Een semi-kwantitatieve drug affiniteit responsieve doel stabiliteit (DARTS) assay voor het bestuderen van Rapamycine/mTOR interactie

Drug affiniteit responsieve doelstabiliteit, DARTS, is een robuuste methode voor de detectie van nieuwe kleine molecuul eiwit doelen. Het kan worden gebruikt om bekende kleine molecuul eiwit interacties te verifiëren en om potentiële eiwit doelen voor natuurlijke producten te vinden. In deze studie verbeteren we de data-analysemogelijkheden van het DARTS-experiment verder door de veranderingen in eiwitstabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten.

De eiwit-ligand interacties kunnen worden uitgezet tegen twee curven, een proteolytische curve en een dosis-afhankelijkheid curve. We hebben de mTOR-rapamycine interactie gebruikt als een voorbeeld voor de vaststelling van ons protocol. Kweek 293T cellen met DMEM met 10%foetaal runderserum, twee millimolar glutamine en 1% antibiotica.

Broed de culturen bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Wanneer de cultuur 80 tot 90% samenvloeiing bereikt, was de cellen tweemaal met koude PBS. Gebruik een celschraper om de cellen te verzamelen in een geschikte hoeveelheid koude cellyse buffer en breng de lysing cellen over in een 1,5-millimeter buis.

Omkeren om de lyse buffer en lysing cellen goed te mengen en de buis 10 minuten op ijs uit te broeden. Centrifugeren de buis op 18.000 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatant in een nieuwe 1,5-milliliter buis en houd gekoeld op ijs.

Voer BCA-test uit om de eiwitconcentratie van lysaten te benaderen en de verdunning van het pronaza te berekenen op basis van de eiwitconcentratie. Breng het lysaat eerst over in twee buizen van 1,5 milliliter, elk 99 microliter. Voeg een microliter van kleine molecuul voorraad oplossing aan elke aliquot van lysate en uitbroeden de twee buizen gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur met schudden.

Op ijs, vast te stellen seriële verdunningen van vers ontdooide pronaza oplossing in 1x TNC. Na de incubatie met het kleine molecuul, verdeel elke aliquot in 20 microliter van monsters in vijf buizen. Om dezelfde verteringstijd te garanderen, voeg u met specifieke intervallen van elke 30 seconden twee microliters van de voorbereide pronazaoplossingen toe aan de monsters.

Voeg voor de ene controlegroep twee microliters TNC-buffer toe. Na vijf tot 20 minuten, stop de vertering van de zes buizen via de toevoeging van twee microliters van koude 20x proteaseremmer cocktail op 30-seconden intervallen. Meng goed en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.

Verdun elk monster met zes microliters van 5x SDS-PAGE laadbuffer en kook de monsters in een waterbad op 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Nu, om westerse vlek uit te voeren, laad gelijke hoeveelheden eiwit in de putten van een 8%SDS-PAGE gel, samen met een geschikte moleculaire gewicht marker. Laat de gel 30 minuten draaien op 80 volt, pas de spanning aan op 120 volt en blijf één tot twee uur lopen.

Controleer of het kleine molecuul zich rechtstreeks kan binden aan de potentiële doeleiwitten. In dit protocol bevestigde incubatie met het kleine molecuul de bescherming tegen proteolyse. Drie banden bleken te worden beschermd door incubatie met rapamycine over de controle van het voertuig.

Westerse blotting illustreerde de aanwezigheid van mTOR-eiwit bij lage pronaza-eiwitverhoudingen en de vermindering en het verlies met toenemende ratio's. Proteolyse van mTOR door pronaza werd duidelijk geremd door de aanwezigheid van rapamycine en de toevoeging van rapamycine genereerde een duidelijke verschuiving in de proteolytische curve. Rapamycine dosis-dependently verbeterde het niveau van mTOR, wat suggereert dat de stijgende stabiliteit van mTOR met rapamycine behandeling.

Kwantificering van de doeleiwitbandintensiteit suggereerde dat mTOR het doeleiwit van rapamycine is. Om het beste stapsgewijze effect te krijgen, kan dit experiment meerdere keren moeten worden herhaald om een geschikt bereik van pronaza over eiwitverhoudingen te verkrijgen.