt voor routine hondsdolheid diagnose heeft.

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

We presenteren een compleet protocol voor postmortem diagnose van dierlijke hondsdolheid onder veldomstandigheden met behulp van een snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT), van hersenbiopsie bemonstering tot uiteindelijke interpretatie. We beschrijven ook verdere toepassingen met behulp van het apparaat voor moleculaire analyse en virale genotypering.

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

Hier presenteren we een immunohistochemisch testprotocol voor de detectie van rabiësvirusantigeen als een alternatieve diagnostische test voor formaline-gefixeerde weefsels.

Immunohistochemische test voor de detectie van het lyssavirusantigeen uit formaline-gefixeerde weefsels

Dit protocol presenteert een qRT-PCR-gebaseerde benadering voor het bepalen van het rabiësvirus nucleoproteïne (N) genkopienummer binnen verschillende anatomische structuren van runderhersenen met behulp van in vitro transcriptie.

Kwantificering van rabiësvirus in verschillende runderhersenstructuren

Deze methode beschrijft de inkapseling van het rabiësantigeen in biologisch afbreekbare polymere microdeeltjes met structurele en materiaaleigenschappen die pulsatiele afgifte na een vooraf bepaalde vertraging mogelijk maken. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) beoordeling van het antigeen dat uit de deeltjeskern wordt gehaald, bevestigt de aanwezigheid van intact trimerisch rabiësvirus glycoproteïne door deeltjesfabricage.

Fabricage van pulsatiele polymere microdeeltjes die rabiësantigeen inkapselen

Het doel van dit manuscript is om het gebruik van de rabiës indirecte fluorescerende antilichaamtest voor de detectie van rabiës-specifieke IgG- en IgM-antilichamen te onderzoeken.

Detectie van rabiës IgG- en IgM-antilichamen met behulp van de Rabiës Indirect Fluorescerende Antilichaamtest

Dit protocol demonstreert de pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR)-assay van weefselverzameling tot resultaatinterpretatie, inclusief updates van primersequenties en formuleringen om de testprestaties voor sommige niet-rabiës, lyssavirussen en lagomorfen te verbeteren. We demonstreren ook de testopstelling voor een LN34 multiplexed (LN34M) formaat met één put.

Postmortale diagnose van hondsdolheid bij dieren door de bijgewerkte, gemultiplexte LN34 real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactietest

Leer een indirecte ELISA-sandwichmethode om de potentie van rabiësvaccins te evalueren met behulp van monoklonale antilichamen. Deze in vitro-techniek biedt een snel en betrouwbaar alternatief voor dierproeven.

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

Meer video's verkennen