In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Dit protocol stelt ons in staat om te bepalen of missense varianten in menselijke genen die gekoppeld zijn aan ziekten de eiwitfunctie beïnvloeden. Dit is moeilijk te bereiken computationeel, zelfs met state-of-the-art algoritmen. Deze techniek maakt een snelle analyse van missense varianten in menselijke eiwitten met behulp van een in vivo systeem Drosophila melanogaster die sneller en kostenefficiënter is dan gewervelde modelorganismen.

Aantonen dat een specifieke variant de eiwitfunctie beïnvloedt, draagt direct bij aan de diagnose van zeldzame ziekten en dient als uitgangspunt voor de analyse van het ziektemechanisme en mogelijke therapieën. Dit protocol is vooral handig bij het bestuderen van varianten in verband met zeldzame ziekten, maar het kan worden toegepast op meer voorkomende ziekten zoals autisme en kanker. Het identificeren van reproduceerbare fenotypes bij vliegen die de eiwitfunctie weerspiegelen, kan een uitdaging zijn.

De fenotypes kunnen variëren van gen tot gen en kunnen subtiel zijn. Functionele studies van varianten in menselijke eiwitten met behulp van Drosophila kunnen worden uitgevoerd op basis van reddingsexperimenten of overexpressiestudies. Verzamel voor aanvang van de procedure informatie over het menselijke gen van belang en de modelorganisme orthologs.

Om variant functie te testen door overexpressing referentie en variant menselijke eiwitten in de vlieg visuele systeem, genereren transgene vliegen die referentie of variant menselijke cDNAs van belang onder de controle van de Gal4 upstream activeren sequentie of UAS-systeem uit te drukken. Om een specifieke Gal4-lijn te selecteren om de menselijke eiwitten in een specifiek vliegweefsel uit te drukken, kruist u drie tot vijf maagdelijke vrouwtjes uit de Gal4-lijn met drie tot vijf mannetjes uit elk van de UAS-menselijke cDNA-transgene lijnen in enkele flesjes of in duplicaten. Breng de kruisen om de twee tot drie dagen over om zoveel mogelijk dieren van één kruis te verkrijgen en onderzoek het afgeschermde dier onder een dissectiemicroscoop om eventuele verschillen tussen de referentie- en variantstammen te identificeren.

Als er een zichtbaar defect is, beeldt u de vliegen toe om de fenotypen te documenteren. Om vliegen te genereren om te testen op functionele defecten in het visuele systeem, kruisen maagdelijke vrouwtjes van de rhodopsine 1 Gal4 lijn aan mannen met referentie of variant UAS menselijke cDNA transgenes om de menselijke eiwitten van belang in de fotoreceptoren R1 tot R6 in de vlieg retina uit te drukken. Zodra de vliegen beginnen te eclose, verzamel het nageslacht in verse flesjes en breng de flesjes terug naar een incubator ingesteld op de juiste experimentele temperatuur voor een extra drie dagen om het visuele systeem te rijpen.

Aan het einde van de incubatie, immobiliseren van de vliegen met een passende anesthesie methode en zachtjes lijm een kant van elke vlieg op een glazen microscoop dia. Na het opzetten van een elektroretinogram rig, plaats een 1,2 millimeter glazen capillair in een naald trekker en breek de capillaire buis om twee scherpe holle taps toelopende elektroden met minder dan 0,5 millimeter diameters te verkrijgen. Vul de haarvaten met 100 millimolar zoutoplossing die ervoor zorgt dat luchtbellen worden vermeden en schuif de glazen haarvaten over de zilveren draadelektroden.

Klem de haarvaten op zijn plaats en acclimatiseren de vliegen om de duisternis te voltooien gedurende ten minste 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats aan het einde van de gewenning de dia met de vliegen op het opnameapparaat en beweeg de micromanipulatoren die de referentie- en opnameelektroden dragen dicht bij de vlieg van belang. Let op het puntje van de elektrode, plaats voorzichtig de referentieelektrode in de thorax van de vlieg die de cuticula penetreren en plaats de opnameelektrode op het oppervlak van het oog.

Voor succesvolle elektroretinogram opnames, zorg ervoor dat een passende hoeveelheid druk op de opname-elektrode toe te passen, zodat het een klein kuiltje veroorzaakt zonder het oog te penetreren. Wanneer de elektroden zijn geplaatst, schakelt u het primaire licht gedurende drie minuten uit om de vliegen opnieuw te laten wennen aan de donkere omgeving. Open en sluit aan het einde van de re-acclimatisatieperiode de sluiter eenmaal per seconde gedurende 20 seconden en opname de elektroretinogrammen van ten minste 15 vliegen per dia per genotype per aandoening met dezelfde elektroden.

Wanneer de opnames van de referentie- en variantvliegen zijn voltooid, vergelijkt u de elektroretinogramopnamen van de referentie, de variant en de besturingselementen om te beoordelen op verschillen. Evalueer vervolgens de elektroretinogramgegevens op veranderingen in op transiënten, depolarisatie, off transients en repolarisatie. In dit representatieve experiment werden op overexpression gebaseerde studies uitgevoerd voor TBX2 omdat de menselijke referentie TBX2 niet in staat was om het orthologeuze vlieggen functioneel te vervangen, waardoor reddingsstrategieën onmogelijk werden.

Wanneer referentie menselijke TBX2 werd overuitgedrukt in het ontwikkelende oog en delen van de hersenen met behulp van oogloze Gal4, de overexpressie resulteert in een ongeveer 85%letaliteit en een aanzienlijke vermindering van de ooggrootte. In tegenstelling, de variant transgene is minder krachtig in het veroorzaken van letaliteit en induceert een klein oog fenotype met behulp van dezelfde driver onder identieke experimentele omstandigheden wat suggereert dat de variant van invloed op de eiwitfunctie. Bovendien, wanneer een referentie menselijke TBX2 is overexpressed in de fotoreceptoren met behulp van rhodopsine Gal4, de overexpressie veroorzaakt een significante verandering in het elektroretinogram spoor.

Dit fenotype is milder wanneer de variant eiwit wordt uitgedrukt het verstrekken van verder bewijs dat de variant van belang van invloed op de eiwitfunctie in vivo. Het is belangrijk op te merken dat elk gen uniek is, dus er is geen enkel experiment dat de impact van alle ziekte geassocieerde varianten kan beoordelen. Naast het werken met menselijke cDNAs, kan men ook bepalen of de variant functionele gevolgen heeft door analoge varianten in evolutionair geconserveerde residuen van het orthologous vlieggen te introduceren.

Met behulp van deze methode hebben we bijgedragen aan een aantal studies naar gendetectie bij menselijke ziekten in samenwerking met het Undiagnosed Disease Network en andere groepen.