Name: In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Leer functionele analyse van zeldzame missense-varianten in menselijke genen met behulp van Drosophila melanogaster. Deze kosteneffectieve in vivo-methode versnelt de diagnose van zeldzame ziekten en biedt inzicht in ziekte mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Jose Salazar, Julia Wang en Dr. Karen Schulze voor de kritische lezing van het manuscript. We erkennen drs. ning Liu en XI Luo voor de functionele karakterisering van de TBX2 varianten die hier worden besproken. Niet-gediagnosticeerde ziekten Network model organismen screening Center werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Gemeenschappelijk Fonds (U54 NS093793). H. T. C. werd verder ondersteund door de NIH [CNCDP-K12 en NINDS (1K12 NS098482)], de American Academy of Neurology (neuro Science Research Grant), het Burroughs Wellcome Fund (loopbaan prijs voor medische wetenschappers), de Child neurologie Society en de Child neurologie Foundation ( (DP5 OD026426) en de eerste onafhankelijkheids prijs van NIH Director. M. F. W. werd verder ondersteund door Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. werd verder ondersteund door de NIH (R01 DC014932), de Simons Foundation (SFARI Award: 368479), de Alzheimer's Association (nieuwe onderzoeker Research Grant: 15-364099), naman familie fonds voor fundamenteel onderzoek, en Caroline Wiess Law Fonds voor onderzoek in Moleculaire geneeskunde. Confocale microscopie bij BCM wordt deels ondersteund door NIH Grant U54HD083092 aan de intellectuele en ontwikkelings handicap Research Center (IDDRC) neuro Visualization core.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Experimentele studies met Drosophila melanogaster bieden een robuust assay-systeem om de gevolgen van met de ziekte geassocieerde menselijke varianten te beoordelen. Dit is te wijten aan de grote hoeveelheid kennis en diverse genetische hulpmiddelen die zijn gegenereerd door veel onderzoekers in het veld vliegen over de afgelopen eeuw89. Net als elk ander experimenteel systeem is het echter belangrijk om de voorbehoud en beperkingen te erkennen die bestaan.
<st...

Patiënten met zeldzame ziekten ondergaan vaak een moeizame reis die wordt aangeduid als de "diagnostische Odyssee" om een accurate diagnose1te verkrijgen. De meeste zeldzame ziekten worden verondersteld te hebben een sterke genetische oorsprong, het maken van genetische/genomic analyseert kritische elementen van de klinische werk. In aanvulling op de kandidaat-genpanel sequencing en de Copy Number variatie-analyse op basis van chromosomale micro arrays, zijn whole-exome (WES) en Whole-genoom sequencing (WGS)-technologieën steeds meer waardevolle hulpmiddelen geworden in de afgelopen tien jaar2, 3. Momenteel is de diagnostische snelheid voor het identificeren van een bekende pathogene variant in Wes en WGS ~ 25% (hoger in pediatrische gevallen)4,5. Voor de meeste gevallen die niet gediagnosticeerd blijven na klinische WES/WGS, is een veelvoorkomend probleem dat er veel kandidaatgenen en varianten zijn. Volgende-generatie sequencing identificeert vaak nieuwe of ultra-zeldzame varianten in veel genen, en het interpreteren of deze varianten bijdragen aan de ziekte fenotypes is uitdagend. Hoewel de meeste onzin-of frame Shift-mutaties in genen worden beschouwd als verlies van functie (LOF) allelen als gevolg van nonsens-gemedieerde verval van de gecodeerde transcriptie, kunnen afslankende mutaties die in de laatste exonen zijn gevonden, aan dit proces ontsnappen en functioneren als goedaardig of gain-of-function (GoF) allelen6.
Bovendien, het voorspellen van de effecten van een missense allel is een lastige taak, omdat het kan resulteren in een aantal verschillende genetische scenario's zoals voor het eerst beschreven door Herman Muller in de jaren 1930 (dat wil zeggen, amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, Neomorph, of Isomorph)7 . Talrijke in silico-Programma's en methodologieën zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van missense-varianten te voorspellen op basis van evolutionaire instandhouding, type aminozuur verandering, positie binnen een functioneel domein, allel-frequentie in de algemene populatie, en andere parameters8. Deze Programma's zijn echter geen allesomvattende oplossing voor het oplossen van het gecompliceerde probleem van de interpretatie van varianten. Interessant is dat een recente studie heeft aangetoond dat vijf algemeen gebruikte voorspellend voorspelling van varianten (Polyphen9, SIFT10, Cadd11, Provean12, mutatie taster) overeenkomen met pathogeniteit ~ 80% van de tijd8 . Met name, zelfs wanneer alle algoritmen het erover eens zijn, geven ze een onjuiste voorspelling van pathogeniteit tot 11% van de tijd. Dit leidt niet alleen tot gebrekkige klinische interpretatie, maar kan ook onderzoekers ontmoedigen om nieuwe varianten op te volgen door ze onterecht als goedaardig te vermelden. Een manier om de huidige beperking van in silico-modellering aan te vullen, is om experimentele gegevens te leveren die het effect van de variant functie in vitro, ex vivo (bijv. gekweekte cellen, organoïden) of in vivo aantonen.
In vivo functionele studies van zeldzame ziekten geassocieerde varianten in MO hebben unieke sterktes13 en zijn goedgekeurd door vele zeldzame ziekte onderzoek initiatieven over de hele wereld, met inbegrip van de niet-gediagnosticeerde ziekten netwerk (UDN) in de Verenigde Staten en zeldzame Ziekten modellen & mechanismen (RDMM) netwerken in Canada, Japan, Europa en Australië14. Naast deze gecoördineerde inspanningen om MO-onderzoekers te integreren in de workflow voor diagnose van zeldzame ziekten en mechanistische studies op nationale schaal, hebben een aantal individuele samenwerkings onderzoeken tussen klinische en MO-onderzoekers geleid tot de ontdekking en karakterisering van vele nieuwe genen en varianten van de menselijke ziekte,82,83,84.
In het UDN ontvangt een gecentraliseerd model organismen screening Center (MOSC) inzendingen van kandidaatgenen en varianten met een beschrijving van de toestand van de patiënt en beoordeelt zij of de variant waarschijnlijk pathogeen is met informatica-instrumenten en in vivo Experimenten. In fase I (2015-2018) van het UDN bestond de MOSC uit een Drosophila kern [Baylor College of Medicine (BCM)] en Zebrafish core (University of Oregon) die samen werkten om gevallen te beoordelen. Met behulp van informatica analyse en een aantal verschillende experimentele strategieën in Drosophila en zebravis heeft de MOSC tot nu toe bijgedragen aan de diagnose van 132 patiënten, identificatie van 31 nieuwe syndromen55, ontdekking van verschillende nieuwe menselijke ziekte genen (bijv. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) en fenotypische expansie van bekende ziekten genen (bijv. CACNA1A21, ACOX122).
Naast projecten binnen het UDN hebben de kern onderzoekers van MOSC Drosophila bijgedragen aan nieuwe ziekteverwekkende genen in samenwerking met de centra voor Mendelian Genomics en andere initiatieven (bijv. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) met dezelfde verzameling van informatica en genetische strategieën ontwikkeld voor het UDN. Gezien het belang van MO-studies over de diagnose van zeldzame ziekten, werd de MOSC uitgebreid met een C. elegans core en Second Zebrafish core (beide aan de Washington University in St. Louis) voor fase II (2018-2022) van het UDN.
Dit manuscript beschrijft een in vivo functioneel studie protocol dat actief wordt gebruikt in de UDN MOSC Drosophila core om te bepalen of missense varianten functionele gevolgen hebben voor het proteïne van belang met behulp van transgene vliegen die menselijke Eiwitten. Het doel van dit protocol is om MO-onderzoekers te helpen samen te werken met klinische onderzoeksgroepen om experimenteel bewijs te leveren dat een kandidaatvariant in een gen van belang functionele gevolgen heeft, waardoor de klinische diagnose wordt vergemakkelijkt. Dit protocol is vooral nuttig in een scenario waarin een onderzoeker van Drosophila wordt benaderd door een klinisch onderzoeker die een patiënt met een zeldzame ziekte heeft met een specifieke kandidaatvariant in een gen van belang.
Dit protocol kan worden onderverdeeld in drie elementen: (1) het verzamelen van informatie om de waarschijnlijkheid te beoordelen van de variant van de rente die verantwoordelijk is voor het fenotype van de patiënt en de haalbaarheid van een functioneel onderzoek in Drosophila, (2) het verzamelen bestaande genetische hulpmiddelen en het oprichten van nieuwe, en (3) het uitvoeren van functionele studies in vivo. Het derde element kan verder worden onderverdeeld in twee sub-elementen, gebaseerd op hoe de functie van een variant van belang kan worden beoordeeld (reddingsexperiment of overexpressie gebaseerde strategieën). Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden aangepast en geoptimaliseerd voor vele scenario's buiten zeldzame monogene ziekte onderzoek (bijvoorbeeld, gemeenschappelijke ziekten, gen-omgeving interacties, en farmacologische/genetische schermen om therapeutische doelen te identificeren). De mogelijkheid om de functionaliteit en pathogeniteit van varianten te bepalen zal niet alleen de patiënt van belang ten goede komen door een accurate moleculaire diagnose te geven, maar zal ook bredere effecten hebben op zowel translationeel als fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Stocks voor UAS-human cDNA transgenese</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injectiestammen voor transgenese (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Specifiek Reagens: VK33 (3e chromosoom) Injectielijn</td></tr><tr><td>Injectiestammen voor transgenese (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Specifiek Reagens: VK37 (2e chromosoom) Injectielijn</td></tr><tr><td>Plasmid DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloningsvector</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Specifiek Reagens: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila transgenese vector</td><td>Gift van Drs. Johannes Bischof en Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)</td><td></td><td>Specifiek Reagens: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>Moleculair biologie kits en reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Specifiek Reagens: Agarose (moleculaire biologie kwaliteit)</td></tr><tr><td>Chemisch Competente Cellen (E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>Specifiek Reagens: DH5&alpha;</td></tr><tr><td>DNA Gel Extractie kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>Specifiek Reagens: PureLink Gel Extractie Kit</td></tr><tr><td>DNA Isolatie en zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>Specifiek Reagens: QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>Specifiek Reagens: Q5 Polymerase kit</td></tr><tr><td>Recombinase-gemedieerde klonering systeem</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>Specifiek Reagens: Gateway BP Clonase kit</td></tr><tr><td>Recombinase-gemedieerde klonering systeem</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Specifiek Reagens: Gateway LR Clonase II Enzym kit</td></tr><tr><td>Site Directed Mutagenese kit</td><td>Agilent</td><td>#200523</td><td>Specifiek Reagens: Quick Change II Mutagenese kit</td></tr><tr><td>Electroretinogram Rig gerelateerd apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analyse</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Specifiek Reagens: Axon pCLAMP 10 Data Software Pakket</td></tr><tr><td>ERG Gegevensverzameling</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>Specifiek Reagens: ISO-DAM Geïsoleerde Biologische Versterker</td></tr><tr><td>ERG Stimulator</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Specifiek Reagens: Vierkante Puls Stimulator</td></tr></tbody></table>

in vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

De vooruitgang in de sequentie technologie heeft het hele genoom en het geheel-exome datasets toegankelijker gemaakt voor zowel klinische diagnose als het geavanceerde onderzoek naar menselijke genetica. Hoewel een aantal silico-algoritmen zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van de in deze gegevenssets geïdentificeerde varianten te voorspellen, zijn functionele studies van cruciaal belang om te bepalen hoe specifieke genomische varianten de eiwit functie beïnvloeden, vooral voor missense Varianten. In het netwerk van niet-gediagnosticeerde ziekten (UDN) en andere onderzoeksconsortia met een zeldzame ziekte worden model organismen (MO), waaronder Drosophila, C. elegans, zebravis en muizen, actief gebruikt om de functie van vermoedelijke humane ziekteveroorzakende Varianten. Dit protocol beschrijft een methode voor de functionele beoordeling van zeldzame menselijke varianten die worden gebruikt in de model organismen screening centrum Drosophila kern van het UDN. De workflow begint met het verzamelen van menselijke en MO-informatie uit meerdere openbare databases, waarbij de WebResource MARRVEL wordt gebruikt om te beoordelen of de variant waarschijnlijk bijdraagt aan de toestand van een patiënt en effectieve experimenten ontwerpt op basis van beschikbare kennis en middelen. Vervolgens worden genetische hulpmiddelen (bijv. T2A-GAL4 en UAS-Human cDNA-lijnen) gegenereerd om de functies van de interesse varianten in Drosophilate beoordelen. Bij de ontwikkeling van deze reagentia kunnen twee-pronged Functionele assays op basis van reddings-en overexpressie-experimenten worden uitgevoerd om de variant functie te beoordelen. In de reddingstak worden de endogene vlieg genen "gehumaniseerd" door het orthologeuze Drosophila gen te vervangen door referentie-of variant menselijke transgenen. In de overexpressie tak, de referentie en variant menselijke eiwitten zijn exogenously gedreven in een verscheidenheid van weefsels. In beide gevallen kan elke scoor bare fenotype (bijvoorbeeld letaliteit, oogmorfologie, elektrofysiologie) als uitlezen worden gebruikt, ongeacht de ziekte van belang. Verschillen waargenomen tussen referentie en variant allelen suggereren een variant-specifiek effect, en dus waarschijnlijk pathogeniteit. Dit protocol maakt snelle, in vivo evaluaties mogelijk van putatieve humane ziekteveroorzakende varianten van genen met bekende en onbekende functies.

Functionele studie van de Novo missense variant in EBF3 gekoppeld aan neurodevelopmental fenotypes In een 7-jarige man met neurodevelopmental fenotypes met inbegrip van hypotonie, ataxie, wereldwijde ontwikkelingsachterstand, en expressieve spraakstoornis, artsen en menselijke genetici bij de National Institutes of Health Ungediagnosticeerde ziekten project (UDP) identificeerde een de Novo missense variant (p. R163Q) in EBF3 (Early b-Cell factor 3)15,...

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Dit protocol stelt ons in staat om te bepalen of missense varianten in menselijke genen die gekoppeld zijn aan ziekten de eiwitfunctie beïnvloeden. Dit is moeilijk te bereiken computationeel, zelfs met state-of-the-art algoritmen. Deze techniek maakt een snelle analyse van missense varianten in menselijke eiwitten met behulp van een in vivo systeem Drosophila melanogaster die sneller en kostenefficiënter is dan gewervelde modelorganismen.Aantonen dat een specifieke variant de eiwitfunctie beïnvloedt, draagt direct bij aan de diagnose van zeldzame ziekten en dient als uitgangspunt voor de analyse van het ziektemechanisme en mogelijke therapieën. Dit protocol is vooral handig bij het bestuderen van varianten in verband met zeldzame ziekten, maar het kan worden toegepast op meer voorkomende ziekten zoals autisme en kanker. Het identificeren van reproduceerbare fenotypes bij vliegen die de eiwitfunctie weerspiegelen, kan een uitdaging zijn.De fenotypes kunnen variëren van gen tot gen en kunnen subtiel zijn. Functionele studies van varianten in menselijke eiwitten met behulp van Drosophila kunnen worden uitgevoerd op basis van reddingsexperimenten of overexpressiestudies. Verzamel voor aanvang van de procedure informatie over het menselijke gen van belang en de modelorganisme orthologs.Om variant functie te testen door overexpressing referentie en variant menselijke eiwitten in de vlieg visuele systeem, genereren transgene vliegen die referentie of variant menselijke cDNAs van belang onder de controle van de Gal4 upstream activeren sequentie of UAS-systeem uit te drukken. Om een specifieke Gal4-lijn te selecteren om de menselijke eiwitten in een specifiek vliegweefsel uit te drukken, kruist u drie tot vijf maagdelijke vrouwtjes uit de Gal4-lijn met drie tot vijf mannetjes uit elk van de UAS-menselijke cDNA-transgene lijnen in enkele flesjes of in duplicaten. Breng de kruisen om de twee tot drie dagen over om zoveel mogelijk dieren van één kruis te verkrijgen en onderzoek het afgeschermde dier onder een dissectiemicroscoop om eventuele verschillen tussen de referentie- en variantstammen te identificeren.Als er een zichtbaar defect is, beeldt u de vliegen toe om de fenotypen te documenteren. Om vliegen te genereren om te testen op functionele defecten in het visuele systeem, kruisen maagdelijke vrouwtjes van de rhodopsine 1 Gal4 lijn aan mannen met referentie of variant UAS menselijke cDNA transgenes om de menselijke eiwitten van belang in de fotoreceptoren R1 tot R6 in de vlieg retina uit te drukken. Zodra de vliegen beginnen te eclose, verzamel het nageslacht in verse flesjes en breng de flesjes terug naar een incubator ingesteld op de juiste experimentele temperatuur voor een extra drie dagen om het visuele systeem te rijpen.Aan het einde van de incubatie, immobiliseren van de vliegen met een passende anesthesie methode en zachtjes lijm een kant van elke vlieg op een glazen microscoop dia. Na het opzetten van een elektroretinogram rig, plaats een 1,2 millimeter glazen capillair in een naald trekker en breek de capillaire buis om twee scherpe holle taps toelopende elektroden met minder dan 0,5 millimeter diameters te verkrijgen. Vul de haarvaten met 100 millimolar zoutoplossing die ervoor zorgt dat luchtbellen worden vermeden en schuif de glazen haarvaten over de zilveren draadelektroden.Klem de haarvaten op zijn plaats en acclimatiseren de vliegen om de duisternis te voltooien gedurende ten minste 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats aan het einde van de gewenning de dia met de vliegen op het opnameapparaat en beweeg de micromanipulatoren die de referentie- en opnameelektroden dragen dicht bij de vlieg van belang. Let op het puntje van de elektrode, plaats voorzichtig de referentieelektrode in de thorax van de vlieg die de cuticula penetreren en plaats de opnameelektrode op het oppervlak van het oog.Voor succesvolle elektroretinogram opnames, zorg ervoor dat een passende hoeveelheid druk op de opname-elektrode toe te passen, zodat het een klein kuiltje veroorzaakt zonder het oog te penetreren. Wanneer de elektroden zijn geplaatst, schakelt u het primaire licht gedurende drie minuten uit om de vliegen opnieuw te laten wennen aan de donkere omgeving. Open en sluit aan het einde van de re-acclimatisatieperiode de sluiter eenmaal per seconde gedurende 20 seconden en opname de elektroretinogrammen van ten minste 15 vliegen per dia per genotype per aandoening met dezelfde elektroden.Wanneer de opnames van de referentie- en variantvliegen zijn voltooid, vergelijkt u de elektroretinogramopnamen van de referentie, de variant en de besturingselementen om te beoordelen op verschillen. Evalueer vervolgens de elektroretinogramgegevens op veranderingen in op transiënten, depolarisatie, off transients en repolarisatie. In dit representatieve experiment werden op overexpression gebaseerde studies uitgevoerd voor TBX2 omdat de menselijke referentie TBX2 niet in staat was om het orthologeuze vlieggen functioneel te vervangen, waardoor reddingsstrategieën onmogelijk werden.Wanneer referentie menselijke TBX2 werd overuitgedrukt in het ontwikkelende oog en delen van de hersenen met behulp van oogloze Gal4, de overexpressie resulteert in een ongeveer 85%letaliteit en een aanzienlijke vermindering van de ooggrootte. In tegenstelling, de variant transgene is minder krachtig in het veroorzaken van letaliteit en induceert een klein oog fenotype met behulp van dezelfde driver onder identieke experimentele omstandigheden wat suggereert dat de variant van invloed op de eiwitfunctie. Bovendien, wanneer een referentie menselijke TBX2 is overexpressed in de fotoreceptoren met behulp van rhodopsine Gal4, de overexpressie veroorzaakt een significante verandering in het elektroretinogram spoor.Dit fenotype is milder wanneer de variant eiwit wordt uitgedrukt het verstrekken van verder bewijs dat de variant van belang van invloed op de eiwitfunctie in vivo. Het is belangrijk op te merken dat elk gen uniek is, dus er is geen enkel experiment dat de impact van alle ziekte geassocieerde varianten kan beoordelen. Naast het werken met menselijke cDNAs, kan men ook bepalen of de variant functionele gevolgen heeft door analoge varianten in evolutionair geconserveerde residuen van het orthologous vlieggen te introduceren.Met behulp van deze methode hebben we bijgedragen aan een aantal studies naar gendetectie bij menselijke ziekten in samenwerking met het Undiagnosed Disease Network en andere groepen.

in-vivo-functional-study-disease-associated-rare-human-variants-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Dit protocol gaat in op de live-dissectie van...

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

We beschrijven hier de procedures voor de extractie en zuivering van mRNA en metabolieten...

Zuivering van Afschriften en metabolieten van<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoofden

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een protocol voor het efficiënt benaderen en analyseren van veel menselijke en model-organisme databases. Dit protocol demonstreert het gebruik van MARRVEL om kandidaatziekteveroorzakende varianten te analyseren die zijn geïdentificeerd uit de volgende generatie sequentieinspanningen.

Navigeren MARRVEL, een web-based tool die Human Genomics en model organisme genetica informatie integreert

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Het Drosophila-oogsysteem is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van verschillende biologische processen, met name menselijke neurodegeneratieve ziekten. Handmatige kwantificering van fenotypes van ruwe ogen kan echter vertekend en onbetrouwbaar zijn. Hier beschrijven we een methode waarmee ilastik en Flynotyper worden gebruikt om het oogfenotype op een onbevooroordeelde manier te kwantificeren.

Kwantificeren van Drosophila melanogaster oogfenotypes: een computationele benadering die ilastik en Flynotyper integreert

Dit protocol beschrijft hoe de expressie van een groot scala van genen op het klonale niveau te beoordelen. Single-cell RT-qPCR levert zeer betrouwbare resultaten met een sterke gevoeligheid voor honderden monsters en genen.

Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

Leer functionele analyse van zeldzame missense-varianten in menselijke genen met behulp van Drosophila melanogaster. Deze kosteneffectieve in vivo-methode versnelt de diagnose van zeldzame ziekten en biedt inzicht in ziekte mechanismen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Meer video's verkennen